Dispositivo di stretching equibiassiale per microscopia a fluorescenza confocale a cellule vive ad alto ingrandimento

Sommario

Qui presentiamo un versatile dispositivo di allungamento equibiassiale ad azionamento pneumatico e compatibile con la microscopia ad alta risoluzione.

Abstract

Le cellule sono continuamente esposte a forze meccaniche in situazioni fisiologiche e patologiche, tra cui una varietà di sollecitazioni di trazione e compressione. C'è una ricerca molto attiva che esplora come le cellule e i tessuti rispondono e si adattano a tali stress e come queste risposte si integrano con la segnalazione meccanochimica. Ciò ha generato la necessità di strumenti sofisticati compatibili con i protocolli standard di coltura cellulare e i metodi di microscopia, in grado di riprodurre gli stress fisiologici negli studi in vitro. Questo studio presenta la progettazione, la funzione e la caratterizzazione di un dispositivo di stretching compatibile con la microscopia ottica e a fluorescenza ad alta risoluzione. Numerosi dispositivi di stiratura, sia pneumatici che a motore, sono stati sviluppati e utilizzati sul campo. Presentiamo uno di questi sistemi in dettaglio, comprese le linee guida di progettazione, una varietà di applicazioni e tutti gli strumenti per fabbricare una configurazione simile. Il sistema si basa su una membrana deformabile in polidimetilsilossano (PDMS), allungata equibiassialmente durante l'applicazione sotto vuoto, rendendo la deformazione del campione omogenea, riproducibile e controllata. Fornisce una varietà di sollecitazioni di trazione, dall'allungamento puntuale e immediato ai cicli ripetuti di allungamento-rilascio di ampiezza e frequenza controllate. Il rivestimento del substrato con proteine di adesione consente di seminare cellule dotate di reporter fluorescenti nel dispositivo di allungamento e di eseguire l'imaging dal vivo di queste cellule dopo l'allungamento utilizzando microscopi a fluorescenza ad alto ingrandimento. Le sollecitazioni di compressione possono essere applicate anche lasciando che il campione si adatti all'allungamento e successivamente rilasciandolo o seminando il campione su un substrato pre-stirato prima del rilascio dell'allungamento. L'ulteriore modellazione topografica del substrato PDMS consente l'imaging dello stesso campione in diverse modalità di microscopia (come la fluorescenza e la microscopia elettronica). I gel di poliacrilammide possono anche essere attaccati alla membrana PDMS, con conseguente allungamento delle cellule seminate su substrati di diversa rigidità. Nel complesso, applicando sollecitazioni di trazione controllate su campioni vivi, questo dispositivo di allungamento, abbinato alla microscopia a fluorescenza di alta qualità, può rispondere a un'ampia varietà di domande in meccanobiologia.

Introduzione

Le membrane sottili deformabili in polidimetilsilossano (PDMS) sono ampiamente utilizzate in una varietà di dispositivi di allungamento su misura ^1,2,3, poiché il PDMS è un materiale inerte biocompatibile ben consolidato compatibile con l'imaging al microscopio. Qui, come molti altri 4,5,6,7,8,9, il semplice concetto di applicare un vuoto viene utilizzato per deformare la membrana per assemblare un dispositivo di allungamento equibiassiale robusto e controllabile. Bloccando la membrana all'interno di un anello circolare e sigillando l'anello sulla parte superiore di un "perno di allungamento" (Figura 1A-C), si ottiene una deformazione uniforme e isotropa. Il campione biologico si trova al centro dell'anello sulla membrana PDMS indipendente, che consente l'imaging utilizzando la microscopia a fluorescenza. Qui vengono presentate due configurazioni personalizzate, compatibili con due modelli di tavolino per microscopio (Figura 1D-F) e altamente versatili in termini di applicazioni biologiche. Sebbene il design complessivo sia semplice e trasponibile ad altre fasi, le dimensioni della configurazione devono essere scelte con cura per soddisfare i requisiti di imaging. Una volta raggiunto, il profilo di deformazione del dispositivo deve essere caratterizzato e convalidato.

Oltre alla configurazione stessa, viene presentato un metodo semplice accompagnato da un codice Matlab per caratterizzare l'ampiezza, l'omogeneità e l'isotropia della deformazione. Il dispositivo di allungamento può essere successivamente utilizzato per applicare sollecitazioni di trazione equibiassiali a sistemi sintetici¹⁰, singole cellule^11,12 o monostrati¹³, registrando con un'elevata risoluzione spazio-temporale la risposta biologica del campione utilizzando la microscopia a fluorescenza. La membrana può essere rivestita con diverse proteine di adesione della matrice extracellulare^14,15. Funzionalità extra possono essere aggiunte in base alle esigenze dello studio biologico. Ad esempio, i gel di poliacrilammide possono essere incollati alla membrana PDMS per regolare la rigidità del substrato durante l'allungamento^{di 13,16} e le membrane PDMS possono essere fabbricate con una griglia numerata di riferimento per l'imaging posteriore della stessa regione di interesse all'interno di un campione¹². I campioni allungati fissi possono anche essere processati mediante immunocolorazione e successivamente riallungati per l'imaging a fluorescenza¹⁷. Il modello di allungamento applicato può essere controllato, variando da un singolo impulso di allungamento immediato a una deformazione ciclica di varie grandezze, frequenze o forme^14,16.

Protocollo

1. Progettazione del palco e del palo di allungamento (Figura 1)

1. Progettare un palo di allungamento compatibile nelle dimensioni con le dimensioni/supporti del palco e la configurazione dell'obiettivo. I due specifici perni di allungamento sono visualizzati nella Figura 1A, D.
   NOTA: I file FreeCAD forniti in questo protocollo (Cartella supplementare 1) sono compatibili con i seguenti microscopi e tavolini Nikon: Eclipse Ni-E verticale dotato di uno stadio NI-SH-E e Eclipse Ti-E/B invertito dotato di uno stadio TI-S-ER, Figura 1D. Il perno può essere stampato tridimensionalmente (3D) ma può deformarsi dopo un uso ripetuto; I pali a base di alluminio non soffriranno di questo inconveniente. Assicurati di anodizzare i perni a base di alluminio per prevenire l'ossidazione. La configurazione verticale consente una maggiore ampiezza di movimento. Inoltre, una configurazione verticale fornisce l'imaging diretto del campione senza interfaccia, che è otticamente favorevole nel caso del substrato deformabile della membrana PDMS. Invece, in una configurazione invertita, il fascio di illuminazione passa attraverso la membrana PDMS (Figura 1F); poiché al momento dell'applicazione dell'allungamento, la membrana PDMS si muoverà, il mezzo di immersione per l'obiettivo deve essere scelto con cura (tipi di immersione consigliati in acqua, aria o glicerolo; l'immersione in olio non è consigliata a causa dell'incompatibilità con i substrati PDMS). I supporti commerciali possono essere modificati utilizzando fori per viti aggiuntivi; fare attenzione all'uso di viti in plastica o a base di teflon per evitare polvere durante l'avvitamento. Può essere conveniente progettare un supporto che consenta di montare il perno di allungamento sulla parte superiore del tavolino, come mostrato nella Figura 1E. Il file FreeCAD fornito in questo protocollo è compatibile con il tavolino di un microscopio verticale Eclipse Ni-E.
2. Progettare anelli elastici (Figura 1C) di dimensioni compatibili con il perno elastico (Figura 1A, B). I file FreeCAD forniti in questo protocollo sono compatibili con i perni corrispondenti (per coprire gli anelli durante la manipolazione dei campioni, il loro diametro può essere scelto in modo che sia compatibile con le dimensioni di una capsula di Petri).
   NOTA: L'anello può anche essere a base di alluminio (anodizzato) o stampato in 3D. Includere guarnizioni di diametro adeguato per sigillare sottovuoto il perno di stiratura e gli anelli.
3. Opzionale: Fabbricare un controller del vuoto. Una mappa elettrica della scatola di controllo del vuoto utilizzata in questo protocollo è fornita nelle informazioni supplementari (vedere la cartella supplementare 2). Permette il controllo manuale del livello di vuoto applicato al dispositivo di stiratura.
   NOTA: Anche i controllori di vuoto commerciali possono fornire funzioni simili e di solito possono essere accompagnati da un software di controllo che consente l'applicazione di una varietà di tipi di segnale (sinusoidale, triangolare, ecc.) (Fluigent, Cobalto).

2. Fabbricazione della membrana estensibile

1. Progettare piastre circolari (materiale consigliato: polimetacrilato, PMMA). Assicurarsi che queste piastre siano più larghe degli anelli e di dimensioni compatibili con la centrifuga (Figura 2A). Vedere la Tabella 1 per le dimensioni suggerite e la cartella supplementare 3.
   NOTA: Per il palo 1 è stato utilizzato un diametro di 12 cm; per il palo 2, un diametro di 18-21 cm. Prima e tra un utilizzo e l'altro, le piastre devono essere pulite accuratamente utilizzando salviette in tessuto non tessuto ed etanolo al 96%. È importante evitare l'accumulo di PDMS nelle piastre, così come sui bordi e sotto.
2. Preparare il PDMS 1:10 e mescolare bene fino ad ottenere un'emulsione molto omogenea (utilizzare i cucchiai per mescolare consigliati).
   NOTA: Per 12 cm, preparare 4,5 g per piatto; per piatti da 18 cm, 8 g per piatto. Per la preparazione di più piastre, preparare un PDMS aggiuntivo, ad esempio 10 mL in più del necessario per 10 piastre. Per 10 piatti da 12 cm, preparare 50 g di componente A e 5 g di componente B. È utile utilizzare recipienti di grandi dimensioni per pipettare facilmente. Il recipiente non deve contenere polvere o altro sporco che potrebbe ostacolare la corretta centrifuga e polimerizzazione del PDMS. Utilizzare guanti di materiale compatibile (evitare il lattice; i guanti in vinile sono appropriati) per garantire l'indurimento PDMS.
3. Degasare per un minimo di 1 ora utilizzando una camera a vuoto.
   NOTA: In alternativa, il PDMS può essere centrifugato a 0,2 × g per 5 minuti utilizzando una provetta da 50 mL, ma attenzione che è complicato aspirare la miscela PDMS da una provetta con la siringa di dispensazione (necessaria per il passaggio 2.4). Non degasare troppo a lungo (non più di 2 ore) con luce diretta per evitare la prepolimerizzazione del PDMS.
4. Rivestimento di rotazione PDMS sulla parte superiore delle piastre in PMMA
   1. Erogare 4,2 mL o 7,5 mL di PDMS degassato sopra le piastre in PMMA.
   2. Rivestire le piastre utilizzando le seguenti impostazioni consigliate:
      1. Spin coat per 5 s a 500 giri/min con un'accelerazione di 100 giri/min.
      2. Centrifugare per 1 min a 500 giri/min con un'accelerazione di 300 giri/min.
         NOTA: Può essere conveniente segnare il centro della piastra in PMMA sul lato inferiore per garantire il centraggio delle piastre durante la centrifuga e la filatura omogenea. Il passaggio 2.4.2.1 non è obbligatorio, soprattutto se il parametro di accelerazione non può essere regolato; aiuta a diffondere il PDMS prima della filatura. Questo protocollo produce membrane PDMS con uno spessore di circa 140 μm (misurato con l'interferometria; vedere la Figura 1 supplementare e la Tabella 2). Le calibrazioni devono essere eseguite prima degli esperimenti nel caso in cui il modello o i parametri dello spin coater portino a caratteristiche diverse della membrana.
5. Conservare ogni piastra in una capsula di Petri per evitare l'accumulo di polvere e polimerizzare durante la notte a 65 °C all'interno del forno.
   NOTA: Fare attenzione all'uso di stoviglie resistenti alla temperatura. La condizione di polimerizzazione influenzerà la deformabilità PDMS per un dato livello di vuoto applicato.

3. Sandwich di membrane in anelli

1. Progettazione del materiale di montaggio.
   1. Progettare anelli in PMMA di diametro interno/esterno per posare la membrana circolare PDMS rivestita in centrifuga (Figura 2A). Vedere le dimensioni proposte nella Tabella 1 e nella Cartella supplementare 3.
   2. Progettare un supporto di montaggio (Figura 2B) su cui si adatterà l'anello e l'altezza determinerà anche il prestiro durante il montaggio della membrana nell'anello.
      NOTA: Il supporto di montaggio può essere una soluzione semplice basata su materiale da laboratorio esistente (ad esempio, una capsula di Petri). Una soluzione più elegante è quella di stampare in 3D il supporto (vedere il file FreeCAD di questa parte fornita in questo protocollo, vedere la cartella supplementare 3), poiché l'altezza può essere definita dall'utente e facilmente variata (in questo protocollo è stata utilizzata un'altezza di 10 mm per i piccoli anelli). L'altezza della parte centrale del supporto deve essere scelta più piccola dell'altezza del semianello in modo che il substrato PDMS non tocchi il supporto durante il montaggio (vedere l'ulteriore utilizzo al punto 3.4.2). A questo scopo è adatta una stampante 3D che utilizza filamenti di acido polilattico (PLA) (vedi Tabella dei materiali). È inoltre possibile progettare un anello tagliente, anch'esso stampato in 3D, che funga da guida per il bisturi (Figura 2A).
   3. Progettare e fabbricare pesi in ottone di dimensioni compatibili per esercitare il peso sull'anello durante il montaggio della membrana (Figura 2C) e portare a un pretensionamento riproducibile.
      NOTA: I file FreeCAD forniti qui (vedere la cartella supplementare 3) corrispondono alle dimensioni dell'anello presentate in questo protocollo.
2. Rimuovere la membrana PDMS dalla piastra in PMMA.
   1. Preparare gli anelli in PMMA sopra un foglio di carta da banco bianco.
      NOTA: È importante che il banco e la carta rimangano piatti per evitare che la carta tocchi la membrana PDMS durante il montaggio.
   2. Girare con cautela intorno al bordo della piastra con una lama (una o due volte) e poi tracciare lo stesso bordo con una pinzetta affilata per assicurarsi che il PDMS abbia un taglio netto lungo tutta la sua circonferenza (Figura 2A).
   3. Usa le pinzette per sollevare con cautela la membrana su un bordo. Quindi, staccare delicatamente il bordo del foglio PDMS con i pollici per sollevare la membrana in modo uniforme sul bordo. Staccare il bordo della membrana dalla piastra lungo metà della circonferenza della piastra (Figura 2A).
      NOTA: Versare alcune gocce di etanolo al 96% sotto la membrana PDMS aiuterà a sollevare la membrana senza romperla.
3. Asciugare la membrana PDMS.
   1. Strofinare l'etanolo al 96% su tutta la superficie superiore dell'anello in PMMA precedentemente preparato (passaggio 3.2.1), utilizzando le dita per distribuirlo uniformemente.
   2. Rimuovere con cautela la membrana PDMS, sollevandola dal bordo precedentemente sollevato (spiegato al punto 3.2.3), e posizionarla simmetricamente sull'anello in PMMA ricoperto di etanolo. Rimuovere eventuali rughe dal PDMS, ma assicurarsi di non allungare la membrana; solo raddrizzarlo.
      NOTA: L'applicazione del prestiro in questa fase influirà sulla deformabilità PDMS per un dato livello di vuoto applicato.
   3. Una volta che l'etanolo è completamente essiccato, assicurarsi che la membrana PDMS sia saldamente attaccata all'anello in PMMA.
4. Assemblare l'anello elastico.
   1. Prendi un altro anello di PMMA vuoto. Posizionarlo sopra l'anello di montaggio e utilizzare clip metalliche per sigillarli insieme, inserendo la membrana PDMS tra i due anelli (sandwich di membrana PDMS, Figura 2B).
   2. Posizionare la metà inferiore dell'anello elastico sul supporto di montaggio progettato al punto 3.1.2 (Figura 2B).
   3. Posizionare il sandwich dell'anello PDMS sull'anello elastico e spingerlo con decisione verso il basso fino a quando non arriva fino in fondo. Il substrato PDMS non tocca il supporto di montaggio. Fissare la guarnizione nella posizione corretta (Figura 2B).
   4. Posizionare i pesi circolari in ottone sopra il campione (Figura 2C). Questo applica un pretensionamento fisso simile a quello di tutti gli anelli montati, garantendo un'ulteriore riproducibilità durante la calibrazione del sistema.
   5. Posizionare la metà superiore dell'anello elastico in metallo sulla parte superiore, con i fori delle viti allineati, posizionare tutte le viti e serrare (Figura 2C).
      NOTA: In questa fase, la membrana PDMS presenta dei fori, quindi non tentare di smontare o tornare indietro nel protocollo.
   6. Tagliare delicatamente il PDMS attorno all'anello con una lama (Figura 2C).
   7. Coprire (ad esempio, con una piastra di Petri) per proteggere la membrana dalla polvere (Figura 2C).
      NOTA: Se il PDMS deve essere funzionalizzato con un gel di poliacrilammide, procedere alla sezione 5. Per le misurazioni iniziali della taratura, passare alla sezione 6. Se l'anello PDMS deve essere utilizzato per la semina cellulare, procedere alla sezione 7.

4. Variazione della fabbricazione della membrana PDMS: pattern a griglia di riferimento

1. Preparare una piastra in PMMA (prima dello spin-coating PDMS) "modellata" con una griglia a base di SU8 creata utilizzando la fotolitografia (Figura 2D). Per questo, progetta un modello di interesse per creare una pellicola per fotomaschera (maschera in acetato).
   NOTA: Il file pdf fornito in questo protocollo (vedi Cartella Supplementare 4) crea una griglia con numeri alternati; vedere la Figura 2D. La griglia può essere creata utilizzando semplici software come Inkscape data la dimensione del pattern (o alternative come Clewin o FreeCAD). Il disegno può essere stampato da ditte esterne su pellicole fotografiche (vedi Tabella dei Materiali).
2. Protocollo di fotolitografia sulla lastra di PMMA (vedere la cartella supplementare 3 per le proprietà ottiche del PMMA).
   1. Eseguire un trattamento al plasma di ossigeno delle piastre in PMMA per 20 minuti a 7 W con un flusso di ossigeno costante di 0,8 bar.
      NOTA: Assicurarsi che l'eventuale protezione in plastica delle piastre sia rimossa e che le piastre in PMMA siano completamente trasparenti.
   2. Infornare per 5 minuti a 95 °C.
   3. Raffreddare la piastra in PMMA utilizzando una pistola ad azoto, quindi posizionare 4 ml di resina SU-8 2100 sulla piastra in PMMA da 12 cm (regolare il volume se si utilizzano piastre di dimensioni diverse).
   4. Centrifuga con i seguenti parametri (o regola i parametri di rotazione per creare uno strato alto circa 10 μm): 5 s a 500 giri/min con un'accelerazione di 100 giri/min/s seguiti da 30 s a 4000 giri/min con un'accelerazione di 300 giri/min/s.
   5. Infornare per 2,5 min a 95 °C.
   6. Posizionare la piastra in PMMA su un allineatore per maschere in presenza della mascherina in acetato e utilizzare i seguenti parametri: senza i-line. Esposizione a banda larga (tra 260 e 460 nm), 25 mW/cm², esposizione di 7,5 s.
   7. Infornare per 3,5 min a 95 °C.
   8. Sviluppare il modello per 1 minuto con acetato di glicole propilenico monometil etere.
   9. Lavare abbondantemente con isopropanolo.
   10. Eseguire la verifica visiva della qualità del modello utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (2-10x) in un microscopio a campo chiaro.
       NOTA: La silanizzazione della piastra modellata in PMMA aumenta la longevità del modello per un uso ripetuto. A tal fine, attivare la piastra in PMMA modellata per 30 s con trattamento al plasma all'ossigeno e quindi eseguire un trattamento di 1 ora con tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano sotto vuoto in una cappa chimica.
3. Utilizzare la piastra in PMMA modellata come nei passaggi da 2.2 a 2.5 per rivestire la membrana estensibile PDMS.
   NOTA: Il PDMS modellato può essere visualizzato in un microscopio a campo chiaro, come accennato in precedenza, nonché in un microscopio elettronico a scansione (Figura 2D). Fare attenzione a quale lato del modello è rivolto verso l'alto durante il montaggio della membrana PDMS nell'anello di allungamento per ottenere il modello nell'orientamento desiderato.

5. Applicare un gel di poliacrilammide (PAA) sopra la membrana PDMS

NOTA: Questo passaggio può essere eseguito sia sulla membrana PDMS fissata alla piastra in PMMA (vedere la sezione 2) sia sugli anelli di trazione precedentemente montati (vedere la sezione 3). Lavorare sotto una cappa chimica; per le fasi che prevedono il riscaldamento, è conveniente utilizzare un piccolo raccordo da forno sotto la cappa chimica, vedi Tabella dei materiali; in caso contrario, conservare i campioni in una scatola ermetica in forno).

1. Pre-rivestimento della membrana PDMS (Figura 2E)
   1. Preparare la soluzione di rivestimento mescolando etanolo al 96% con il 10% (3-amminopropil)trietossisilano (APTES) in una provetta per microcentrifuga (ad esempio, 20 μl di APTES in 180 μl di etanolo).
   2. Attivare le membrane PDMS con uno scaricatore di plasma corona per 1 minuto (o attivare per 30 s utilizzando un pulitore al plasma di ossigeno).
   3. Posizionare 200 μl della soluzione APTES/etanolo al centro della membrana.
   4. Lasciare la membrana a 65 °C all'interno del forno per 1 ora.
   5. Lavare due volte con PBS. Per il secondo lavaggio, lasciare il PBS per 10 minuti agitando.
   6. Preparare la soluzione di glutaraldeide (GA) al 3% in PBS. Posizionare 200 μl di GA per membrana sulla stessa regione della membrana trattata con APTES.
   7. Attendere 25 minuti (non più di 30 minuti).
   8. Lavare due volte con PBS, la seconda volta agitando.
   9. Aspirare il liquido e posizionare l'anello in posizione abbassata, fino a quando il PBS non è completamente asciutto.
2. Silanizzazione del vetrino coprioggetto
   1. Preparare 6 mL di Repel Silane e versarlo in una capsula di Petri.
   2. Posizionare con cura i vetrini coprioggetti quadrati da 18 mm, uno per uno, nel liquido.
   3. Incubare i vetrini coprioggetti per 5 minuti.
   4. Preparare due bicchieri; uno contenente il 96% di etanolo e l'altro acqua ultrapura.
   5. Rimuovere il vetrino coprioggetti dal Repel Silane con una pinzetta e lavare prima in etanolo al 96%, seguito da un lavaggio in acqua ultrapura (il vetrino coprioggetti deve uscire "asciutto" dal lavaggio con acqua).
   6. Lasciare asciugare per altri 30 minuti sul bordo di una capsula di Petri.
3. Attacco in gel di poliacrilammide (PAA) alla membrana PDMS
   1. Disporre metà dei vetrini coprioggetti trattati con Repel Silane sul fondo di una capsula di Petri.
   2. Preparare una miscela di gel PAA della rigidità desiderata^16,18.
   3. Mettere una goccia di 10 μL di miscela di gel sopra ogni vetrino coprioggetti.
   4. Posizionare un altro vetrino coprioggetti trattato con Repel Silane sopra per stendere il gel. Non allineare i due vetrini. Assicurati che siano disposti a forma di stella per facilitare la separazione. Premere delicatamente in modo che il gel sia appiattito ma non superi l'area del vetrino coprioggetti.
   5. Attendere da 45 minuti a 1 ora.
   6. Separare delicatamente i vetrini coprioggetti con una pinzetta. Assicurarsi che il gel rimanga attaccato a uno dei vetrini.
   7. Prendere il vetrino coprioggetti a cui è attaccato il gel e posizionare il gel a contatto con l'area PDMS precedentemente trattata con GA (Figura 2E).
   8. Premere con due dita dal basso e dall'alto per 5 s.
   9. Incubare a 37 °C per una notte.
   10. Il giorno successivo, riempire l'anello con PBS per 30 minuti.
   11. Staccare delicatamente il vetrino coprioggetti superiore con una pinzetta.
   12. Disegna il perimetro del gel PAA con un pennarello indelebile dall'altro lato della membrana PDMS. Ciò consente di individuare l'esempio nei passaggi seguenti.
   13. Aspirare il PBS.
   14. Eseguire una fase di funzionalizzazione per facilitare l'adesione della proteina della matrice extracellulare desiderata al gel¹⁵.

6. Funzionamento del dispositivo di allungamento, calibrazione della deformazione e valutazione della risoluzione

1. Preparare un anello elastico PDMS con perline fluorescenti per la calibrazione della deformazione.
   1. Preparare una diluizione 1:50000 di 0,1 μm o 0,2 μm di perle fluorescenti (vedere la tabella dei materiali) in soluzione salina tampone fosfato (PBS) mediante diluizione seriale (soluzione intermedia 1:500 di 1 mL in PBS con 2 μL della soluzione madre delle perle seguita da una diluizione finale di 10 μL dalla soluzione intermedia in 1 mL di PBS).
      NOTA: Un'elevata densità di perle sulla membrana è ottimale per la fase di calibrazione; Non sonicare la soluzione, poiché i grumi di perline aiutano l'operazione durante la calibrazione.
   2. Posizionare una goccia da 10-30 μl al centro del PDMS.
      NOTA: Il supporto di montaggio può essere convenientemente progettato con una deposizione del campione trasversale al centro
   3. Lasciare asciugare a una temperatura non superiore a 40 °C per evitare problemi di confusione post-polimerizzazione.
2. Preparare un anello elastico PDMS con perline fluorescenti per la valutazione della risoluzione.
   1. Seguire il protocollo di Cole e ^al.19 per preparare la soluzione del microschino utilizzando perline con diametri inferiori al limite di diffrazione, tipicamente perle di diametro 0,1 μm.
      (vedi Tabella dei materiali). Sonicare attentamente le soluzioni di perline ad ogni passaggio intermedio.
   2. Utilizzare il trattamento corona al centro dell'anello per attivare il substrato PDMS.
   3. Stendere immediatamente 20 μl della soluzione di microsfere sopra l'area centrale del PDMS trattata e lasciarla asciugare.
      NOTA: In questo caso, la soluzione di perle viene altamente diluita e incubata sul PDMS idrofilo per garantire un'ampia diffusione e ottenere singole perle separate da 0,1 μm adsorbite sul substrato.
3. Montaggio del dispositivo di allungamento sul supporto del tavolino del microscopio (Figura 1F).
   1. Montare il perno di allungamento nel microscopio.
   2. Applicare generosamente lubrificante (vaselina) sopra l'area circolare del perno (parte centrale, Figura 1D, F).
      NOTA: L'uso del lubrificante è obbligatorio per il substrato PDMS per superare gli attriti e scivolare sul perno, ed è necessario rinfrescare il lubrificante tra un campione e l'altro. La vaselina viene utilizzata come lubrificante molto conveniente nella configurazione presentata in questo protocollo.
   3. Montare l'anello elastico preparato al punto 6.1 nel perno elastico e avvitare il tappo superiore per sigillare il gruppo.
   4. Collegare il regolatore del vuoto alla fonte di vuoto e al perno di allungamento (Figura 3A).
      1. Collegare la parte posteriore della scatola di controllo del vuoto alla fonte di vuoto (Figura 3A).
      2. Collegare la parte anteriore della scatola al perno elastico (Figura 1B, D, F).
         NOTA: La fonte del vuoto può essere la linea del vuoto disponibile nell'infrastruttura dell'edificio. Un vuoto moderato è necessario per un allungamento sufficiente, ma dipende dal diametro dell'anello di stiramento (una deformazione minore si otterrà allo stesso livello di vuoto per un diametro inferiore). In alternativa, sono disponibili in commercio pompe per vuoto (Fluigent o Elveflow forniscono pompe per vuoto autonome); In questo caso, seguire le istruzioni del produttore per il collegamento alla fonte di vuoto. Non utilizzare un'alimentazione per vuoto senza una fonte controllata dal vuoto (come la scatola di controllo del vuoto su misura presentata in questo protocollo o i sistemi disponibili in commercio)
4. Taratura della deformazione
   1. Scegliere un campo di interesse che includa un'elevata densità di perline in tutto il campo visivo e grumi di perline riconoscibili per l'utente (vedere la Figura 3B).
   2. Acquisire un'immagine "a riposo" del campo visivo scelto (salvare la posizione).
   3. Applicare l'allungamento a un livello di vuoto basso (in questa configurazione, -20 mbar). Il campione si muoverà in tutte le direzioni (X-Y-Z).
   4. Rimettere a fuoco prima nel piano z.
   5. Sposta il tavolino nelle direzioni x-y per trovare la stessa regione di interesse ripresa a riposo, metti a fuoco l'immagine delle perline nello stato allungato e acquisisci un'immagine.
      NOTA: Se il campione è molto decentrato, la regione di interesse si sposterà in modo significativo, a seconda dell'entità della deformazione. Lo spostamento sarà maggiore lontano dal centro, ma l'entità della deformazione è indipendente dalla posizione del campione sul substrato. Registra immagini senza binning, con una risoluzione di 2048x2048.
   6. Rilascia la tensione. Ripetere i passaggi 6.4.3-6.4.5 con un livello di vuoto più alto (-30 mbar, -40 mbar, ecc.).
      NOTA: Ai fini della calibrazione, tornare sempre allo stato di riposo prima di eseguire nuovamente l'allungamento (vedere la Figura 3A supplementare), poiché il PDMS ha un comportamento di isteresi in caso di deformazione.
   7. Montare un secondo anello elastico e ripetere i passaggi 6.4.1-6.4.6. Eseguire questa calibrazione per almeno 3 diversi anelli elastici.
   8. Archiviare le immagini acquisite in una cartella organizzata per campione.
   9. In ogni cartella, denominare l'immagine del cordone di riferimento acquisita a riposo reference_str1 e le immagini allungate all'aumentare del vuoto stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3, ecc.
      NOTA: Questo passaggio costituisce la calibrazione principale del sistema. A seconda delle esigenze dell'utente, è necessario eseguire una calibrazione aggiuntiva utilizzando campioni di microsfere simili ma utilizzando altri protocolli di applicazione del vuoto. Applicare un protocollo di deformazione simile a quello applicato al campione biologico (vedere la sezione dei risultati rappresentativi).
5. Usa il codice Matlab per quantificare la deformazione²⁰.
   1. Scarica l'intera cartella Matlab al seguente link https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      NOTA: Il codice principale da eseguire è denominato gel_strain e richiama altri file di codice Matlab che devono essere conservati come forniti, memorizzati nella stessa cartella del codice principale.
   2. Apri Matlab e apri il codice gel_strain.
   3. Impostare i parametri (vedere la Tabella 3, Code_Parameter per le impostazioni consigliate).
   4. Definire i percorsi delle cartelle padre ed esperimento come indicato nel codice.
      NOTA: Se la cartella non esiste, il codice mostrerà un pop-up di avviso; Seleziona Aggiungi al percorso e sfoglia fino alla cartella sperimentale in cui sono memorizzate le immagini.
   5. Eseguire il codice gel_strain .
   6. Aprire stretched_str1 come richiesto dal codice.
   7. Aprire reference_str1 come richiesto dal codice.
      NOTA: È conveniente elaborare tutte le immagini allungate a diversi livelli di vuoto contemporaneamente come indicato in questo protocollo; Tutti i file devono essere memorizzati nella stessa cartella sperimentale, ma il codice richiede solo di aprire la prima immagine allungata. I nomi delle immagini dovrebbero terminare con i nomi strX, dove X è costituito dai numeri incrementali 1, 2, 3, ecc., come indicato al punto 6.4.9 di questo capitolo.
   8. Verificare che la cartella dei risultati venga visualizzata con le 4 sottocartelle: Croppeddata contenente i dati ritagliati e allineati; Spostamenti contenenti il file di spostamento del tallone; Immagini contenenti il grafico degli spostamenti radiali e della deformazione; Deformazioni contenenti il foglio di calcolo della matrice di deformazione ottenuta per ogni livello di vuoto.
      1. Calcolare la mediana della matrice di deformazione per ogni livello di vuoto.
      2. Ripetere l'operazione per ogni campione (minimo 3).
      3. Tracciare la matrice di deformazione mediana rispetto al livello di vuoto per i 3 campioni per ottenere la curva di calibrazione (Figura 3C).
         NOTA: Alcuni parametri possono essere modificati nel caso in cui l'immagine del cordone non venga elaborata correttamente dal codice. Per fare ciò, apri il file set_settings_stretch in Matlab e modifica Settings.Resolution e Settings.Overlap in base alle raccomandazioni nei commenti del codice (vedi anche la Tabella 3). A seconda delle esigenze sperimentali, il ceppo applicato al campione biologico può essere variato (deformazione ciclica, deformazione maggiore, ecc.): si raccomanda una calibrazione di queste condizioni (Vedi esempi nella Figura 2 e nella Figura 3 supplementare).
6. Valutazione della risoluzione (seguire il protocollo di Cole et ^al.19)
   1. Montare l'anello elastico preparato al punto 6.2.
   2. Immagine di un campo visivo contenente singoli punti di perline (immagine di una pila con distanza del passo Z pertinente all'obiettivo utilizzato).
   3. Utilizzare MetroloJ (plug-in Fiji), come indicato in Cole et al., per caratterizzare la risoluzione X-Y-Z della configurazione di allungamento (Figura 3D e Figura 4 supplementare).

7. Semina e allungamento delle cellule

1. Rivestimento del PDMS con proteina di adesione cellulare
   1. Sterilizzare l'anello PDMS esponendolo alla luce UV per 15 minuti (Figura 4A). Eseguire tutte le fasi successive del protocollo sotto il cofano biologico per garantire la sterilità.
   2. Sciacquare la piastra sotto la cappa con PBS sterile.
   3. Incubare una proteina di adesione cellulare 11,14,15 depositando una goccia di 100-200 μl della soluzione al centro dell'anello (Figura 4A).
      NOTA: Comunemente, una soluzione di 10 μg/mL di fibronectina è appropriata¹¹. Altre proteine di adesione di interesse possono essere utilizzate per rivestire il PDMS (ad esempio, laminina, cheratina¹⁵; potrebbero essere necessari trattamenti/protocolli specifici). Si consiglia l'incubazione per il rivestimento di fibronectina durante la notte a 4 °C; il metodo alternativo è di 1 ora a 37 °C.
   4. Disegna il perimetro della goccia con un pennarello indelebile dal lato inferiore della membrana PDMS. In questo modo è possibile individuare l'esempio nei passaggi seguenti.
2. Semina cellulare sull'anello PDMS (Figura 4A).
   1. Se necessario, trasfettare le cellule di interesse con una proteina fluorescente prima dell'esperimento di stretching (per le trasfezioni transitorie, 1-3 giorni prima dell'esperimento, a seconda del metodo di trasfezione e delle caratteristiche) o utilizzare protocolli specifici per visualizzare i marcatori fluorescenti di interesse.
      NOTA: Per gli esperimenti iniziali, è conveniente utilizzare un marcatore della membrana plasmatica come GFP-mem^11,12 per visualizzare la risposta della membrana cellulare e le potenziali rotture. Il marcatore è facile da trasfettare e si consiglia di allungare le cellule trasfettate a livelli di deformazione crescenti per valutare la soglia di deformazione che porterà alla rottura della membrana plasmatica. Vedi la mappa plasmidica nella cartella supplementare 5. Questo dipende dal tipo di cellula e sarà inferiore negli esperimenti su singola cellula rispetto ai monostrati cellulari. Questo marcatore di membrana è compatibile con l'allungamento cellulare, contrariamente ad alcuni coloranti che inseriscono la membrana che sono stati osservati per portare alla rottura della membrana plasmatica a bassi livelli di allungamento.
   2. Il giorno dell'esperimento, riscaldare il terreno cellulare e preparare il terreno indipendente dalla CO₂.
      NOTA: Se il microscopio ha un controllo di CO₂ compatibile con il sistema di allungamento, gli esperimenti possono essere eseguiti in normali terreni di coltura cellulare (questa sarebbe una configurazione necessaria per campioni delicati che non possono sopravvivere in terreni indipendenti da CO₂). Si raccomanda l'integrazione indipendente di CO₂ con un agente anti-sbiancamento (ad esempio, per le proteine GFP, l'integratore di rutina²¹ a 10 mg/mL).
   3. Tripsinizzare le cellule e contarle.
   4. Seminare un numero adeguato di cellule in un piccolo volume (20-50 μl) con terreni cellulari standard per favorire l'adesione delle cellule e conservare in un incubatore a umidità controllata di CO₂.
      NOTA: Per fibroblasti piatti e di grandi dimensioni ed esperimenti su singola cellula, 5000 cellule; I numeri dipendono dal tipo di cellula e dall'esperimento stesso.
   5. Dopo 20-30 minuti di incubazione (controllare l'attacco iniziale delle cellule), aggiungere delicatamente 500 μL di terreno sopra le cellule. Riposizionare nell'incubatore per consentire un'ulteriore diffusione delle cellule.
      NOTA: Il tempo di semina dipende dal tipo di cellula e dalle esigenze sperimentali; È possibile anche la formazione di un monostrato con incubazione notturna. Il volume dei terreni di coltura deve essere regolato di conseguenza. Colorazione secondaria delle cellule: una volta attaccate, le cellule possono essere colorate con un colorante come SpyDNA (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare i nuclei (Figura 5 supplementare) o un'altra colorazione per visualizzare qualsiasi struttura di interesse. Attenzione sempre che la colorazione delle cellule vive o la sovraespressione delle proteine per trasfezione possono influenzare la risposta cellulare all'allungamento, specialmente nella corteccia cellulare, nella membrana plasmatica o nelle proteine/strutture meccanosensibili.
   6. Sostituire con un fluido indipendente da CO₂ e utilizzare immediatamente nel dispositivo di allungamento.
      NOTA: A questo punto, il campione è pronto per un esperimento di stretching.
3. Esperimento di allungamento cellulare: esempio di un singolo ciclo di stretch-release e imaging della membrana plasmatica (PM) per catturare il rimodellamento dinamico del PM dei fibroblasti.
   1. Montare l'anello di dilatazione sul tavolino del microscopio come nella sezione 6, passaggio 6.2.
   2. Trova una cella di interesse, registra la sua posizione e scatta un'immagine della cella pre-allungata (Figura 4B).
   3. Applicare il vuoto desiderato che, in base alla curva di calibrazione, corrisponda alla deformazione del substrato desiderata.
   4. Per trovare la cella allungata, per prima cosa, rimetti a fuoco in Z e poi spostati nella direzione X-Y per trovare e centrare la cella nel campo visivo.
   5. Registrare le immagini durante la durata desiderata (Figura 4B).
      NOTA: Gli esperimenti iniziali sono comunemente necessari per determinare la risposta della cella alla deformazione di trazione a seconda del suo tipo (in media). Allungare le celle a diversi deformazioni del substrato per determinare il carico estensibile massimo che possono sopportare. La rottura della membrana plasmatica si verificherà, come visualizzato attraverso il marcatore fluorescente della membrana plasmatica, se lo sforzo è eccessivo per la cellula.
   6. Per il rilascio della cellula, tornare alla posizione della cella a riposo e attivare la modalità di acquisizione del microscopio per assicurarsi che l'acquisizione possa iniziare non appena il campione è stato rifocalizzato.
   7. Rilascia l'allungamento e rimetti rapidamente a fuoco manualmente in Z.
   8. Registrare le immagini della cella rilasciata per il tempo desiderato (Figura 4B). A causa della natura flessibile della membrana PDMS, il campione si sfoca facilmente con il tempo. Pertanto, regolare manualmente la messa a fuoco durante l'acquisizione dell'immagine.
      NOTA: Per rimettere a fuoco correttamente durante l'imaging dopo il rilascio, le immagini devono essere visualizzate abbastanza spesso; Un'immagine video di 3-5 minuti ogni 3 s è ragionevole. Il substrato PDMS non è compatibile con il sistema di messa a fuoco perfetta del microscopio, quindi di solito è necessaria la regolazione manuale da parte dell'utente per un'acquisizione rapida. La messa a fuoco del software potrebbe essere risolta, ma fai attenzione a possibili errori e grandi movimenti del palco che potrebbero danneggiare l'obiettivo colpendo una parte del palo allungato. L'utente può decidere di eseguire più allungamenti del campione a seconda dell'esperimento.
4. Post-elaborazione: allinea le immagini utilizzando le Fiji
   1. Aprire le immagini a riposo e filtrare.
   2. Utilizzare la corrispondenza del modello di plug-in Fiji e selezionare una regione della cella da allineare (Figura 4C).
      NOTA: Gli spostamenti relativi dell'immagine della deformazione allineata vengono renderizzati dalle Fiji e le immagini vengono ritagliate e allineate. Scarica il plugin template_matching da questo link : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. Semina cellulare su substrato prestirato

1. Montare l'anello allungato rivestito con la proteina di adesione nel dispositivo di allungamento.
2. Allungare il substrato PDMS al livello di deformazione desiderato.
3. Semina le celle come nella sezione 7.
   NOTA: In questo esperimento, la semina non viene eseguita in condizioni sterili, quindi il protocollo potrebbe non essere appropriato per tutti i tipi di cellule.
4. Dopo che le cellule hanno aderito, scambiare il terreno con un mezzo indipendente dal CO₂.
   NOTA: Scegliere celle ad aderenza rapida per ridurre al minimo il tempo di aderenza.
5. Dopo il tempo di incubazione desiderato, rilasciare l'allungamento e visualizzare una cellula di interesse.
   NOTA: In questo passaggio, trovare una stessa cella dopo il rilascio dell'allungamento è difficile, poiché la posizione della cella a riposo è sconosciuta e il movimento del substrato PDMS non è facilmente prevedibile.

9. Fissaggio di celle allungate o rilassate

1. Fissare le celle in stati allungati (lavorare sotto cappa chimica)
   NOTA: La paraformaldeide (PFA) è un agente di fissazione standard; utilizzarlo caldo a 37 °C per garantire un fissaggio rapido. In alternativa, la soluzione di gliossale²² consente una rapida fissazione del campione con una buona conservazione del campione.
   1. Preparare l'agente di fissaggio.
   2. Seminare le celle sugli anelli seguendo il passaggio 7.2.
   3. Montare il perno di allungamento e il controller all'interno di una cappa chimica e collegarli all'alimentazione del vuoto.
   4. Posiziona l'anello con le cellule seminate nel perno di allungamento.
   5. Per fissare lo stato allungato, allungare fino alla deformazione desiderata. Rimuovere i terreni di coltura cellulare e fissare aggiungendo la soluzione di PFA al 4% alle cellule per 10 minuti a 37 °C. Quindi lavare con PBS, mantenendo sempre l'elasticità. Rilasciare lentamente l'aspirapolvere e lavare con più PBS.
      NOTA: Non dimenticare di preparare uno stato di controllo non elastico (per questo, un piccolo pezzo di PDMS può essere tagliato e asciugato con una piccola quantità di soluzione di etanolo al 96% sotto, sopra un vetrino coprioggetti). Per visualizzare il campione fisso, si consiglia di allungare il campione alla stessa grandezza. Poiché il PFA è tossico, in questa fase è necessario prendere adeguate precauzioni. È conveniente utilizzare un piccolo forno che può essere tenuto sotto la cappa, vedi Tabella dei materiali).
   6. Visualizzare il campione, preferibilmente applicando nuovamente il vuoto, allo stesso livello utilizzato durante il fissaggio, il che garantisce la "reflattezzazione" del campione (Figura 4D).
2. Fissare la cella dopo l'allungamento (lavorare sotto la cappa chimica).
   1. Allunga le celle alla tensione e al tempo desiderati. Poco prima del rilascio estensibile, rimuovere la maggior parte del terreno senza asciugare completamente il campione e rilasciare il ceppo. In alternativa, applicare un allungamento ciclico di una durata specifica.
   2. Rimuovere rapidamente il terreno e fissarlo immediatamente con la soluzione fissativa per 10 minuti. Lavare con PBS e immagine.
      NOTA: Il campione può anche essere seminato su un substrato pre-stirato e, dopo un tempo di semina definito dall'utente, un rilascio post-stiro fisso come al punto 9.2.2.
3. Immunofluorescenza di campione fissato: seguire i protocolli standard per l'immunofluorescenza sia su allungato che rilasciato; il blocco con gelatina di pesce è preferito alla BSA¹⁷.
4. Immagine del campione (Figura 4E).
5. Conservazione dei campioni
   1. Preparare i terreni di montaggio per la conservazione del campione (Mowiol o Prolong).
   2. Rimuovere il PBS e aggiungere una goccia (circa 75 μl) di supporto di montaggio.
   3. Prendi un vetrino coprioggetti con una pinzetta e posizionalo delicatamente sopra (evita le bolle, che ostacolerebbero la visualizzazione).
   4. Asciugare per almeno 48 ore a temperatura ambiente (RT).
   5. Tagliare intorno al campione fissato PDMS e montarlo su un altro vetrino coprioggetti per l'imaging successivo.
      NOTA: Questo passaggio non è compatibile con la post-imaging del campione sulla membrana tesa in quanto il montaggio della membrana PDMS su un vetrino coprioggetti con il mezzo di conservazione comporta la conservazione della membrana solo nel suo stato rilassato.

10. Fissazione con la griglia per l'imaging della stessa area campione in diverse modalità - Imaging SEM come esempio

NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare la stessa singola cellula in due microscopi diversi, microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica a scansione, come presentato qui. L'imaging correlativo richiede un'elaborazione avanzata delle immagini che non rientra nell'ambito di questo protocollo. Altre applicazioni utili possono essere, ad esempio, la visualizzazione del campione in modalità live, l'ulteriore fissazione sotto il cofano e la visualizzazione della stessa cellula dopo l'immunocolorazione (il protocollo utilizzato per la Figura 5 supplementare).

1. Preparare un anello elastico utilizzando le piastre in PMMA modellate della sezione 4.
2. Semina le celle come nel passaggio 7.2.
   NOTA: Fare attenzione che la soluzione di rivestimento deve essere applicata con cura per garantire una copertura completa del PDMS, anche nei piccoli fori della griglia.
3. Fissare come descritto nella sezione 8 ma utilizzando un fissativo appropriato e un protocollo compatibile con il campione e l'imaging al microscopio elettronico.
   NOTA: Se si utilizza una miscela di PFA + glutaraldeide (ad esempio, 2%-2,5%), fare attenzione all'autofluorescenza derivante dalla presenza di reagente glutaraldeide ed eventualmente eseguire una fase di quenching²³.
4. Immagine del campione in modalità fluorescenza e registrazione della posizione della cella (stampare la griglia e annotare la posizione con una croce, ad esempio).
5. Una volta acquisite tutte le immagini, preparare il campione per l'EM tagliando prima il PDMS attorno al campione (rimuovendo precedentemente il lubrificante).
6. Processare la membrana PDMS + il campione per la microscopia elettronica a scansione (che prevede il protocollo standard di disidratazione del campione e sputtering del metallo)¹².
7. Quando si esegue l'imaging nel microscopio SEM, trovare le posizioni della griglia e cercare le cellule precedentemente acquisite in modalità fluorescente (Figura 4F, G).

Risultati

Taratura e radialità
La corretta caratterizzazione del ceppo ottenuto è una garanzia per la riproducibilità e il controllo degli esperimenti. Mentre le perle fluorescenti possono essere aggiunte a ciascun campione per registrare con precisione la deformazione, una fase di calibrazione precedente garantisce una corretta pianificazione dell'esperimento, conoscendo l'entità della deformazione che lo sperimentatore desidera applicare al campione prima dell'effettivo allungamento. La deformazione non dipen...

Discussione

Un gran numero di dispositivi di stretching è stato utilizzato per applicare l'allungamento meccanico a campioni biologici, imitando le condizioni fisiologiche nel corpo^24,25. In letteratura sono disponibili numerose configurazioni e l'osservazione della risposta del campione viene solitamente eseguita accoppiando dispositivi di stretching alla forza atomica²⁶ o alla microscopia a fluorescenza

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Maschera in acetato	JD Fotodati
Acrilamide	Biorad	161-0140	Soluzione di acrilammide al 40%
APS	Sigma Aldrich	Trasmissione A3678	Persolfato di ammonio per elettroforesi, ≥ 98%
Aptes	Sigma Aldrich	281778	(3-amminopropil)trietossisilano
Pompa microfluidica autonoma	Elveflow Cobalto	Doppio cobalto	Doppio cobalto
Bisacrilammide	Biorad	161-0142	Soluzione 2% bis
Lama	Fisher Scientifico	11733919	Gruppo Didattico Hoja ha fatto ctica X100 LAME BISTOURI STERILI N° 23  LAMD23
Clip	Sprintis	AKXX000001	Clip Bull Dog, 32 mm, in metallo, capacità 10 mm, nichelato
Trattamento corona	Prodotti elettrotecnici	BD-20AC, codice:12051A	BD-20AC TRATTAMENTO CORONA DA LABORATORIO
Tazze	VWR	611-1368	VWR, Coppe in becher, monouso, 250 mL
DAPI	Roche	10236276001	Colorazione DAPI
Etanolo 96%	Panreac Quí mica, SLU	131085-1212	Etanol 96% v/v para aná lisis, ACS- 2,5 L
Fibronectina	Sigma	F0895	Fibronectina, da plasma umano, liquido  0.1%
FluoSpheres Microsfere modificate con carbossilato, 0,1 µ m	Tecnologia di vita	F8801, F8803	Perline fluorescenti gialle, verdi e rosse per la valutazione della risoluzione
FluoSpheres Microsfere modificate con carbossilato, 0,2 µ m	Fisher Scientifico	F8809, F8810	Perle fluorescenti gialle, verdi e rosse per la calibrazione della deformazione
Glutaraldeide	Sigma Aldrich	G6403	Soluzione di glutaraldeide 50% in H2O
Interferometro	Veeco	Wyko NT1100	Interferometro per misurare gli spessori delle membrane PDMS
Isopropanolo	Panreac Quí mica, SLU	Codice 131090-1212	2-propanolo (Reag. Ph. Eur.) para aná lisis, ACS, ISO
Laiton pesa			Su misura
Fazzoletti privi di lanugine	Berkshire	DURX670, DR670090920	Salviette in tessuto non tessuto
Lubrificante (vaselina)	Sigma	16415	Vaselina
Allineatore maschera	Sü ss MicroTec	MJB4	Allineatore a maschera per fotolitografia su lastre in PMMA
Mowiol	Calbiochem - Merck	475904	Reagente MOWIOL 4-88
Microscopio NIKON a disco rotante confocale	Nikon	Eclissi Ti-E/B	dotato di Nikon Ti-S-ER  Palco
Microscopio verticale NIKON	Nikon	Eclissi Ni-E	dotato di tavolino Nikon NI-SH-E
Obiettivo 60x	Nikon	CFI Apo NIR 60X W	NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
Soluzione PBS	Gibco	14200067	DPBS, 10x
Sensori di sicurezza	Dow Corning	2401673921	Sylgard - 184 Elastomero Siliconico KIT DN 109
Coperchio dell'anello della piastra di Petri (grande)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100
Coperchio dell'anello della piastra di Petri (piccolo)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
Pulitore al plasma	Harrick	PDC-002	Generatore di plasma di ossigeno
Piastre e anelli in PMMA			Vedere la tabella delle specifiche di Excel nei documenti supplementari
Prolungare	Invitrogen	P36930 /P36934	Reagente antisbiadimento ProLong Gold
Repelle-Silano	GE Sanità	17-1332-01	PlusOne Repel-Silane ES
Anelli/anello di gomma	Tecnifil		Su misura
Spin coater	Alloro	WS-650Sz	Spin coater
SPY650-DNA	Spirocromo	SC 501	SPY650-DNA
Cucchiaio da sterzo	VWR	231-0416	Spatola monouso corta Eco, cucchiaio e misurino a doppia estremità, additivo in PP ed EcoPure
Resina SU8 2100	Microchimica	Y111075	SU8-2100
Sviluppatore SU8	Sigma-Aldrich	484431	Acetato di etere monometilico di glicole propilenico
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina, Bioreagente suitab. Reagente per elettroforesi
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano	Sigma Aldrich	448931	Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano
Pinzetta	IESMAT	T5039	Dumont HP Pinzetta 7 in acciaio inossidabile. Punta da 0,17 x 0,10 mm. (Agar Scientific Ltd)
Controllore del vuoto	GARCAP/Parker	990-005203-005	Controlador de vacio
Regolatore di vuoto fluigent	Fluigente	LU-FEZ-N800	LineUp Flow EZ (n800mbar)
Carta da banco bianca	Raima	931.1001	Carta Raima 42 x 52