Articolo metodologico

Metodo di prelievo del sangue attraverso la parete per ridurre al minimo l'interruzione del sonno in ambito clinico

DOI:

10.3791/67530

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13 giugno 2025

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1Human Performance Clinical Research Laboratory, Department of Health and Exercise Science, Colorado State University, 2Anschutz Health and Wellness Center, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un metodo mininvasivo e diretto per campionare il sangue durante il sonno in contesti clinici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I ritmi fisiologici, compresi i ritmi diurni e circadiani, svolgono un ruolo fondamentale per la salute, con disturbi sempre più legati alle malattie cardiovascolari e al diabete di tipo 2. Questi ritmi sono strettamente legati ai cicli sonno-veglia, poiché i cambiamenti nei tempi o nella durata del sonno possono alterare i ritmi diurni e circadiani, interrompendo così l'omeostasi fisiologica. Ulteriori fattori, come la tempistica di comportamenti come l'assunzione di cibo e/o l'attività fisica, possono modulare i ritmi di 24 ore in modi che supportano la salute o promuovono il rischio di malattie croniche.

Nonostante il crescente riconoscimento dell'importanza dei ritmi biologici, l'ottenimento di campioni di sangue seriali necessari per chiarire i modelli nei fattori circolanti rimane una sfida significativa nella ricerca clinica. I metodi di prelievo di sangue di routine possono essere dannosi per il sonno, alterando potenzialmente il sonno e i ritmi biologici e influenzando successivamente le variabili di interesse. Ciò sottolinea la necessità di approcci minimamente invasivi che consentano la valutazione dei processi biologici 24 ore su 24 senza disturbare il sonno o i ritmi biologici.

Per affrontare queste sfide, molti gruppi clinici e di ricerca impiegano una tecnica nota come metodo di campionamento del sangue "attraverso il muro". Questo approccio utilizza tubi estesi collegati a un catetere a permanenza, infilati attraverso una parete o una parete divisoria in una posizione esterna alla stanza del partecipante. Consentendo la raccolta del sangue senza dover entrare nella stanza, questo metodo riduce al minimo le interruzioni, preservando così l'integrità dei profili 24 ore delle variabili circolanti di interesse e disturbando minimamente il sonno.

Qui, forniamo una descrizione dettagliata del metodo di prelievo del sangue attraverso la parete e ne dimostriamo la fattibilità e l'efficacia nella raccolta di campioni di sangue durante le opportunità di sonno programmate. Vengono presentati i dati rappresentativi di uno studio clinico e vengono discusse ulteriori considerazioni, tra cui l'impatto di un prelievo di sangue difficile sull'architettura del sonno.

Introduzione

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I ritmi diurni e circadiani sono cicli biologici coinvolti nella regolazione dei processi fisiologici, metabolici e comportamentali nell'arco delle 24 ore. I ritmi diurni sono modelli biologici che seguono un ciclo giorno/notte e sono guidati da segnali ambientali o comportamentali. Al contrario, i ritmi circadiani sono vicini ai cicli di 24 ore in biologia guidati da una rete intrinseca di orologi molecolari, indipendenti da segnali esterni (nota: una spiegazione dettagliata degli orologi circadiani va oltre lo scopo di questo articolo; i lettori interessati sono indirizzati a Cox et al.1 per ulteriori informazioni e Broussard et al.2 per una discussione sui protocolli circadiani clinici). Sia il ritmo diurno che quello circadiano svolgono un ruolo fondamentale per la salute, con interruzioni associate a un aumento del rischio di sviluppare malattie cardiovascolari e diabete di tipo 2 3,4. Questa comprensione è radicata in decenni di ricerca che coinvolgono misurazioni di serie temporali in condizioni di laboratorio controllate. I risultati di tali studi hanno aiutato a distinguere tra le influenze circadiane endogene e gli effetti ambientali o comportamentali esterni sui processi biologici e il loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi fisiologica 2,5. Questo corpus di lavori ha gettato le basi per una ricerca traslazionale più recente che indaga l'impatto del sonno e della tempistica circadiana dei comportamenti sugli esiti relativi alla salute 6,7,8,9.

Gli ormoni e i fattori metabolici mostrano oscillazioni distinte nelle 24 ore. La melatonina, ad esempio, aumenta durante la notte biologica e rimane bassa durante il giorno biologico10. Al contrario, il ritmo del cortisolo è caratterizzato da soppressione durante la prima parte della notte biologica, seguita da un picco prima del risveglio11, che viene alterato durante la privazione del sonno12. L'ormone stimolante la tiroide (TSH) aumenta nella sera biologica e viene soppresso durante il sonno13. Il ritmo del TSH viene interrotto durante la privazione del sonno, portando ad un aumento dei livelli di TSH durante la notte biologica14. I modelli ritmici di diversi altri fattori circolanti sono influenzati in modo simile dai cicli sonno-veglia. Ad esempio, la secrezione dell'ormone della crescita (GH) è strettamente legata al sonno a onde lente (SWS), con un rilascio pronunciato poco dopo l'inizio del sonno, specialmente negli uomini di15 anni. Inoltre, la secrezione di GH in combinazione con l'aumento del glucagone durante il sonno aiuta a sopportare il digiuno notturno prolungato e porta a un ridotto utilizzo del glucosio per mantenere stabili i livelli di glucosio nel sangue e prevenire l'ipoglicemia16. Simile nel modello al GH, la prolattina aumenta bruscamente dopo l'inizio del sonno e raggiunge il picco a metà del periodo di sonno, con aumenti simili che si verificano durante i sonnellini diurni17,18. Altri fattori circolanti che mostrano ritmi 24 ore includono l'ormone adrenocorticotropo, l'ormone luteinizzante, il glucosio e l'insulina (per un riassunto più completo, vedi Hanlon et al.5).

Anche molti fattori circolanti coinvolti nella fame, nella regolazione dell'appetito e nell'equilibrio energetico mostrano fluttuazioni nel periodo di 24 ore. La grelina, che stimola la fame, raggiunge il picco prima dei pasti e diminuisce durante il periodo di sonno notturno, mentre la leptina, un ormone della sazietà, aumenta di notte, probabilmente sopprimendo la fame durante il digiuno notturno19. Altri segnali metabolici, come gli acidi grassi liberi, gli endocannabinoidi e i peptidi di sazietà come GLP-1 e PYY, mostrano variazioni che sono influenzate sia dal sonno che dai modelli alimentari 19,20,21,22.

Nel loro insieme, le oscillazioni descritte sopra illustrano la complessa interazione tra sonno, processi circadiani e omeostasi fisiologica che può essere pienamente apprezzata solo profilando i modelli circolanti 24 ore di variabili fisiologiche rilevanti.

La delucidazione dei ritmi 24 ore su 24 dei fattori circolanti è essenziale per comprendere le fluttuazioni quotidiane della funzione fisiologica, nonché il modo in cui il sonno e l'interruzione circadiana influiscono sulla salute. Tuttavia, i metodi tradizionali di prelievo del sangue possono interferire con i processi stessi che guidano e regolano questi ritmi23, evidenziando la necessità di approcci minimamente invasivi che consentano di ottenere informazioni accurate sui profili delle 24 ore.

Pertanto, l'obiettivo di questo articolo sui metodi è quello di descrivere in modo sufficientemente dettagliato i passaggi necessari per ottenere in modo affidabile campioni di sangue frequenti nell'arco di 24 ore da partecipanti alla ricerca umana utilizzando una tecnica di campionamento del sangue attraverso la parete. La tecnica descritta, impiegata da molti laboratori del sonno e circadiani 20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, affronta le sfide tecniche legate alla raccolta di campioni di sangue durante il sonno. Nelle sezioni seguenti, la tecnica stessa è descritta con una dimostrazione video supplementare. Inoltre, vengono presentati i dati rappresentativi di uno studio clinico che utilizza il metodo. Infine, l'articolo si chiude con una discussione dei limiti, delle insidie e delle considerazioni importanti dell'utilizzo del metodo nella ricerca clinica.

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Protocollo

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I metodi descritti in questo documento sono utilizzati nei protocolli attualmente approvati dall'Institutional Review Board della Colorado State University e dal Colorado Multiple Institutional Review Board. Dati rappresentativi sono stati derivati da tali studi per i quali è stato ottenuto il consenso informato scritto prima della partecipazione. Tutte le forniture e le attrezzature utilizzate sono elencate nella Tabella dei Materiali. Nella discussione vengono presentate ulteriori considerazioni sul metodo.

1. Impostazione e fissaggio della linea di prolunga

NOTA: Prima di qualsiasi procedura clinica, è necessario eseguire un'adeguata igiene delle mani utilizzando una soluzione con un minimo del 70% di alcol isopropilico. I dispositivi di protezione individuale (DPI), inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, guanti, camici da laboratorio e scarpe chiuse, devono essere indossati sempre.

  1. Configurazione per il campionamento attraverso la parete (Figura 1)
    1. All'esterno della stanza dei partecipanti, allestire la stazione di prelievo del sangue con le seguenti forniture: tampone assorbente monouso, valvola di arresto a 3 vie, linea di prolunga da 120 pollici, siringa di lavaggio con soluzione salina da 10 mL, siringa di lavaggio con soluzione salina riscaldata da 10 mL nel dispositivo di riscaldamento, siringa da 5 ml per i rifiuti, siringa da 3 ml per il prelievo di sangue (le dimensioni possono variare a seconda del volume del prelievo di sangue), e un contenitore per rifiuti a rischio biologico. Tutte le forniture sono elencate nella Tabella dei Materiali.
  2. Fissare la linea di prolunga per il campionamento attraverso la parete.
    1. Sul tampone assorbente monouso, collegare il rubinetto a 3 vie al lato Luer lock femmina della linea di estensione.
      NOTA: Assicurarsi che l'estremità esposta del rubinetto non tocchi alcuna superficie (comprese le mani guantate). Se contaminato, sostituire il rubinetto per garantire la sterilità.
    2. Posizionare la siringa da 10 mL di soluzione fisiologica e la siringa da 3 mL di campione (con il sigillo rotto) sul rubinetto.
      NOTA: Una volta che il rubinetto è collegato alla linea di prolunga, i 2 punti di attacco del rubinetto rimanenti sono identici; Pertanto, le siringhe di lavaggio salino e sample possono essere posizionate su entrambi gli attacchi del rubinetto rimanenti. La rottura del sigillo si riferisce alla trazione all'indietro dello stantuffo della siringa per rilasciarlo prima che la siringa sia attaccata al partecipante, assicurando che la pressione negativa acuta dovuta alla rottura del sigillo non provochi danni al vaso sanguigno.
    3. Ruotare la linguetta OFF del rubinetto in modo che la linea di prolunga sia chiusa alla siringa del campione da 3 ml. In questo modo il rubinetto si aprirà al risciacquo salino da 10 mL.
    4. Spingere la soluzione salina attraverso la linea di estensione. Quando la soluzione salina raggiunge la fine del filo, rimuovere con cautela il tappo e lasciare gocciolare la soluzione salina in una tazza e/o sul tampone assorbente per assicurarsi che il filo sia completamente riempito di soluzione fisiologica. Riattaccare il cappuccio all'estremità della linea di prolunga ora innescata.
    5. Ruotare la linguetta OFF del rubinetto in modo che la linea sia chiusa da entrambe le siringhe. Lasciare le siringhe attaccate al rubinetto.
      NOTA: Il volume massimo della linea è di 3,4 ml.
    6. Far passare l'estremità chiusa della linea di estensione attraverso la porta a muro fino alla stanza dei partecipanti. Assicurarsi che il tappo rimanga in posizione per mantenere la linea sterile.
    7. Spostarsi nella stanza del partecipante per collegare la linea di estensione al partecipante. Pulire l'estremità distale della linea di estensione e il sito di attacco del set di estensione IV (collegato al partecipante) con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol.
    8. Rimuovere il cappuccio sulla linea di prolunga e collegare la linea al set di prolunga IV (collegato al partecipante).
    9. Una volta collegata la linea di prolunga alla flebo, tornare all'anticamera.
      1. Rimuovere ed eliminare la soluzione fisiologica usata dal rubinetto e collegare una soluzione fisiologica riscaldata da 10 ml. Ruotare la linguetta OFF del rubinetto per chiudere la linea della siringa del campione. In questo modo il rubinetto si aprirà al nuovo lavaggio salino da 10 mL.
      2. Spingere la soluzione salina nella linea di prolunga per garantire che non ci siano perdite e che la flebo sia ancora brevettata. Ruotare la linguetta OFF del rubinetto in modo che la linea sia chiusa da entrambe le siringhe.
        NOTA: Il lavaggio salino non deve superare la temperatura corporea umana (37 °C/98.6 °F). Verificare la temperatura salina utilizzando un termometro posizionato nel dispositivo di riscaldamento. Per lavare l'intera linea sono necessari almeno 4,4 ml di soluzione fisiologica, poiché il volume nella linea di estensione è di 3,4 ml + e il volume nel set di estensione IV è di 1 ml.
    10. Continuare a spingere lentamente la soluzione salina mentre si ruota la linguetta OFF del rubinetto per chiudere la linea di entrambe le siringhe. Ciò manterrà la pressione nella linea di estensione e ridurrà al minimo il riflusso di sangue.
    11. Una volta stabilita con successo la linea di estensione, torna nella stanza del partecipante per avvolgere il set di estensione IV con una benda elastica autoadesiva per assicurarti che non venga tirato durante il sonno. Fissare la linea di prolunga al telaio del letto con del nastro adesivo.
    12. Discutere con il partecipante le sue preferenze di sonno (ad esempio, dormiente laterale, dormiente sulla schiena, ecc.) e fornire tubi in eccesso per consentire libertà di movimento durante il sonno. Chiedi al partecipante di testare la gamma di movimento.
      NOTA: È importante ricordare al partecipante che deve richiedere l'assistenza del personale per scollegare la linea di estensione per utilizzare il bagno.

2. Campionamento del sangue attraverso la linea di prolunga

  1. Prelievo di un campione di sangue.
    1. Prima di qualsiasi prelievo di sangue, assicurarsi che la linea di prolunga sia ancora innescata con soluzione fisiologica e verificare che la linguetta OFF del rubinetto sia attorcigliata in modo tale che la linea sia chiusa a entrambe le siringhe.
      1. Se è possibile vedere sangue nella linea di estensione, sciacquare un minimo di 4,4 ml di soluzione fisiologica riscaldata per liberare la linea di estensione e il set di estensione IV dal sangue.
    2. Collegare una siringa da 5 ml (siringa di scarto) e una siringa da 3 ml (siringa campione) al rubinetto. Ruotare la linguetta OFF del rubinetto per aprire la linea di prolunga della siringa da 5 ml (siringa di scarto).
      NOTA: Prima di prelevare un campione di sangue, è necessario prelevare e scartare una siringa "di scarto", che consiste nella soluzione salina nella linea di prolunga e nel set di estensione IV.
    3. Aspirare con la siringa da 5 mL fino a quando il sangue intero inizia a entrare nella siringa (dopo almeno 4,4 mL di rifiuti).
      NOTA: Il colore del liquido nella siringa di scarto inizierà come chiaro, seguito da rosa e infine rosso scuro una volta che la linea di estensione sarà riempita con sangue intero.
    4. Una volta che il sangue intero è visibile nella siringa da 5 ml, ruotare la linguetta OFF del rubinetto per chiudere la linea della siringa di scarto da 5 ml.
    5. Prelevare la quantità di sangue desiderata con la siringa da 3 ml. Ruotare la linguetta OFF del rubinetto per chiudere la linea di prolunga di entrambe le siringhe.
      NOTA: Il sangue non deve rimanere nella linea di prolunga per più di 5 minuti per ridurre il rischio di coagulazione. Se il prelievo di sangue è lento, possono essere utilizzate più siringhe di campionamento più piccole per ridurre la pressione sulla vena. Imposta un timer per determinare la durata del prelievo di sangue. A 5 minuti, sciacquare la linea per evitare la coagulazione. Si può tentare una nuova estrazione, oppure l'estrazione può essere saltata. Sebbene alcuni protocolli incorporino tecniche di risparmio di sangue, come il reinfusione della siringa di scarto per ridurre al minimo la perdita di sangue, questo protocollo non implementa tali misure.
    6. Rimuovere la siringa di scarto da 5 mL e sostituirla con una soluzione fisiologica calda da 10 mL.
    7. Ruotare la linguetta OFF sul rubinetto per chiudere la linea della siringa vuota da 3 ml. Questo aprirà la linea al lavaggio salino.
    8. Spingere fino a 10 ml di soluzione fisiologica riscaldata, assicurandosi che non rimanga sangue nella linea di estensione.
    9. Ruotare la linguetta OFF sul rubinetto per chiudere la linea di entrambe le siringhe.
      1. Continuare a spingere lentamente la soluzione salina mentre si ruota la linguetta OFF del rubinetto per chiudere la linea di entrambe le siringhe. Ciò manterrà la pressione nella linea di estensione e ridurrà al minimo il riflusso di sangue.
      2. Utilizzare la soluzione fisiologica rimanente nella siringa per far scorrere attraverso il rubinetto nella siringa vuota da 3 ml. Liberare ulteriormente il rubinetto dalla soluzione fisiologica rimuovendo la siringa di soluzione fisiologica e tirando indietro la siringa da 3 ml per rimuovere il liquido rimanente nel rubinetto.
    10. Sostituisci tutte le siringhe per prepararti al prossimo estrazione.
      NOTA: Non lasciare le porte del rubinetto senza siringhe collegate, poiché ciò comprometterebbe la sterilità.

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Risultati

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Melatonina 24 ore su 24 utilizzando il prelievo di sangue attraverso la parete durante il sonno
Il metodo sopra descritto consente di valutare i modelli di 24 ore di fattori circolanti che altrimenti non verrebbero rilevati da un singolo campione temporale. La melatonina, un ormone spesso misurato mediante prelievo di sangue attraverso la parete, funge da surrogato più ampiamente accettato per valutare il ritmo dell'orologio circadiano centrale, che risiede nel nucleo...

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Discussione

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Il metodo di campionamento del sangue attraverso la parete qui presentato è ampiamente utilizzato nel sonno e nella ricerca circadiana per raccogliere il sangue durante il sonno con il minimo disturbo dei partecipanti. Le procedure descritte, tra cui la preparazione, l'impostazione e l'uso della linea di estensione, hanno ampie applicazioni sia in ambito clinico che di ricerca. Utilizzando questa tecnica, i ricercatori possono ottenere con successo campioni di sangue per un periodo di 24...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata in parte da T32HL149646 a GSM e R01DK125653 e R01HL168081 a JLB. Vorremmo anche ringraziare Stephanie Laing RN, BSN, un'infermiera di ricerca professionale presso il Colorado Clinical & Translational Sciences Institute (CCTSI) e il Centro di ricerca traslazionale clinica dell'Università del Colorado Anschutz Medical Campus per aver esaminato i metodi e fornito approfondimenti e modifiche alla versione finale di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Extended Set IV a diametro standard da 9 pollici con volume di innesco da 1 mL, connettore SmartSite Remove senza ago, morsetto a slitta e bloccaggio a spin maschio LuerMedlineIME22059EH
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% USP 10 mL in una siringa da 10 mL ZRExcelsior MedicalEMZE010001
Assorbente per la preparazione dell'alcolMedlineMDS090737
Catetere alato BD Insyte Autoguard da 20 GMedline381534
Siringa BD Plastipak 3 mLFischer Scientific309657
CoFlexNLMedline5200CP
Set di estensione IV di 192 pollici, tubo di piccolo diametroMedicina in terapia intensivaB2202È necessario creare un account presso l'assistenza medica della terapia intensiva per ordinare le forniture
Spugne di garza non tessuteMedlineNON25223
TegadermMedline1624W
Ultra(TM) Blocco maschio a 3 vie per la stiva a scatto/girevoleMedlineMX2311L

Riferimenti

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