Articolo metodologico

Cattura delle rotture di siti fragili comuni mediante γH2A nativo. X ChIP

DOI:

10.3791/67535

⸱

24 gennaio 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un metodo rapido ed efficiente per rilevare le comuni rotture dei siti fragili attraverso l'immunoprecipitazione nativa della cromatina γH2A.X (ChIP). Questo approccio riduce significativamente sia il tempo che la manodopera associati ai tradizionali saggi ChIP γH2A.X, mantenendo al contempo un'elevata riproducibilità e affidabilità dei risultati.

Abstract

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Lo stress di replicazione indotto dall'esposizione ad agenti estrinseci può portare a rotture del DNA in siti fragili comuni, che sono regioni del genoma note per essere soggette a instabilità strutturale. Il test di immunoprecipitazione della cromatina γH2A.X (ChIP) funge da potente strumento negli studi di genotossicità, poiché la fosforilazione γH2A.X è un marcatore ben consolidato per le rotture del doppio filamento del DNA. I tradizionali saggi ChIP γH2A.X, tuttavia, sono spesso laboriosi e comportano più passaggi che richiedono tempo. In questo studio, presentiamo un metodo semplificato ma efficace che combina il frazionamento subcellulare con la ChIP nativa per isolare i complessi associati a γH2A.X. Questo approccio è particolarmente adatto per analizzare le interazioni γH2A.X-cromatina con maggiore specificità ed efficienza. Utilizzando il frazionamento subcellulare, i materiali non legati alla cromatina vengono efficacemente rimossi, ottenendo una frazione di cromatina purificata. La successiva digestione della nucleasi micrococcica (MNasi) in condizioni blande consente la frammentazione della cromatina preservando le interazioni fisiologiche tra γH2A.X e i suoi complessi proteici associati. Questa conservazione è essenziale per lo studio dei partner di interazione nativi coinvolti nelle vie di risposta al danno del DNA. Questo protocollo ChIP nativo ottimizzato riduce sostanzialmente il tempo e la manodopera associati ai saggi ChIP γH2A.X convenzionali. La procedura semplificata non solo semplifica il flusso di lavoro, ma produce anche risultati altamente riproducibili, il che la rende particolarmente vantaggiosa in ambienti in cui è richiesta l'elaborazione ad alta produttività di più campioni. Questo metodo ha un'ampia applicabilità negli studi incentrati sulla stabilità del genoma, sulla riparazione del DNA e sulla biologia della cromatina, dove il rilevamento accurato ed efficiente dei siti di danno al DNA è fondamentale. Utilizzando protocolli ottimizzati e passaggi semplificati, questo metodo consente di rilevare danni al DNA in siti fragili con una migliore sensibilità e una manipolazione minima del campione, rendendolo uno strumento prezioso per gli studi sulla stabilità del genoma e sulla risposta al danno del DNA.

Introduzione

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I siti fragili comuni (CFS) sono grandi regioni cromosomiche che si trovano su ogni cromosoma umano inclini a rompersi durante la metafase. Sotto stress di replicazione, la replicazione in queste regioni è significativamente ritardata, impedendo la loro completa duplicazione prima dell'ingresso mitotico1, che alla fine si traduce in lacune e rotture sito-specifiche. La CFS è un punto caldo per l'instabilità cromosomica e sono una delle principali cause di riarrangiamenti cromosomici durante lo sviluppo precoce del cancro. Lo stress di replicazione, che è spesso presente in condizioni tumorigeniche, può portare alla perdita di geni oncosoppressori e all'amplificazione di oncogeni, collettivamente indicati come variazione del numero di copie (CNV)2,3,4,5,6. Inoltre, la CFS è altamente incline all'integrazione virale, promuovendo ulteriormente lo sviluppo del cancro 7,8,9,10. Molteplici delezioni omozigoti di geni oncosoppressori sono state rilevate nelle regioni CFS durante le analisi pan-tumorali dei tumori primari. Le CFS più comunemente colpite nel cancro includono FRA2F, FRA3B, FRA4F, FRA5H e FRA16D11. I CFS sono particolarmente vulnerabili alla rottura in presenza di agenti cancerogeni estrinseci12. Per valutare gli effetti cancerogeni dannosi dei contaminanti ambientali, è necessario un metodo rapido e affidabile per quantificare l'insorgenza di rotture da CFS.

Fosforilazione di H2A. X al residuo di serina 139 (γH2A.X) da parte dell'atassia telangiectasia e della proteina correlata a Rad3 (ATR) o dell'atassia telangiectasia mutata (ATM) è un evento chiave nella segnalazione dello stallo della forcella di replicazione13. γH2A.X funge da indicatore dello stallo delle forcelle di replicazione prima della formazione del double-strand break (DSB)13, creando un ambiente cromatinico favorevole per facilitare il reclutamento efficiente delle proteine di riparazione nei siti in stallo. Inoltre, γH2A.X può essere reclutato per rompere i siti dopo il collasso della forcella14,15, coerentemente con il suo ruolo primario nella riparazione del DSB. Poiché le rotture della CFS sono strettamente associate alle aberrazioni cromosomiche che guidano la progressione del cancro, rilevare queste rotture può essere determinante per comprendere le prime fasi della tumorigenesi. La presenza di γH2A.X nella CFS può essere utilizzata come biomarcatore per rilevare eventi precoci di instabilità genomica. Queste informazioni possono aiutare a identificare potenziali agenti cancerogeni e valutare il rischio associato all'esposizione a vari agenti estrinseci. Misurando le rotture del DNA alle CFS indotte da agenti estrinseci, la cromatina γH2A.X IP (ChIP) può fornire informazioni su come tali agenti contribuiscono ai meccanismi alla base della tumorigenesi.

Nella ChIP convenzionale (i.e., Cross-linked ChIP, X-ChIP), l'associazione di γH2A.X con le sue sequenze di DNA bersaglio è stabilizzata dalla reticolazione reversibile della formaldeide. La cromatina viene successivamente tranciata in frammenti di circa 500 coppie di basi (bp) attraverso la sonicazione e la soluzione risultante viene ripulita dai detriti mediante sedimentazione 16,17,18. Un anticorpo γH2A.X di grado ChIP viene quindi aggiunto alla frazione di cromatina eliminata, seguito dall'aggiunta di perle di agarosio di proteina A/G per arricchire le regioni di cromatina legate a γH2A.X 16,17,18. I complessi immunitari (cioè perline-anticorpo-complesso di DNA mirato al γH2A.X) vengono lavati più volte con tamponi di lavaggio rigorosi per rimuovere i frammenti di DNA non specificamente legati 16,17,18. Dopo il lavaggio, il DNA specificamente legato viene eluito dai complessi immunitari. I legami incrociati della formaldeide vengono quindi invertiti, seguiti dalla digestione delle proteine utilizzando la proteinasi K, dopodiché il DNA arricchito viene purificato e concentrato 16,17,18. Per valutare le regioni associate a γH2A.X, viene utilizzata la PCR, la PCR quantitativa (qPCR) o il sequenziamento diretto 16,17,18. L'occupazione di γH2A.X in regioni specifiche, come la CFS, è determinata dall'intensità del segnale PCR o qPCR, che è proporzionale alla quantità di γH2A.X legata in quella posizione, fornendo informazioni sul danno al DNA sito-specifico e sugli eventi di riparazione 16,17,18.

Nonostante sia un potente approccio sperimentale, l'X-ChIP presenta diverse limitazioni significative: (i) richiede un gran numero di cellule, tipicamente nell'intervallo da 1 x 107 a 5 x 107, a causa dell'inefficienza della precipitazione degli anticorpi associata alla fissazione, che aumenta il costo complessivo dell'esperimento19; (ii) il processo di inversione dei legami incrociati della formaldeide e la successiva purificazione del DNA richiede tempo e lavoro, rendendo difficile mantenere la coerenza e l'affidabilità dei risultati; e (iii) le interazioni γH2A.x-DNA con minore significato funzionale potrebbero non essere distinte da quelle con maggiore significato perché la fase di cross-linking può stabilizzare le interazioni transitorie, portando al rilevamento di interazioni che potrebbero non essere biologicamente rilevanti19.

L'immunoprecipitazione nativa della cromatina (Native ChIP o N-ChIP) è una tecnica biochimica essenziale utilizzata per studiare le interazioni proteina-DNA all'interno del loro contesto nativo di cromatina in condizioni fisiologiche di sale. È stato determinante nel chiarire l'organizzazione spaziale e temporale della cromatina, il legame dei fattori di trascrizione e le modificazioni degli istoni. La ChIP nativa ha un ruolo di lunga data nel campo più ampio della biologia della cromatina e dell'epigenetica, fornendo vantaggi e limitazioni unici rispetto alla X-ChIP. Questo metodo, introdotto alla fine degli anni '8020, prevede l'isolamento della cromatina dalle cellule con metodi che ne preservano la struttura nativa, come la digestione con nucleasi micrococcica (MNase)21. Ciò preserva i contatti intrinseci proteina-DNA e istone-DNA, il che rende la ChIP nativa particolarmente adatta per studiare le modificazioni istoniche e il posizionamento dei nucleosomi nel loro ambiente naturale della cromatina22. Studi Native ChIP ad alta risoluzione hanno dimostrato l'uso della digestione MNasi per ridurre la cromatina a singoli nucleosomi, il che facilita la mappatura delle modificazioni istoniche con maggiore precisione23. Inoltre, poiché non è coinvolta alcuna reticolazione chimica, il rischio di introdurre distorsioni o artefatti che potrebbero travisare le interazioni proteina-DNA è ridotto al minimo24.

A differenza di X-ChIP, in cui la formaldeide o altri agenti reticolanti vengono utilizzati per correggere le interazioni proteina-DNA, la ChIP nativa fornisce una visione più realistica della cromatina evitando potenziali artefatti di reticolazione. Tuttavia, mentre la X-ChIP è generalmente più adatta per rilevare interazioni transitorie o dinamiche tra il DNA e le proteine regolatorie25, la ChIP nativa è ideale per interazioni stabili proteina-DNA, come gli istoni o altre proteine legate alla cromatina 26,27. Una delle limitazioni notate per Native ChIP è l'incapacità di catturare eventi di legame a bassa affinità o transitori, che sono spesso stabilizzati attraverso il cross-linking in X-ChIP25.

Un corpus significativo di lavori in epigenetica ha sfruttato la ChIP nativa per scoprire le modificazioni istoniche in diversi contesti biologici28. Questi sforzi sono stati cruciali nella definizione del codice istonico, il modello di modificazioni istoniche che regolano l'espressione genica e la dinamica della cromatina29. Sebbene H2A. X è un istone linker meno fortemente associato, l'H2A nativo. Il metodo X ChIP è stato applicato con successo nelle cellule staminali embrionali30. In questo studio, abbiamo ottimizzato una procedura di estrazione della cromatina per eseguire la ChIP nativa di γH2A.X in cellule 293T umane (Figura 1). L'idrossiurea e l'afidicolina sono ampiamente utilizzate nella ricerca per studiare lo stress da replicazione del DNA, il danno e l'instabilità genomica31. In questo studio, questi agenti sono stati applicati alle cellule per indurre lo stress di replicazione e generare rotture del DNA alla CFS.

Utilizzando materiale di partenza di circa 1 x 106 a 5 x 106 cellule, questo metodo può essere suddiviso in quattro fasi principali: (i) frazionamento subcellulare per isolare la cromatina, (ii) digestione della nucleasi micrococcica (MNasi) per frammentare la cromatina, (iii) immunoprecipitazione ed eluizione e (iv) analisi del DNA mediante PCR quantitativa (qPCR). L'esecuzione di ChIP dopo il frazionamento subcellulare offre diversi vantaggi ed è stata ben documentata in numerosi studi 32,33,34,35. Questo approccio consente la rimozione delle proteine non legate alla cromatina e di altri detriti cellulari, ottenendo una frazione di cromatina altamente purificata. Isolando la cromatina prima dell'immunoprecipitazione, il frazionamento subcellulare aiuta a mantenere le interazioni con la cromatina nativa e riduce il rumore di fondo delle proteine non associate alla cromatina, il che porta a risultati più specifici e affidabili, poiché solo i complessi legati alla cromatina vengono conservati per l'analisi. Inoltre, il frazionamento subcellulare consente condizioni più blande per la digestione della cromatina, preservando così le interazioni fisiologiche proteina-DNA e offrendo una rappresentazione più accurata della dinamica della cromatina all'interno dell'ambiente cellulare nativo.

L'utilizzo della ChIP nativa di γH2AX per misurare l'impatto degli agenti estrinseci sulla rottura di siti fragili comuni ha un potenziale significativo per la ricerca sul cancro. Questa tecnica consente di rilevare i danni al DNA indotti dall'esposizione ad agenti cancerogeni ambientali, fornendo informazioni sui meccanismi molecolari attraverso i quali gli inquinanti contribuiscono all'instabilità genomica e allo sviluppo del cancro. Preservando il contesto nativo della cromatina, questo metodo facilita la valutazione accurata dei modelli di danno al DNA associati all'esposizione ad agenti cancerogeni, aiutando nella valutazione dei rischi ambientali e nello studio della tumorigenesi causata dall'inquinamento.

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Protocollo

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1. Raccolta di cellule

  1. Seminare circa 5 x 105 cellule HEK 293T in ciascuna delle quattro piastre da 6 cm, ciascuna contenente 4 mL di terreno DMEM completo.
  2. Dopo 24 ore, trattare una piastra con 2 μL di 1 mM di afidicolina (fare riferimento alla Tabella dei materiali) soluzione madre (concentrazione finale di 0,5 μM) e un'altra piastra con 20 μL di 1 M idrossiurea (fare riferimento alla Tabella dei materiali) soluzione madre (concentrazione finale di 5 mM) per indurre lo stress di replicazione. Aggiungere il DMSO ai due piatti rimanenti per fungere da controlli.
  3. Dopo 24 ore di trattamento, eliminare il terreno di coltura. Una piastra da 6 cm produce tipicamente circa 2 x 106 celle al 60%-70% di confluenza.
  4. Sciacquare ogni piatto 2 volte con 5 ml di 1x PBS ghiacciato. Utilizzare raschietti per staccare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in quattro provette singole da 1,5 mL. Pipettare delicatamente su e giù con una pipetta P1000 per dissociare eventuali grumi di cellule.
  5. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi eliminare il surnatante. Metti le celle sul ghiaccio.

2. Frazionamento subcellulare

  1. Risospendere il pellet cellulare in 500 μl di tampone A freddo appena preparato (fare riferimento alla Tabella 1), garantendo la completa dissociazione dei grumi cellulari mediante pipettaggio delicato.
  2. Incubare i lisati su ghiaccio per 5-10 minuti. Controllare la progressione della lisi al microscopio per assicurarsi che la lisi cellulare sia completa.
    1. Prelevare una piccola aliquota di lisato (circa 5 - 10 μL) e posizionarla su un vetrino da microscopio pulito. Coprilo con un vetrino coprioggetti per evitare contaminazioni.
    2. Utilizzare un microscopio ottico con un ingrandimento appropriato (ad es. 20x - 40x) per visualizzare cellule o detriti. Confrontare con un campione di controllo non lisizzato per distinguere tra cellule intatte e materiale lisato.
      NOTA: Un campione correttamente lisato non avrà contorni cellulari distinti, solo cromatina diffusa o materiale cellulare. Regolare la messa a fuoco per osservare chiaramente il lisato. Se necessario, applicare una forza meccanica durante la fase di lisi, ad esempio utilizzando un omogeneizzatore Dounce, quando si lavora con determinati tipi di cellule.
  3. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, una volta che le cellule sono completamente lisate. Eliminare con cautela il surnatante. Risospendere il pellet di nuclei in 500 μl di tampone A freddo utilizzando puntali per pipette a orifizio largo.
    NOTA: Le punte a orifizio largo aiutano a ridurre al minimo le forze di taglio e proteggono campioni delicati come la cromatina. Realizza punte a foro largo tagliando l'estremità delle punte standard con una lama affilata.
  4. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C. Eliminare con cautela il surnatante.
  5. Preriscaldare l'incubatore a 37 °C e preparare un tampone di arresto (100 mM EDTA, pH 8,0; Tabella 1).
  6. Ottimizzare in anticipo le concentrazioni di nucleasi micrococcica (MNase, fare riferimento alla tabella dei materiali) e i tempi di incubazione.
    1. Dividere 40 μL di campione di cromatina in diverse aliquote uguali per testare diverse concentrazioni di MNasi e tempi di incubazione.
    2. Utilizzare un intervallo di concentrazioni di MNasi (ad esempio, 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U per reazione) e testare più tempi di incubazione (ad esempio, 2, 5, 10 e 15 minuti).
    3. Aggiungere il tampone MNasi (fare riferimento alla Tabella 1) contenente varie concentrazioni di MNasi alle aliquote della cromatina e incubare i campioni a 37 °C per i tempi specificati.
    4. Terminare la reazione aggiungendo 1/4 di volume di tampone di arresto (concentrazione finale: 20 mM EDTA) immediatamente dopo il tempo di incubazione desiderato.
    5. Isolare il DNA dai campioni di cromatina digeriti utilizzando un metodo di estrazione fenolo/cloroformio/alcol isoamilico.
    6. Eseguire il DNA estratto su un gel di agarosio all'1,5% per visualizzare i modelli di digestione: la sottodigestione mostrerà bande di peso molecolare elevato (Figura 2, corsia 1-4); l'eccessiva digestione si tradurrà in uno striscio o in frammenti molto corti (Figura 2, corsia 6-8) e una digestione ottimale produrrà un chiaro schema a scala nucleosomica (Figura 2, corsia 5, ad es. mono-, di-, tri-nucleosomi).
    7. Identificare le condizioni che producono la risoluzione nucleosomica desiderata senza un'eccessiva sovradigestione.
      NOTA: CaCl2 agisce come cofattore per l'attività della MNasi. Ottimizza la digestione regolando la concentrazione di CaCl2 tra 1 mM e 5 mM.
  7. Risospendere delicatamente i nuclei intatti con 100 μl di tampone MNase pipettandoli 5-10 volte con puntali a orifizio largo. Aggiungere immediatamente la quantità predeterminata di MNasi ai campioni (1,25 U MNasi/100 μL di tampone MNasi).
    NOTA: Quando si lavora con più campioni, digerire ciascuno singolarmente per evitare una digestione eccessiva.
  8. Posizionare le provette su un rotatore e incubare per 5 minuti a 37 °C. Rimettere immediatamente le provette nel ghiaccio e terminare la digestione della MNasi aggiungendo EDTA a una concentrazione finale di 20 mM e mescolare a vortici.
  9. Aggiungere 500 μl di tampone B (fare riferimento alla Tabella 1) a ciascun campione e mescolare accuratamente pipettando su e giù 5x - 10x. Solubilizzare le proteine incubandole su ghiaccio per 5 minuti.
    NOTA: Il sale e il detergente nel tampone B aiutano a dissociare le proteine deboli legate alla cromatina ed espongono gli epitopi all'immunoprecipitazione.
  10. Pellettare il materiale insolubile centrifugando alla massima velocità per 5 min a 4 °C. Trasferire il surnatante trasparente in nuove provette da 1,5 mL etichettate come frazione nativa della cromatina. I campioni possono essere conservati a -80 °C o utilizzati per convalidare l'efficienza della frammentazione della cromatina.
    NOTA: Evitare frequenti cicli di gelo-disgelo, in quanto potrebbero interrompere le interazioni proteina-DNA di interesse. Ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo quando possibile.

3. Verifica della frammentazione della cromatina

  1. Aliquotare 10 μl di surnatante da ciascun campione in una nuova provetta da 1,5 mL. Miscelare con 20 μl di acqua distillata e 30 μl di fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25:24:1).
  2. Chiudere bene i tubi e vorticare energicamente per 15-30 s. Centrifugare a 20.000 x g (o la velocità massima della centrifuga) per 10 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, si osserveranno tre strati distinti: uno strato superiore chiaro, uno strato intermedio bianco e uno strato inferiore giallo.
  3. Trasferire con cautela 20 μl della fase acquosa superiore (contenente DNA) in una provetta nuova. Separare il DNA purificato in gel di agarosio all'1,5% per 30 minuti a 100 V e visualizzare i modelli di digestione. Assicurarsi che la dimensione dei frammenti di cromatina sia principalmente compresa tra 200 e 1000 coppie di basi.
    NOTA: Le dimensioni corrette dei frammenti di cromatina sono fondamentali per il successo della ChIP nativa e dipendono dalle condizioni di trattamento con MNasi, comprese le unità enzimatiche, il tempo di incubazione e la concentrazione di CaCl2. L'efficienza della digestione della MNasi può anche variare in base al tipo e al numero di cellule. Il modello di frammentazione della cromatina mostrato nella Figura 2 (corsia 5) è raccomandato per questo test ChIP.

4. Immunoprecipitazione

  1. Aliquotare 20 μl di cromatina digerita da ciascun campione in una provetta fresca da 1,5 mL e miscelare con 180 μl di tampone di eluizione (fare riferimento alla Tabella 1). Etichettare queste provette come campioni di ingresso e conservarle a -20 °C.
  2. Trasferire 400 μL di campione di cromatina in un'altra provetta da 1,5 mL per ChIP.
  3. Aggiungere l'anticorpo γH2A.X (fare riferimento alla Tabella dei materiali) a un campione trattato con DMSO, a un campione trattato con afidicolina e a un campione trattato con idrossiurea. Aggiungere la stessa quantità di IgG normale (fare riferimento alla Tabella dei materiali) a un altro campione trattato con DMSO come controllo negativo per il test ChIP.
    NOTA: In questo caso, 1 μg di anticorpo primario viene tipicamente utilizzato per 400 μL di cromatina (ovvero, la concentrazione finale dell'anticorpo è di 2,5 μg/mL). Tuttavia, la quantità ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente per diversi anticorpi γH2A.X.
  4. Posizionare le provette ChIP su un rotatore a 4 °C e incubare per almeno 5 ore, preferibilmente durante la notte.
  5. Nel frattempo, aliquotare 100 μL di perle di proteina magnetica A/G di grado ChIP (fare riferimento alla Tabella dei materiali) in una nuova provetta da 1,5 mL. Utilizzare puntali a orifizio largo e pipettare lentamente per garantire una misurazione accurata delle perline. Posizionare il tubo su un supporto magnetico per almeno 1 minuto, quindi scartare con cura il liquido.
  6. Risospendere le perle in 1 mL di 1x PBS contenente lo 0,5% di BSA. Ruotare a 4 °C per circa 4 ore. Posizionare il tubo su un supporto magnetico per almeno 1 minuto ed eliminare il surnatante.
  7. Lavare nuovamente le perle con 1 mL di 1x PBS contenente lo 0,5% di BSA. Posizionare il tubo sul supporto magnetico per 1 minuto per pellettare le perline magnetiche, quindi scartare il surnatante.
    NOTA: I passaggi da 4.5 a 4.7 sono il pre-rivestimento delle perle per ridurre il legame non specifico degli anticorpi alle microsfere magnetiche.
  8. Risospendere le perle pre-rivestite in 100 μL di Buffer B utilizzando punte a orifizio largo. Aggiungere 25 μl della sospensione di biglie magnetiche pre-rivestite a ciascuna provetta per campioni ChIP. Ruotare a 4 °C per 2 ore.
  9. Posiziona i tubi ChIP sul supporto magnetico e attendi che le perle siano completamente attaccate al lato del tubo e che la soluzione diventi limpida.
  10. Scartare il surnatante trasparente senza disturbare le microsfere magnetiche. Risospendere le perle con 1 mL di tampone di lavaggio (fare riferimento alla Tabella 1) e ruotare a 4 °C per 10 minuti.
  11. Riposizionare le provette sul supporto magnetico e attendere che la soluzione diventi limpida. Eliminare il tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio per un totale di quattro lavaggi.
  12. Eliminare il tampone di lavaggio dopo il lavaggio finale e centrifugare brevemente le provette a 400 x g per 30 s a 4 °C per eliminare il liquido residuo. Riposizionare i tubi sul supporto magnetico e rimuovere con cautela il liquido rimanente dal fondo del tubo.

5. Eluizione e precipitazione del DNA

NOTA: L'efficienza degli anticorpi può variare tra i diversi lotti. È importante confermare l'affinità di legame di un nuovo anticorpo controllando i campioni immunoprecipitati attraverso l'analisi Western blot.

  1. Verificare l'efficienza di pull-down degli anticorpi ChIP utilizzando Western blot (WB) come descritto di seguito.
    1. Prelevare una piccola aliquota del campione di ChIP per l'analisi (cioè, di solito il 10% del campione di ChIP). Includi la cromatina in ingresso (pre-immunoprecipitazione) e il controllo negativo (ad es. pull-down delle IgG) per il confronto.
    2. Eluire le proteine dalle microsfere legate agli anticorpi riscaldandole in 20 μL di 1 tampone di caricamento SDS-PAGE (fare riferimento alla Tabella dei materiali) a 95 °C per 5 minuti.
    3. Caricare i campioni IP, l'input e i controlli su un gel SDS-PAGE al 15%. Esegui il gel.
    4. Trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa da 0,2 μm (fare riferimento alla tabella dei materiali) o PVDF utilizzando un sistema di trasferimento umido o semi-secco.
    5. Bloccare la membrana con latte scremato al 5% o BSA in TBST (fare riferimento alla Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente per evitare legami aspecifici.
    6. Incubare la membrana con l'anticorpo primario contro il γH2A.X (fare riferimento alla Tabella dei materiali) diluito in tampone bloccante per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
    7. Lavare la membrana 3 volte con TBST per rimuovere gli anticorpi non legati. Incubare la membrana con un anticorpo secondario coniugato con HRP (fare riferimento alla Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare nuovamente la membrana per rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso.
    8. Sviluppare la membrana utilizzando un substrato chemiluminescente e visualizzare il segnale con un imager. Confrontare l'intensità del segnale tra l'IP, le corsie di ingresso e di controllo per valutare l'efficienza e la specificità del pull-down.
      NOTA: Una banda corrispondente alla proteina bersaglio nella corsia IP conferma il successo del pulldown dell'anticorpo. Questo approccio garantisce la possibilità di valutare l'efficacia dell'anticorpo nella cattura della proteina bersaglio durante l'esperimento ChIP.
  2. Aggiungere 50 μl di tampone di eluizione (fare riferimento alla Tabella 1) a ciascuno dei campioni ChIP rimanenti. Posizionare i tubi su un termomixer e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  3. Posizionare i tubi sul supporto magnetico per almeno 1 minuto. Raccogliere l'eluito in nuove provette. Ripetere 1 volta e raccogliere l'eluito nelle stesse provette.
  4. Aggiungere altri 100 μl di tampone di eluizione a ciascun campione di eluizione ChIP e 180 μl di tampone di eluizione a ciascun campione di input.
  5. Aggiungere 200 μL di fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25:24:1) a ciascun campione e agitare energicamente. Centrifugare i campioni a 20.000 x g (o velocità massima) per 10 minuti a 4 °C.
  6. Aggiungere 19 μL di acetato di sodio 3M (NaOAc, pH 5,2; fare riferimento alla Tabella 1) e 2 μL di soluzione di glicogeno (20 mg/mL, fare riferimento alla Tabella dei materiali) a ciascuna nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL.
  7. Dopo la centrifugazione, trasferire con cautela lo strato acquoso superiore (circa 190 μL) nelle provette contenenti NaOAc e glicogeno e mescolare mediante vortex.
  8. Aggiungere 500 μl di etanolo al 100% e vortex. Far precipitare il DNA incubando i campioni a -20 °C per almeno 2 ore o durante la notte.
  9. Centrifugare le provette a 20.000 x g (o velocità massima) per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pallino bianco. Risospendere il pellet in 1 mL di etanolo al 70% e agitare accuratamente.
  10. Centrifugare le provette a 20.000 x g (o alla velocità massima) per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante. Centrifugare brevemente le provette per eliminare l'etanolo residuo. Rimuovere con cautela l'etanolo utilizzando una pipetta P20. Asciugare all'aria i pellet di DNA per 2-3 minuti.
    NOTA: Evitare di asciugare eccessivamente il pellet, in quanto ciò può rendere difficile la ridissoluzione del DNA.
  11. Per i campioni di ChIP, risospendere il DNA in 400 μL di tampone TE (fare riferimento alla Tabella 1). Per il DNA in ingresso, risospendere in 1000 μL di tampone TE. I campioni eluiti possono ora essere conservati a -20°C.

6. Quantificazione qPCR

  1. Eseguire la qPCR utilizzando un kit commerciale (fare riferimento alla Tabella dei materiali) con triplicati tecnici per ogni campione. Confermare la presenza di un singolo prodotto specifico per PCR conducendo un'analisi della curva di fusione per garantire la specificità dell'amplificazione36.
  2. Analisi dei dati
    NOTA: Nell'analisi di quantificazione relativa, il campione di prova è espresso come variazione di piega rispetto a un campione di controllo (immunoprecipitato utilizzando IgG purificate normali o IP simulato). I loci del DNA noti per essere non occupati dalla proteina immunoprecipitata (locus negativo) possono essere utilizzati in questo modo come gene di riferimento rispetto ai loci del DNA di controllo positivo noti, occupati36.
    1. Calcola la percentuale di input per ogni ChIP utilizzando la formula seguente
      %Input = 2(-ΔCt [ChIP normalizzato])
    2. Normalizzare i valori ΔCt del locus positivo in locus negativo (ΔΔCt) sottraendo il valore ΔCt ottenuto per il locus positivo dal valore ΔCt per il locus negativo utilizzando la formula seguente
      (ΔΔCt = ΔCtpositivo - ΔCtnegativo)
    3. Calcolare l'arricchimento del ripiegamento della sequenza del locus positivo nel DNA ChIP rispetto al locus negativo utilizzando la formula seguente
      Arricchimento delle pieghe =2ΔΔCt
      Le sequenze dei primer qPCR utilizzati per l'analisi sono fornite nella Tabella 2. L'organizzazione genomica di FRA3B e FRA16D37è illustrata in Figura 3A, B.
  3. Analisi statistica
    1. Analizza i risultati statisticamente utilizzando il test t accoppiato di Student. Un valore p di ≤0,05 è considerato statisticamente significativo, indicando che è improbabile che le differenze osservate siano dovute alla variazione casuale38.

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dai finanziamenti per le startup dell'Università della Cina meridionale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ M membrana in nitrocellulosaAmersham10600011
Actina BProteinTech20536-1-AP
AfidicolinaMedChemExpressHY-N6733
Perle magnetiche A / G di proteina di grado ChIPThermoFisher26162
Substrato ECL occidentale ClarityBio-Rad#1705061
Glicogeno di grado di biologia molecolareThermoFisherGatto. No. R0561
Anticorpo secondario coniugato HRP ProteinTechSA00001-2
idrossiurea MedChemExpressHY-B0313
Nucleasi micrococcicaNEBCodice: M0247S
IgG normaliSanta CruzSC-2025
Taq Universale SYBR Verde Supermix BioRad1725120
γ H2A. Anticorpo X  (per ChIP)Sigma-Aldrich05-636
γ H2A. Anticorpo X (per WB)Segnalazione cellulare#25955

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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