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Articolo metodologico

Mappatura meccanica degli sferoidi tramite spettroscopia di Brillouin

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DOI:

10.3791/67538

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12 dicembre 2025

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1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo per la caratterizzazione meccanica degli sferoidi viventi all'interno di una matrice 3D utilizzando la microspettroscopia di Brillouin. Questo metodo completamente ottico consente la visualizzazione degli sferoidi con risoluzione in scala microscopica e proprietà meccaniche quantitative. Questo approccio ha implicazioni per il fenotiping meccanico; ad esempio, determinare stati patologici degli sferoidi tumorali all'interno di un microambiente 3D.

Abstract

La spettroscopia di Brillouin, una tecnica emergente che sta suscitando un notevole interesse nelle scienze biomediche, consente ai ricercatori di raccogliere informazioni relative alla meccanica e alla struttura esaminando le proprietà viscoelastiche e architettoniche dei campioni in modo non distruttivo e senza contatto. Questo approccio valuta le proprietà meccaniche dei campioni 3D misurando l'interazione della luce visibile con le onde acustiche termicamente indotte/fononi. Le informazioni fornite dalla spettroscopia di Brillouin hanno potenziale per la valutazione in vivo della biofisica e la diagnosi potenziale di patologie patologiche. Un vantaggio significativo della spettroscopia di Brillouin è la capacità di valutare la meccanica su scala microscopica all'interno di un campione biologico; altre tecniche convenzionali che possono raggiungere questa risoluzione, come la microscopia a forza atomica, possono sondare campioni solo in 2D poiché richiedono un contatto diretto. Questo lavoro descrive l'applicazione della microspettroscopia di Brillouin per indagare la biomeccanica degli sferoidi viventi incorporati in una matrice idrogel 3D. L'incapsulamento degli sferoidi cellulari all'interno di un microambiente 3D stabilisce un sistema sferoideo che riproduce da vicino l'interfaccia tra cellule e matrice extracellulare in vivo. Nel nostro protocollo, descriviamo la preparazione del campione sferoideo e le misurazioni degli spettri di Brillouin con immagini sequenziali a fluorescenza. Inoltre, discutiamo procedure per l'analisi dei dati spettrali e dettagli tecnici sul sistema ottico.

Introduzione

La coltivazione delle cellule in modelli 3D è vantaggiosa rispetto ai metodi tipici di coltura cellulare 2D, poiché riproduce meglio le strutture tissutali e le interazioni cellula-cellula presenti in vivo. Gli sferoidi sono aggregati cellulari 3D che facilitano complesse interazioni cellula-cellula; Queste interazioni sono compromesse nelle cellule coltivate come monostrato su plastica in coltura tissutale. Gli sferoidi possono essere coltivati all'interno di un'impalcatura che imita il microambiente da cui la cellula ha avuto origine. Ad esempio, gli idrogel sono un biomateriale popolare utilizzato per la coltivazione di cellule/sferoidi poiché permettono un controllo preciso di parametri come rigidità, degradabilità, dimensione dei pori e l'incorporazione di fattori di crescita1 (Figura 1A). I segnali meccanici spesso precedono i cambiamenti biochimici nelle patologie patologiche come il cancro e lafibrosi 2,3, pertanto acquisire la firma biomeccanica in modelli 3D clinicamente rilevanti delle malattie è fondamentale per sviluppare interventi diagnostici che informino la pratica terapeutica e comprendano la fisiopatologiasottostante 4.

La microscopia di Brillouin (BM) è una tecnica di imaging che permette di misurare le proprietà meccaniche dei materiali biologici neipiani 2D 5,6,7. La BM presenta alcuni vantaggi chiave rispetto ad altri metodi più comunemente utilizzati, come la microscopia a forza atomica (AFM) ed elastografia. È ben documentato che l'AFM può raggiungere un'elevata risoluzione meccanica spaziotemporale e che l'elastografia può sondare la meccanica all'interno deicampioni 8,9. La BM non richiede un contatto diretto con il materiale oggetto di studio, rendendola una tecnica ideale rispetto all'AFM per campioni/cellule difficili da raggiungere, come gli sferoidi all'interno degli idrogel. Un altro vantaggio chiave della BM è che non richiede l'etichettatura dei campioni e può fornire una risoluzione su scala microscopica all'interno di campioni biologici, cosa che i metodi di elastografia comunemente usati non possono raggiungere7; Tecniche di elassografia ottica più avanzate possono funzionare a risoluzionemicroscala 10. Va notato che la risoluzione effettiva precisa nell'imaging di Brillouin di campioni biologici eterogenei non è facile da definire. Innanzitutto, per una data lunghezza d'onda di illuminazione, dipende dalle proprietà ottiche che descrivono la dimensione del punto focale (apertura numerica, NA, dell'opacità dell'obiettivo e del campione). Inoltre, la precisione con cui si possono sondare le proprietà meccaniche del campione, così come la forma dello spettro di Brillouin, è influenzata dalle caratteristiche acustiche del materiale (lunghezza d'onda del fonone e lunghezza di propagazione)11,12. Il fenomeno alla base della spettroscopia di Brillouin è la diffusione di Brillouin, in cui la luce laser monocromatica incidente interagisce con fononi acustici spontanei e termicamente indotti all'interno del mezzo biologico. Questo provoca una diffusione inelastica della luce e (spostamento di frequenza di Brillouin, BFS) nella Figura 1B ed è tipicamente dell'ordine di diversi GHz e, a seconda che il fotone perda o guadagni energia, i picchi di Brillouin Stokes e anti-Stokes vengono rilevati rispettivamente nello spettro della luce diffusa. Attraverso la sua dipendenza dalla velocità locale del suono nel mezzo, il BFS è collegato al modulo longitudinale elastico, che a sua volta è empiricamente correlato al modulo di Young 7,13; tuttavia, bisogna prestare attenzione nel confronto tra questi moduli poiché (i) non sono direttamente correlati tra loro, (ii) il modulo di Young è solitamente nell'intervallo Pa-kPa per campioni biologici e materia molle mentre il modulo longitudinale ottenuto da Brillouin è nell'intervallo GPa, e (iii) parametri come le variazioni dell'indice di rifrazione e la densità del materiale devono essereconsiderati 7. La larghezza di linea di Brillouin (nella Figura 1B) è un'altra misura ottenuta da BM. È collegato al modulo di perdita longitudinale, fornendo informazioni sulla viscosità del campione; Queste proprietà possono essere correlate con laviscoelasticità 14. Così, BM consente la valutazione delle proprietà viscoelastiche, dove un BFS più grande implica un materiale più rigido, e una larghezza di linea maggiore implica un materiale più viscoso (Figura 1B). Va notato che la diffusione elastica (di Rayleigh), in cui i fotoni non subiscono uno spostamento di frequenza, ha una probabilità significativamente maggiore di verificarsi rispetto alla diffusione di Brillouin. Pertanto, gli spettrometri di Brillouin devono essere equipaggiati per sopprimere il segnale di Rayleigh.

La BM è stata utilizzata per caratterizzare le proprietà meccaniche di vari tessuti, biomateriali e modelli di coltura cellulare 3D. Ad esempio, la BM è stata utilizzata per differenziare tra melanoma e tessuto sano circostante, mostrando che il tessuto non canceroso era significativamente più morbido rispetto almelanoma 15. Rad et al. hanno dimostrato che l'aumento della concentrazione polimerica degli idrogel ha portato a un aumento del BFS e della larghezza delle linee. Alle concentrazioni più basse di polimeri, gli idrogel con cellule mostravano diminuzioni maggiori nei cambiamenti di frequenza di Brillouin in sette giorni rispetto agli idrogel vuoti, che si proponeva fosse dovuta al rimodellamento cellulare dell'idrogel. Questo non è stato osservato a una concentrazione del polimero del 10%, il che ha sottolineato una possibile mancanza di vitalità cellulare riscontrata in questiidrogel.

Di maggiore rilevanza per il presente studio, BM è stato utilizzato per indagare le proprietà meccaniche degli sferoidi 17,18,19,20. In particolare, l'effetto del microambiente locale sulla meccanica degli sferoidi può essere rilevato utilizzando BM20. Rispetto agli sferoidi tumorali coltivati in idrogel docili, gli sferoidi coltivati in idrogel rigidi hanno mostrato un BFS più elevato, indicativo di un aumento del moduloelastico 20. La variazione spaziale delle proprietà meccaniche all'interno di uno sferoide può essere caratterizzata anche con BM. Ad esempio, è stato riscontrato che il BFS degli sferoidi tumorali aumenta verso il nucleo sferoideo20,21. Inoltre, una diminuzione del BFS è correlata a un aumento dell'invasività degli sferoiditumorali 20. La BM è stata utilizzata per indagare i cambiamenti meccanici degli sferoidi tumorali in risposta allo shockosmotico 22. Nello studio, la crescita degli sferoidi è stata monitorata in 5 giorni, rilevando che le differenze meccaniche iniziali tra il cancro e gli sferoidi sani osservate con la sfera sanace sono andate perse nel tempo. Un altro studio ha rilevato un aumento della BFS dello sferoide dopo 7 giorni, attribuito all'aumento della dimensione dello sferoide e del numero dicellule 16.

Inoltre, sono state condotte indagini multimodali, che impiegano microscopia di Brillouin insieme a AFM e reologia, per indagare le proprietà meccaniche di cellule e idrogel 16,23,24. Rad et al. hanno utilizzato la reologia per contestualizzare le tendenze misurate con BM, stabilendo una forte correlazione positiva tra il modulo longitudinale e il modulo di taglio di stoccaggio rispetto alla concentrazione polimerica degli idrogel16. La microscopia Brillouin e la micro-reologia ottica a pinzetta sono state utilizzate per misurare la meccanica delle cellule tumorali coltivate in idrogel3D 23. In questo studio è stata riscontrata una diminuzione dell'eterogeneità meccanica tra le cellule degli sferoidi rispetto a quelle singole coltivate sospese negli idrogel.

In questo lavoro viene descritto un protocollo per indagare le proprietà meccaniche degli sferoidi vivi incorporati negli idrogel con un microscopio Brillouin commerciale (Figura 1). Berghaus et al. descrissero un protocollo che dettagliava i passaggi per costruire uno spettrometro Brillouin ad alta risoluzione e un metodo per calibrarlo con materialidi riferimento 25. Inoltre, un protocollo di Shi et al. descrive l'uso della microscopia Brillouin per monitorare i cambiamenti nelle proprietà meccaniche del tessutoembrionale 26. Utilizziamo sferoidi delle cellule staminali mesenchimali (MSC) nei poli(etile) glicole (PEG)-maleimide idrogel per imitare la nicchia del midollo osseo e indagare le proprietà meccaniche di questo ambiente. Questo modello 3D ha il potenziale di scoprire la firma meccanica delle malattie del midollo osseo, tra cui leucemia, mieloma multiplo e tumore osseo secondario. Il protocollo è quindi direttamente trasferibile a modelli 3D di altre malattie in cui la meccanobiologia interrotta può avere un ruolo importante nella patologia. Sono dettagliate le tecniche di preparazione degli sferoidi e idrogel, dell'imaging a fluorescenza e della microscopia Brillouin. Vengono discusse le procedure raccomandate, i possibili svantaggi e i potenziali miglioramenti della tecnica. La descrizione dettagliata dell'allestimento sperimentale è presentata nella Figura S1 e nella sezione Materiali Supplementari e Metodi relativi all'allestimento sperimentale.

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Protocollo

1. Coltura cellulare 2D

NOTA: Quando possibile, assicurarsi che tutto il lavoro di coltura cellulare avvenga in un ambiente sterile utilizzando un cappuccio a flusso laminare standard per coltura tissutale per evitare contaminazioni. Le MSC sono state utilizzate nel protocollo attuale, ma altri tipi cellulari possono essere utilizzati per creare sferoidi, a seconda degli obiettivi specifici dello studio.

  1. Coltivare le MSC nel mezzo di coltura cellulare Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, con volume sufficiente a coprire le cellule, contenente 4,5 g/L di D-glucosio, + L-Glutammina integrata con siero bovino fetale al 10% (FBS), 100 μM piruvato di sodio, 1% di amminoacidi non essenziali (NEAA), 1% di penicillina e streptomicina. Incubare le cellule a 37 °C e 5% diCO2.
  2. Cellule del passaggio con confluenza del 70-80%, incubando con acido etiledidiaminatetraacetico allo 0,05% (EDTA) (il volume di tripsina aggiunto dovrebbe essere 1/3 del volume DMEM) per 3 minuti a 37 °C e il 5% diCO2 per staccare le cellule dalla placca. Per fermare la reazione, aggiungi un substrato di coltura contenente FBS (almeno in corrispondenza con il volume della tripsina aggiunta). Contare le cellule usando un emocitometro.

2. Preparazione degli sferoidi

NOTA: Quando possibile, assicurarsi che tutto il lavoro di coltura cellulare avvenga in un ambiente sterile utilizzando un cappuccio a flusso laminare standard per coltura tissutale per evitare contaminazioni. In questo studio, le piastre micropozzi sono state utilizzate per creare sferoidi MSC. Queste piastre sono composte da 24 pozzi, ciascuno contenente 1200 micropozzi, con un diametro di 400 μm. Ciò consente la preparazione di un gran numero di sferoidi (Figura 2).

  1. Per preparare la piastra del micropozzo, pretratta i pozzi aggiungendo 500 μL di soluzione antiaderente per risciacquo a ciascun pozzo. Centrifuga a 1.300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Al microscopio con un ingrandimento di 20x, controlla se ci sono bolle d'aria. Se ci sono, ripeti il passaggio di centrifugazione. Rimuovi la soluzione antiaderente per risciacquare.
  2. Per lavare il piatto, aggiungi 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aspira. Fallo due volte per assicurarti che la soluzione per risciacquo sia stata completamente rimossa.
  3. Determina il numero di cellule per sferoide e il numero di sferoidi per gel. Questo dipenderà dalle singole domande di ricerca. Ad esempio, abbiamo usato 100 cellule per sferoide e 100 sferoidi per gel. Pertanto, per questo protocollo, era necessario un solo pozzo della piastra del micropozzo, poiché ciò crea in totale 1200 sferi. Per calcolare il numero di celle necessarie per un pozzo, abbiamo fatto il seguente calcolo: 1200 x 100 = 1,2 x 105. Calcola il volume della sospensione cellulare contenente 1,2 x 105 celle. Centrifuga la sospensione della cella a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovi il surnante.
  4. Risospendere le cellule in 1 mL di DMEM (+4,5 g/L D-Glucosio, + L-Glutammina) integrato con 100 μM di piruvato di sodio, 1% NEAA, 1% penicillina e estreptomicina. Aggiungi 1 mL di sospensione cellulare a un pozzo della piastra del micropozzo e pipetta delicatamente su e giù per disperdere le celle uniformemente in tutto il pozzo. Fai attenzione a non introdurre bolle d'aria. Centrifuga la piastra a 100 g per 3 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Al momento, non aggiungiamo FBS ai media. Questo serve a prevenire che le cellule si attaccino alla plastica della coltura tissutale.
  5. Osserva la piastra sotto il microscopio per assicurarti che le cellule siano distribuite uniformemente e siano scese sul fondo dei micropozzi. Incubare le cellule a 37 °C e 5% diCO2. Osservare la formazione degli sferoidi 24 ore dopo.
    NOTA: Gli sferoidi possono rimanere nella piastra fino a 48 ore, a seconda del tipo di cellula e della compattezza desiderata dello sferoide.
  6. Per prelevare gli sferoidi dalla placca, prima rimuovere lentamente e delicatamente il materiale di coltura, con l'obiettivo di non disturbare gli sferoidi. Per evitare che gli sferoidi si attacchino alla plastica, ricopri punte e tubi delle pipette usando PBS con FBS all'1%. Per evitare che gli sferidi si impiglino nelle punte della pipetta, taglia la punta per allargare l'apertura. Durante questi passaggi possono essere utilizzati i puntini di massimo recupero come misura aggiuntiva per prevenire la perdita degli sferoidi. Aggiungere 500 μL di PBS a ciascun pozzetto della piastra del micropozzo e pipetta su e giù per spostare gli sferoidi. Raccogliere il PBS con gli sferoidi sospesi in un tubo (Figura 2).
  7. Osserva la lastra al microscopio a un ingrandimento di 20x e ripeti questo passaggio finché la maggior parte degli sferoidi non è stata rimossa con successo.
  8. Per contare il numero di sferoidi nella sospensione, trasferire 50 μL dalla sospensione in un pozzo di una piastra a 96 pozzi. Contare il numero di sferoidi nei 50 μL. Per facilitare il conteggio, si può disegnare una croce sul fondo del pozzo con un pennarello permanente. Calcola il numero di sferoidi usando l'equazione (1):
    figure-protocol-1

3. Preparazione degli idrogel PEG

NOTA: Quando possibile, assicurarsi che tutto il lavoro di coltura cellulare avvenga in un ambiente sterile utilizzando un cappuccio a flusso laminare standard per coltura tissutale per evitare contaminazioni. In questo studio sono stati utilizzati idrogel PEG-maleimide, ma possono essere utilizzati anche altri tipi. Gli idrogel PEG-maleimide sono stati formati utilizzando la reazione di adizionetiol-Michael 27. I reticolatori utilizzati erano una miscela di PEG-ditiolo e peptide degradabile dalla proteasi, affiancata da due residui di cisteina (peptide VPM, GCRDVPMSMRGGDRCG). I gel presenti nello studio utilizzavano peptide VPM al 70% di PEG-ditiolo e al 30% di peptide VPM degradabile.

  1. Prepara una soluzione di 200 mg/mL di peptide VPM e aggiungi 2,4 μL di peptide per gel. Prepara una soluzione di brodo da 200 mg/mL di PEG-ditiolo e aggiungi 5,6 μL per gel.
  2. Sospezione riportata gli sferoidi in PBS prima di mescolare con i reticolatori (Figura 2). Mescola la sospensione sferoide con il PEG-ditiolo (5,6 μL per gel) e il VPM (2,4 μL per gel). Questa soluzione è chiamata Soluzione B.
    NOTA: In questo protocollo, sono stati aggiunti 100 sferoidi per gel.
  3. Prepara una soluzione di PEG-Maleimide da 250 mg/mL. Aggiungi 50 μg di fibronectina per gel. Mescolare la soluzione di PEG-Maleimide e fibronectina; questa è chiamata Soluzione A. Soluzione di pipette A (40,3 μL per gel da 100 μL) sul fondo di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzi. Aggiungere la Soluzione B (59,7 μL per gel da 100 μL) con un rapporto molare di 1:1 maleimide:tiolo per garantire una reticolazione completa; Assicurati che la gelificazione avvenga istantaneamente. Il volume finale degli idrogel è di 100 μL.
  4. Incubare i gel per 30 minuti a 37 °C e 5% diCO2 per permettere la gelificazione. Aggiungere un mezzo di coltura completo (DMEM integrato con FBS al 10%, piruvato di sodio a 100 μM, NEAA all'1% e 1% di penicillina e streptomicina) nel pozzo, assicurando che il gel sia completamente sommerso (Figura 2). Incubare il gel a 37 °C e 5% diCO2 fino a essere pronti a prendere le misurazioni al microscopio Brillouin.
    NOTA: La durata della coltura degli sferoidi all'interno degli idrogel prima delle misurazioni di Brillouin dipenderà dal tipo cellulare e dalla domanda di ricerca. Ad esempio, in questo studio, gli sferoidi vengono tipicamente coltivati all'interno di idrogel per un massimo di 7 giorni, durante i quali vengono monitorati tramite microscopia Brillouin. Le proprietà viscoelastiche degli idrogel con o senza incapsulamento sferoideo sono state caratterizzate e non mostrano un impatto significativo degli sferoidi sulla meccanica dei gel (Figura S2).

4. Colorazione a fluorescenza e imaging degli sferoidi negli idrogel

NOTA: In questo studio, i nuclei cellulari e i filamenti di actina che compongono il citoscheletro sono stati colorati e fotografiati con fluorescenza prima delle misurazioni di Brillouin.

  1. Per colorare l'actina, aggiungi la colorazione viva di actina al mezzo di coltura a 1 su 500 di diluizione 3 ore prima dell'imaging (imaging ). Tieni il campione fuori dalla luce avvolgendolo in un foglio stagno. Incubare il gel a 37 °C e 5% diCO2.
  2. Per colorare i nuclei, aggiungi 2 gocce/mL di colorazione nucleare viva al mezzo di coltura che circonda il gel 40 minuti prima dell'immagini. Restituite i campioni all'incubatrice.
  3. Acquisire immagini di fluorescenza il prima possibile dopo il termine del tempo di incubazione della colorazione. Verifica che il percorso ottico appropriato (esposizione della fotocamera del microscopio) e la posizione corretta della ruota del filtro siano stati selezionati. Abbassa le luci della stanza e cattura lo sfondo. Accendi la sorgente luminosa a diodo emissore di luce (LED) e scegli la lunghezza d'onda a seconda del protocollo di colorazione (qui, 385 nm venivano usati per i nuclei e 621 nm per l'imaging di actina). Acquisire immagini fluorescenti degli sferoidi a un ingrandimento di 20x con il software preferito. Spegni la sorgente LED quando hai finito.

5. Microscopia di Brillouin degli sferoidi

  1. Accensione dei dispositivi ed emissione laser
    1. Accendi i dispositivi: computer, spettrometro, telecamere del microscopio, microscopio, ventola di raffreddamento laser ed emissione laser attivando la chiave del controller. Assicurati che questo avvenga 15 minuti prima dell'ottimizzazione dello spettrometro per assicurarti che il laser sia termicato. Verifica che la potenza laser emessa sia come previsto con un misuratore di potenza (100 mW nel nostro esperimento).
  2. Attiva l'applicazione di controllo della temperatura (vedi Tabella dei materiali) e verifica che la temperatura dell'etalon sia ottimizzata misurando la potenza del fascio dopo l'etalon. Se è significativamente inferiore al previsto (considerando il filtro a densità ottica (OD) utilizzato), si modifica la temperatura target di 1 °C e si osserva se nel tempo c'è un aumento di potenza. Se c'è una diminuzione, invertire la direzione del cambiamento. Una volta che la potenza è vicina a quella prevista, si accorda a piccoli incrementi (0,1 °C) fino a raggiungere il massimo.
  3. Posizionare il punto focale dell'obiettivo all'interno del cubo acrilico
    NOTA: La soppressione della diffusione elastica e dell'accoppiamento dal "pump killer" allo spettrometro viene ottimizzata con un campione di materiale di riferimento rigido e omogeneo prima di ogni esperimento. In questo studio viene utilizzato un cubo acrilico.
  4. Apri il software SpectraLok e aspetta che tutti i dispositivi vengano rilevati. Sul lato sinistro della finestra principale (Figura 3), seleziona la fotocamera dello spettrometro.
    1. Installa il cubo acrilico sul portacampioni del microscopio con il lato trasparente rivolto verso l'obiettivo obiettivo. Abbassa il più possibile la lente obiettivo e centra il cubo sotto di essa. Assicurati che il percorso ottico nel microscopio sia scelto in modo che la telecamera dello spettrometro sia esposta (imposta il selettore della porta rotante su L).
      NOTA: Nel nostro setup, la porta L è collegata al circolatore confocale, mentre R è collegata alla porta della fotocamera del microscopio.
    2. Nella finestra della Fotocamera SpectraLok, imposta il tempo di esposizione del sensore a 500 ms e il guadagno software a 100. L'impostazione di guadagno software migliora il contrasto solo per scopi di visualizzazione.
  5. Sblocca l'otturatore laser.
    NOTA: Mentre l'emissione laser è attiva, fai attenzione a non mettere mai testa/occhi nel percorso del fascio laser.
    1. Premi cattura e sposta l'obiettivo verso l'alto. Ci sarà un aumento significativo dell'intensità del segnale e apparirà un pattern saturo (Figura 4A). Questo è causato da una forte riflessione della luce laser all'interfaccia aria-acrilico cubo. Spostando l'obiettivo più in alto, l'intensità del segnale diminuirà e i picchi di Brillouin diventeranno evidenti. Continuare a riposizionare la lente obiettivo finché l'intensità dei picchi di Brillouin non è costante (Figura 4B). Questo corrisponde al punto focale situato interamente all'interno del cubo acrilico.
  6. Ottimizzazione della pressione dell'etalone per minimizzare la luce residua diffusa elasticamente
    NOTA: Lo scopo dei passaggi seguenti è sopprimere il segnale di Rayleigh elasticamente diffuso in modo che solo la luce di Brillouin spostata in frequenza raggiunga la telecamera dello spettrometro.
  7. Nel software SpectraLok, apri la finestra di controllo Pump Killer (PK) (Figura 5).
  8. Zooma su uno degli ordini Brillouin più luminosi e regola la posizione dell'attuatore di pressione a incrementi di 100 μm cliccando su move rel per minimizzare l'intensità massima di Rayleigh. Se il segnale di Rayleigh sta aumentando, inverti la direzione del cambiamento cliccando su retromarcia. Successivamente, regolare finemente la pressione dell'etalon a incrementi di 10 μm.
    NOTA: Nel cubo acrilico, la luce di Rayleigh può essere completamente soppressa; Questo potrebbe non essere il caso in un campione biologico eterogeneo.
  9. Ottimizzazione della sovrapposizione a strisce per "srotolare" i dati spettrali
    NOTA: La seguente procedura garantisce che le coordinate (x, y) dei pixel del sensore della fotocamera siano correttamente mappate alla lunghezza d'onda tramite l'applicazione della tabella di ricerca LUT.
  10. Nella finestra della telecamera , zooma su uno degli ordini Brillouin.
  11. Premi s per visualizzare le strisce su cui la LUT viene applicata sull'immagine della fotocamera (Figura 6A). Apri la finestra Impostazioni e premi calibrazione rapida per ricalcolare lo spostamento orizzontale ottimale delle strisce. Se il sensore è saturo, riduci il tempo di esposizione prima di questo passaggio.
    1. Nella finestra della fotocamera , verifica che le strisce viola siano ben sovrapposte alla regione centrale dei picchi di Brillouin (Figura 6B).
  12. Ottimizzazione del coppiamento dello spettrometro PK
  13. La regolazione degli assi delle lenti collimatori consente di massimizzare l'efficienza dell'accoppiamento della luce dal PK allo spettrometro.
  14. Apri la finestra dello spettro e clicca su svela per recuperare lo spettro (Figura 7).
  15. Apri la finestra di controllo PK . Con incrementi di 0,0005°, si regolano iterativamente gli assi collimatori 1 e 2 per massimizzare il segnale di Brillouin. Se necessario, il controllo della pressione dell'etalon può essere ulteriormente ottimizzato. In un cubo acrilico omogeneo, il segnale di Rayleigh può essere completamente soppresso (Figura 7A). Sebbene siano fattibili misurazioni accurate di Brillouin con qualche segnale residuo di Rayleigh (Figura 7B), in casi di scarsa soppressione (Figura 7C), la luce diffusa elasticamente oscura il segnale di Brillouin.
  16. Verifica che il segnale di Brillouin ottenuto sia paragonabile all'ampiezza di riferimento. Ad esempio, nel nostro sistema, a un'esposizione di 500 ms e con OD 0,3, l'ampiezza massima dell'intensità di Brillouin è di circa 3000 conteggi. Per salvare le modifiche ai parametri PK nel file di configurazione, nella finestra PK, clicca su aggiorna tutto e salva tutto. Inoltre, nella finestra principale, premi salva nella sezione File I/O .
  17. Passare al software di scansione e verificare che i parametri siano ancora ottimizzati
  18. Chiudi SpectraLok e apri il software di scansione. Nel protocollo attuale è stato utilizzato software basato su LabVIEW ed è descritto più dettagliatamente nella Figura S3. Per impostare la geometria di scansione, questa interfaccia utente proprietaria (UI) viene utilizzata per controllare la fase di traduzione Prior XY-Z; tuttavia, possono essere impiegati altri metodi.
    1. Installare la piastra di Petri con fondo di vetro con il campione idrogel-sferoide invece del cubo di acrilico (Figura 8). Per prevenire la disidratazione del gel, l'incubatrice è impostata a 37 °C e al 95% di umidità relativa. Rimuovi il coperchio della piastra di Petri e aggiungi il substrato per immergere il gel. Aggiungi una copertura sulla parte superiore del gel per evitare che il gel si muova.
    2. Localizza lo sferoide. Con il fascio laser bloccato, spostare il percorso ottico del microscopio sull'oculare. Accendi l'illuminazione della luce bianca. Usando il joystick, controlla manualmente lo stadio campione, localizza e metti a fuoco sullo sferoide.
    3. Acquisire un'immagine in campo chiaro dello sferoide. Regola la luminosità dell'illuminazione ruotando la ruota di controllo. Imposta il percorso ottico su R, esponendo così la macchina fotografica del microscopio. Il tempo di esposizione può essere regolato secondo necessità per ottenere un'immagine ad alto contrasto (cioè 50 ms).
    4. Verifica che lo spettrometro e i parametri di unwrapping siano ancora ottimizzati. Imposta la porta del microscopio su L e cattura lo sfondo con il laser bloccato. Sblocca il laser girando la ruota per accendere. In base al rapporto segnale-rumore desiderato, si seleziona il tempo di esposizione. Il tempo di esposizione tipico di queste misurazioni è di 200-500 ms.
    5. Se è passato un certo periodo di tempo (cioè diverse ore) dalla calibrazione iniziale o si è verificato un disturbo meccanico del sistema, l'impostazione della pressione etalon o l'accoppiamento PK-spettrometro potrebbero non essere più ottimale. Ripeti i passaggi 5.3-5.5 per ottimizzare di nuovo quanto sopra menzionato, se necessario.
    6. Dallo spettro non avvolto, seleziona la gamma di fitting Brillouin Peak. Regola il valore di soglia a circa metà dell'intensità dei picchi di Brillouin. Ignora i picchi di Brillouin con ampiezza inferiore a questa soglia. Correggere la lunghezza d'onda del laser in base a tutte le coppie di picco di Brillouin identificate.
  19. Impostazione della geometria della scansione multidimensionale
  20. Scegli la geometria della scansione raster regolando la larghezza della regione di scansione e la dimensione del passo.
    NOTA: Per sferoidi di dimensioni circa 70 μm, per una scansione a bassa risoluzione usiamo tipicamente un'area di scansione di 150 μm × 150 μm e una dimensione di passo di 10 μm. Questo produce una mappa 2D a bassa risoluzione in circa 3,4 minuti.
    1. Inizia la scansione.
  21. Spegnimento del sistema Brillouin
    1. Chiudi il software e spegni il computer. Disattiva l'emissione laser usando il tasto sul controller. Lascia la ruota dell'otturatore nella posizione bloccata . Spegni il raffreddamento della ventola laser. Spegni le telecamere del microscopio e dello spettrometro. Infine, spegni il microscopio.

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Risultati

I file ottenuti dopo una scansione includono spettri, parametri di adattamento della scansione (.csv), parametri e analisi della scansione, mappe BFS e di larghezza di linea, immagine in campo chiaro con la regione di scansione di interesse identificata e uno screenshot della finestra dell'interfaccia utente. Per ogni punto della scansione di Brillouin multidimensionale si ottiene un valore BFS. Nella Figura 9, un esempio di scansione ad alta risoluzione è m...

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Discussione

Abbiamo stabilito un protocollo per utilizzare la microscopia Brillouin per l'imaging biomeccanico degli sferoidi incorporati negli idrogel con risoluzione su scala microscopica. L'idrogel può essere distinto dallo sferoide vivo per differenze nei valori di BFS ottenuti. Nei risultati rappresentativi, abbiamo utilizzato sferoidi MSC e idrogel PEG-maleimide; tuttavia, questo protocollo è ampiamente applicabile ad altri tipi cellulari (ad esempio, le linee cellulari tumorali). Le cellule i...

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Dichiarazioni

Gli autori osservano che T. Allen e G. Wardle sono dipendenti di LightMachinery, che produce e vende lo spettrometro Brillouin utilizzato in questo studio. La compagnia potrebbe beneficiare della pubblicazione di quest'opera. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il finanziamento ottenuto dalla sovvenzione MechanoMeds Fase 2, UKRI/EPSRC, numero di sovvenzione EP/X033554/1 per sostenere lo sviluppo di questo metodo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PEG-Maleimide a 4 bracci (20 kDa)PEGWorks CreativiPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
Targhe AggreWell 400Tecnologie STEMCELL34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Etalon distanziato nell'ariaMacchinari LeggeriHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Soluzione antiaderente per risciacquareTecnologie STEMCELL7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Incubatore Bold Line Top StageOkolabH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Cobolt Flamenco-100 laser 660 nmHuebner0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Circolatore confocaleMacchinari LeggeriHF-13311N/A
Sistema di illuminazione a fluorescenza D-LEDi  NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
Modulo EPI-FLNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Fibronectina (umana)YoProteins663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco' s Eagle Medium Modificato (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
Spettrometro HyperFine BrillouinMacchinari LeggeriHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
Cubo filtro quadruplo a bande LED-DA/FI/TR/Cy5-BNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Cellule staminali mesenchimali (MSC)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Fase di traduzione motorizzata  Prior ScientificH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue e commercio; Pronti e scambi dal vivo; reagente (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Obiettivo, S Plan Fluor 20X NA 0.45, ariaNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
Fotocamera CMOS ORCA-FusionHamamatsuC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-ditiolo, 2 kDaPEGWorks CreativiPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS camera Soluzioni Teledyne Vision01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-actin SpirocromoCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppSoftware per il controllo della temperatura
Peptide VPM, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptN/AN/A
Microscopio Eclipse Ti-2ANikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

Riferimenti

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