È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Preparazione del filtrato di coltura di Mycobacterium tuberculosis per comprendere la patogenesi della tubercolosi

1.7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67540

⸱

28 marzo 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

In questo articolo

Sommario

Qui, dimostriamo la preparazione del filtrato di coltura di Mtb (CF), che è il mezzo di crescita batterico costituito da proteine secrete dai batteri. Mtb secerne proteine per modulare la segnalazione dell'ospite e la risposta immunitaria, che sono cruciali per la patogenesi. Le FC preparate vengono analizzate mediante spettrometria di massa per identificare tutti i fattori secretori.

Abstract

Il Mycobacterium tuberculosis (Mtb) secerne molte proteine nell'ospite per modulare vari processi cellulari, come la segnalazione dell'ospite, la risposta immunitaria, l'apoptosi, ecc., per migliorare la sopravvivenza. Mentre la funzione di alcuni fattori secretori è stata chiarita, molti devono ancora essere caratterizzati. Pertanto, lo studio della proteina secretoria Mtb è un'area di ricerca essenziale. Mtb secerne proteine nello spazio extracitoplasmatico con l'aiuto di tre diversi sistemi di secrezione: generale, twin-arginina e sistema di secrezione specializzato di tipo VII. È necessario preparare il secretoma per identificare nuove molecole secretorie e caratterizzare funzionalmente i fattori noti. Qui, descriviamo il metodo per preparare il secretoma e la preparazione del campione per la spettrometria di massa. La preparazione del secretoma richiede la massima cura per evitare la contaminazione delle proteine citosoliche, che possono essere monitorate sondando con anticorpi contro proteine di membrana, secretorie e citosoliche ben caratterizzate. Il filtrato di coltura così preparato può essere utilizzato per diversi scopi, tra cui lo studio delle proprietà di immunomodulazione dell'ospite.

Introduzione

Il Mycobacterium tuberculosis (Mtb), uno degli agenti patogeni più letali al mondo, infetta individui sani attraverso aerosol trasmessi da una persona infetta mentre starnutisce o tossisce1. Una volta entrato nei polmoni, viene inghiottito dai macrofagi alveolari, dirottando il sistema immunitario dell'ospite per sopravvivere. Tra i vari meccanismi di modulazione dell'ospite che Mtb ha per la sopravvivenza, i fattori di virulenza secretoria sono uno di questi. Le proteine secrete nei terreni di coltura dai bacilli durante la loro crescita sono chiamate proteine del filtrato di coltura (CF)2. Queste proteine filtrate di coltura aiutano i batteri a sopravvivere in condizioni difficili all'interno delle cellule ospiti. Mtb è dotato di tre diversi tipi di sistemi di secrezione: un sistema di secrezione specializzato di tipo VII (T7SS), un sistema di secrezione generale di Sec (sistema Sec) e un sistema di secrezione a doppia arginina (sistema Tat). Il T7SS è il sistema di secrezione più esclusivo negli actinobatteri, a differenza del tipo I-VI nei batteri Gram-negativi3. La secrezione di proteine dispiegate attraverso la membrana è principalmente coinvolta nel sistema Sec e le proteine sono riconosciute da una sequenza segnale N-terminale 4,5. Le proteine ripiegate o parzialmente ripiegate vengono trasportate attraverso il sistema Tat, identificate da una sequenza segnale N-terminale con un motivo a doppia arginina 6,7. Il modo in cui il sistema Sec e Tat regola la secrezione proteica deve ancora essere determinato.

Alcune proteine filtrate di coltura note in Mtb che aiutano a resistere e sopravvivere all'assalto ossidativo dell'ospite in seguito all'infezione sono enzimi come KatG e SodA 8,9, necessari per degradare le specie reattive dell'ossigeno. Inoltre, CFP10-ESAT6, un complesso proteico eterodimerorico, svolge un ruolo vitale nella regolazione delle risposte delle citochine, della fuga batterica, della produzione di ROS, ecc.10. Il locus RD1 è coinvolto nella modulazione del sistema di secrezione di tipo VII, che include la secrezione di CFP10-ESAT6, e la delezione genetica di cpf10-esat6 compromette la sopravvivenza dei batteri in modelli di infezione ex vivo e in vivo. Mycobacterium bovis Il ceppo vaccinale BCG manca del locus RD1 responsabile della secrezione di fattori di virulenza e quindi può essere utilizzato come vaccino vivo attenuato11. Diversi processi cellulari inesplorati regolano strettamente il processo di secrezione. Le proteine filtrate di coltura contengono fattori che promuovono la rianimazione (RpF) che aiutano i batteri a ricrescere dallo stato latente. I fattori che promuovono la rianimazione (Rpfs) sono enzimi idrolizzanti peptidoglicano noti per svolgere un ruolo nella dormienza. Mtb codifica per cinque geni rpf-like (rpf A-E) che aiutano i batteri a ricrescere dalla dormienza da soli o interagendo con altre proteine12. Gli Rpf si trovano nel filtrato di coltura batterica e sono noti per essere coinvolti nella virulenza di Mtb e nell'immunità dell'ospite13,14. I geni rpf ampiamente studiati rpfE e rpfB mostrano un'immunità protettiva in vitro13 e migliorano le risposte immunitarie in vivo. Quindi, rpfE e rpfB possono essere usati come candidati vaccini Mtb.

La fosforilazione reversibile15 è una modifica post-traduzionale che altera vari processi cellulari, l'omeostasi cellulare, la divisione cellulare, ecc. Ad esempio, la fosforilazione di CFP10 svolge un importante ruolo regolatorio, in cui sia i mutanti fosfoablativi che quelli mimetici di CFP10 non riescono a ripristinare il fenotipo osservato nel ceppo di delezione CFP10-ESAT6 16. SecA2, d'altra parte, è una proteina secretoria coinvolta nel danno al DNA della cellula ospite17. Il secretoma del mutante SecA2 è sufficiente a modificare la risposta immunitaria dell'ospite e la cascata di segnalazione18,19. Pertanto, è essenziale ed entusiasmante studiare il secretoma di H37Rv e dei mutanti Mtb, dove i geni delle proteine secretorie vengono eliminati (dati non pubblicati), per ottenere informazioni su come influenzano l'immunomodulazione e la sopravvivenza dell'ospite.

Questo rapporto si concentra su tre aspetti: le fasi coinvolte nella preparazione del filtrato di coltura di Mtb , l'elaborazione dei campioni per la spettrometria di massa e l'esecuzione di esperimenti ex vivo con filtrati di coltura per esaminare le funzioni immunomodulatorie. Studi precedenti hanno mostrato l'identificazione di proteine filtrate di coltura mediante elettroforesi su gel 2D seguita da analisi spettrometrica di massa8. Le proteine filtrate di coltura da ceppi sensibili e resistenti ai farmaci sono state identificate utilizzando la spettrometria di massa per ottenere informazioni sui cambiamenti del secretoma e identificare i fattori di virulenza che possono svolgere un ruolo nella resistenza ai farmaci20. Abbiamo precedentemente studiato il secretoma e il fosfosecretoma di Mtb con l'aiuto della spettrometria di massa16. Tecniche come l'elettroforesi su gel 2D sono a bassa produttività e non vengono utilizzate per studiare i cambiamenti globali nel proteoma o nel secretoma. Le proteine filtrate di coltura variano a seconda dei ceppi batterici, degli stadi delle cellule in crescita e persino in varie condizioni di stress. A seconda delle diverse situazioni, il cambiamento nei pool di proteine secretorie all'interno delle cellule offrirebbe di esplorare l'intero secretoma in modo olistico e fornire maggiori informazioni sul sistema di secrezione batterica per gli interventi terapeutici. Sarebbe ancora più interessante osservare il secretoma nei knockout o nei ceppi di deplezione dei sistemi secretori per ottenere ulteriori informazioni sui percorsi e sui bersagli di ciascuna via secretoria. Il trattamento delle cellule con proteine filtrate di coltura invece che con batteri modifica i livelli di citochine e altri fattori immunomodulatori17. Con l'aiuto dello studio del secretoma, è possibile identificare nuovi fattori di virulenza e il loro ruolo nella virulenza.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

NOTA: Qui, utilizziamo il ceppo patogeno di laboratorio H37Rv di Mtb. È necessario eseguire i passaggi necessari per far crescere la coltura batterica e isolare il surnatante della coltura nel laboratorio di biosicurezza livello 3 (BSL-3). Dalla rinascita della coltura alla preparazione del filtrato, viene utilizzata la struttura BSL-3.

1. Inoculazione della coltura Mtb

  1. Preparazione dell'area di lavoro in BSL-3
    1. Accendere la luce UV della cabina di biosicurezza per 10 minuti prima dell'uso. Pulire la cabina di biosicurezza con etanolo al 75% prima e dopo l'uso. Smaltire i materiali utilizzati negli appositi cestini dei rifiuti seguendo le linee guida sulla biosicurezza.
  2. Preparazione di colture primarie e secondarie di Mtb H37Rv
    1. Prelevare il brodo di glicerolo da -80 °C e scongelarlo a temperatura ambiente. Utilizzare quattro ceppi indipendenti per quadrupletti biologici.
    2. Assumere 10 mL di terreno 7H9 (Tabella 1) contenente il 10% di ADC (9 mL di terreno 7H9 e 1 mL di ADC) in un pallone conico autoclavato da 100 mL con tappo a vite.
      NOTA: 7H9 + ADC: 7H9 è un terreno ricco di sostanze nutritive ottenuto commercialmente, a cui aggiungiamo ADC (ADC: albumina, destrosio e catalasi; Tabella 2). Sia l'ADC che l'OADC possono essere utilizzati per far crescere la cultura. I palloni conici forniscono una maggiore aerazione alla coltura; Tuttavia, si può anche utilizzare una fiaschetta di coltura tissutale per far crescere le cellule batteriche.
    3. Inoculare l'intero stock di glicerolo nel terreno per far rivivere la coltura, che diventa la coltura primaria. Prendi una coltura Mtb in crescita600 ~ 0,8 per la produzione di scorte di glicerolo. Mescolare il 15% di glicerolo e la coltura di Mtb in crescita in un crioviale e conservare a -80 °C.
    4. Incubare i palloni di coltura a 37 °C in un agitatore per incubatori per 3-4 giorni a 100 giri/min.
    5. Il 5° giorno, misurare l'assorbanza a 600 nm (A600). Quando le colture raggiungono A600~0,8-1, utilizzare la coltura per l'inoculazione della coltura secondaria ad A600 ~0,2 in 100 mL di terreno ADC 7H9 +10% in un pallone da 500 mL. Eseguire gli stessi passaggi per le repliche.
      1. Misurare l'A600 delle impostazioni cultura primarie. Se l'A600 è ~ 0,8, pellettare la coltura mediante centrifugazione a 2100 x g per 10 minuti. Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 5 mL di terreno ADC 7H9 + 10% e misurare l'A600. Calcolare la quantità di inoculo che verrà aggiunta in 100 ml di coltura secondaria di A600 ~ 0,2. Ad esempio, se si utilizza l'A600 ~ 4, è necessario aggiungere 5 ml di tale coltura a 100 ml di coltura secondaria 7H9 fresco + 10% ADC di A600 ~ 0,2.
    6. Coltivali a 37 °C in un agitatore per incubatrice a 100 giri/min per 2-3 giorni fino a OD A600 ~ 0,8.
    7. Prelevare 10 μl utilizzando una pipetta dotata di un puntale filtrante e posizionare la coltura su una piastra LB Agar che non contenga antibiotici nella cappa batterica. Incubare la piastra a 37 °C per 12-16 ore per visualizzare l'eventuale contaminazione batterica. Scartare le colture e far rivivere le nuove colture dell'esperimento se viene rilevata una contaminazione batterica.
  3. Crescita batterica nei terreni di Sauton
    1. Ad A600~0,8, inoculare i batteri ad A600 ~0,2 in 100 mL di terreno di Sauton in un pallone da 500 mL (Tabella 3) e crescere per 3-4 giorni dopo che l'OD raggiunge ~0,8.
    2. Utilizzare colture coltivate fino ad A600 ~ 0,8 nei terreni di Sauton (la coltura primaria di Sauton) per l'inoculazione di colture da utilizzare per la preparazione del filtrato di coltura.
      NOTA: 7H9 + ADC è un terreno ricco di sostanze nutritive che contiene albumina. L'albumina non può essere utilizzata nell'analisi del secretoma poiché l'albumina può mascherare le proteine filtrate della coltura. Pertanto, il terreno di Sauton viene utilizzato per preparare il filtrato di coltura. Il terreno di Suton viene preparato ricostituendo i componenti menzionati nella Tabella 3.

2. Preparazione delle proteine filtrate di coltura Mtb

  1. Centrifugazione per surnatante di coltura
    1. Utilizzare la coltura primaria di Auton per inoculare 300 ml di coltura secondaria di Sauton a A600 ~0,2. Coltiva le colture fino a quando OD A600 è ~0,4-0,5. Utilizzare colture in fase di log in crescita attiva per evitare la contaminazione da cellule morte.
      1. Misurare la diametro esterno delle impostazioni cultura secondarie. Se il diametro esterno raggiunge A600 ~0,8, pellettare la coltura mediante centrifugazione a 2.100 x g per 10 minuti. Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 10 ml di terreno di Suton e riprendere l'OD. Calcolare la quantità di inoculo che verrà aggiunta in una coltura da 300 ml di 0,2 OD rispetto all'OD misurato. Ad esempio, se l'OD è 8, 7,5 mL di quella coltura devono essere aggiunti a 300 mL di terreno di Sauton fresco con 0,2 OD.
        NOTA: Attenersi al diametro esterno menzionato per ridurre la lisi cellulare e la contaminazione da GroEL. GroEL è un chaperon ed è costitutivamente espresso nelle cellule batteriche. Parte della letteratura ha mostrato la presenza di GroEL nei filtrati di coltura a causa dello stress durante la crescita. Qui, stiamo utilizzando i terreni di Sauton per la preparazione del filtrato di coltura, che fornisce un leggero stress alle cellule; quindi, GroEL può presentarsi nel filtrato di coltura. Inoltre, se l'OD della coltura è superiore a 1, si verificherebbe la lisi cellulare, che porterebbe alla contaminazione da GroEL nel filtrato di coltura.
    2. Pellettare 300 mL di colture in crescita in 6 provette da 50 mL a 2.100 x g per 10 minuti a 4 °C (Figura 1A).
    3. Prelevare 45 mL di surnatante, lasciando intatto il pellet, con una pipetta sierologica da 25 mL in una nuova provetta in ogni caso. Tenere da parte il pellet per la preparazione del lisato a cellule intere (WCL).
    4. Ripetere la centrifugazione a 2,100 x g per 10 minuti a 4 °C. Prelevare 40 mL di surnatante (lasciando intatti 5 mL di coltura) con una pipetta sierologica da 25 mL in una nuova provetta e ripetere la fase di centrifugazione.
    5. Prelevare 35 mL di surnatante in una nuova provetta e filtrare il surnatante di coltura utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm. Filtrare in un tubo nuovo per eliminare la contaminazione batterica patogena. Da 300 mL di coltura, vengono recuperati 210 mL di filtrato di coltura per replicato.
      NOTA: Il filtro che è stato utilizzato qui per filtrare il filtrato di coltura è un filtro per siringa sterile da 0,22 μm (tipo SY25PL-S).
    6. Dopo la filtrazione del filtrato di coltura, inoculare 1 mL di aliquota del filtrato filtrato su una piastra di agar e incubare nell'incubatore a 37 °C per 4 settimane per garantire la presenza di altre contaminazioni batteriche patogene nel filtrato di coltura. Assumere 1 ml di aliquota dal lisato a cellule intere (WCL) e seguire le stesse misure di sicurezza.
    7. Pulire le provette del campione con etanolo al 75% ed estrarle dal BSL-3 attraverso una scatola di passaggio.
  2. Preparazione del lisato a cellule intere (WCL)
    1. Risospendere il pellet in 1 mL di 1x PBSG contenente fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 1x cocktail di inibitori della proteasi e trasferire il lisato in provette da 2 mL con tappo a vite contenenti 1/3del volume di perle di zirconia da 0,1 mm.
      NOTA: Il 1x PBSG è composto da 1x PBS + 5% di glicerolo. Prendiamo il rapporto in peso pellet-tampone di 1:3.
    2. Liare i campioni battendoli in un mini battitore di perline: 1 minuto di battitura delle perle seguito da 2 minuti di incubazione su ghiaccio. Ripeti l'operazione 8 volte.
    3. Centrifugare le provette a 18.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 ml e tenerlo in ghiaccio.
    4. Ripetere la fase di centrifugazione. Passare il surnatante attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm per eliminare la contaminazione batterica patogena.
      NOTA: Il filtro utilizzato qui per filtrare il filtrato di coltura è un filtro per siringa sterile da 0,22 mm (tipo SY25PL-S).
    5. Pulire i campioni con etanolo al 75% ed estrarli dal BSL-3 attraverso una scatola di passaggio. Controllare le concentrazioni di lisati utilizzando il kit per il dosaggio dei BCA, come indicato di seguito. Conservare i lisati a -80 °C.
  3. Concentrare le proteine filtrate di coltura utilizzando unità di filtro centrifughe.
    1. Concentrare 210 mL di proteine filtrate di coltura Mtb con l'aiuto di unità filtranti centrifughe. Utilizzare provette per unità filtranti centrifughe da 3 kDa 15 mL (centriconi) per concentrare il filtrato di coltura in ~1 mL (Figura 1A). Le provette dell'unità filtrante centrifuga da 3 kDa trattengono proteine della stessa dimensione o più grandi di 3 kDa.
    2. Aggiungere circa 15 mL di ciascuna replica di filtrato di coltura in una provetta centricon e centrifugare a 2.100 x g per 1 ora a 4 °C.
    3. Scartare il flusso continuo come da norme e ripetere il passaggio 2.3.2 per 15x-16x fino a 210 mL di concentrato filtrato di coltura a ~1 mL.
    4. Aliquotare 100 μl di filtrato di coltura concentrato, versare le proteine in dieci provette per microcentrifuga a basso legame proteico e stimare la concentrazione proteica utilizzando un kit BCA.
  4. Stima delle proteine concentrate
    1. Stimare la concentrazione proteica rispetto alla BSA come standard. Utilizzare 1 μg, 2 μg, 3 μg e 4 μg di BSA in volume di 25 μl nei duplicati. Se il campione non è stato diluito, utilizzare un campione diluito 5x (in PBS) in volume di 25 μl in duplicati per la stima. Le stime vengono eseguite in piastre a 96 pozzetti. Utilizzare un controllo senza campione (bianco) contenente 25 μl di PBS.
    2. Aggiungere 175 μl di reagente miscelato secondo le istruzioni del produttore. Miscelare i campioni con l'aiuto di una pipetta multicanale e incubare a 37 °C per 1 ora. Misurare le letture a 562 nm utilizzando un lettore ELISA. Dedurre i valori dai valori vuoti per ottenere i valori per BSA e i campioni.
    3. Adattare la curva standard alla curva di regressione lineare e stimare i campioni rispetto allo standard. Segui il kit BCA per il manuale di stima delle proteine.

3. Conferma delle proteine filtrate di coltura utilizzando diversi marcatori

  1. Rilevamento di proteine mediante colorazione Coomassie
    1. Per confermare la presenza delle proteine nel filtrato di coltura, prelevare 30 μg di proteina e risolvere l'elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio al 10% (SDS-PAGE; Tabella 4).
      NOTA: Seguire la descrizione della tabella per rendere le soluzioni SDS-PAGE, Coomassie e decoloranti tamponi.
    2. Aggiungere 20 mL di soluzione colorante Coomassie (Tabella 5) al gel e incubare per 30 minuti su bilancieri a temperatura ambiente. Scartare la soluzione colorante.
    3. Aggiungere 30 mL di soluzione decolorante (Tabella 6) al gel e incubare per 30 minuti su un bilanciere a temperatura ambiente. Scartare la soluzione decolorante e aggiungere una soluzione decolorante fresca. Ripetere fino a quando il gel non si è macchiato correttamente.
    4. Controllare la striscia proteica sull'illuminatore trans (Figura 1B). Poiché la proteina filtrato di coltura contiene diverse proteine, si può vedere una striscia di bande proteiche nel gel dopo la decolorazione (Figura 1B).
  2. Conferma del western blot per il marcatore proteico secreto
    1. Utilizzare l'anticorpo della proteina secreta per verificare la presenza della proteina secreta nel filtrato di coltura. Ag85B (ab43019) è una nota proteina secreta da Mtb nel filtrato di coltura ed è presente nel citosol; l'anticorpo Ag85B (concentrazione 5 mg/mL) (diluizione 1:5000 in BSA al 5%) viene utilizzato come controllo positivo per la proteina secreta.
    2. Caricare un WCL con le proteine filtrate di coltura per differenziare tra le frazioni proteiche citosoliche/di membrana e secrete. Ag85B è citosolico e secreto, quindi questo dovrebbe essere presente in entrambe le frazioni; d'altra parte, è noto che il PknB è localizzato sulla membrana e non è presente nel filtrato di coltura.
    3. Determinare la concentrazione di proteine nel WCL/filtrato di coltura con l'aiuto di un kit BCA. Miscelare 30 μg di WCL/filtrato di coltura con 2 tamponi lamelli in un volume di 30 mL (Tabella 7). Risolvere i campioni in 10% SDS-PAGE per PknB e 12% SDS-PAGE per Ag85B fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo utilizzando il tampone runnimg in gel SDS (Tabella 8). Non lasciare che il colorante anteriore defluisca dal gel.
      NOTA: La dimensione dell'Ag85B è ~35 kDa, quindi viene utilizzato il 12% di SDS-PAGE.
    4. Tagliare una membrana di nitrocellulosa di 9 cm x 6 cm da 0,2 μm per il trasferimento (Tabella 9) della proteina dal gel alla membrana. Configura il trasferimento utilizzando una cassetta di trasferimento, immergendo le cassette, i tamponi in schiuma, la carta assorbente, il gel e la membrana in 1x tampone di trasferimento ghiacciato.
    5. Posizionare il tampone di schiuma su un lato della cassetta, quindi posizionare una carta assorbente, posizionare il gel, mettere la membrana di nitrocellulosa sopra il gel, posizionare di nuovo una carta assorbente e, infine, posizionare un altro tampone di schiuma e chiudere il supporto della cassetta. Posizionare il supporto della cassetta nel serbatoio di trasferimento in modo che il lato della membrana sia rivolto verso l'anodo e il lato del gel sia rivolto verso il catodo.
    6. Collegare il catodo e il cavo dell'anodo al serbatoio per chiudere la configurazione e impostarlo a una corrente di 120 mA per 120 min. Inizia a eseguire il trasferimento in una cella frigorifera.
    7. Metti la membrana in una piccola scatola di plastica al termine del trasferimento. Bloccare la membrana utilizzando 10 mL di soluzione BSA al 5% prodotta in 1x PBST20 per ridurre il legame aspecifico per 1 ora a temperatura ambiente sul bilanciere.
    8. Rimuovere la soluzione bloccante, aggiungere 5-10 mL di anticorpo primario, che è un anticorpo anti-topo Ag85B (diluizioni 1:5.000 in soluzione BSA al 5%) e incubare a 4 °C per una notte in un bilanciere. Conservare l'anticorpo a -20 °C e riutilizzarlo fino a 3 volte.
    9. Rimuovere l'anticorpo primario, aggiungere 5-10 ml di 1x PBST20 e lavare la membrana per 8 minuti a temperatura ambiente agitando energicamente. Togliere il primo lavaggio, aggiungere nuovamente 5-10 ml di 1x PBST20 e lavare. Ripeti l'operazione 2 volte.
    10. Aggiungere 5-10 mL di 1x PBST20 contenente anticorpo secondario, che è un anticorpo coniugato anti-perossidasi redox di cavallo (HRP) di topo (diluizione 1:10.000) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su un bilanciere.
    11. Lavare la membrana dopo l'anticorpo secondario seguendo il passaggio 3.2.9. Aggiungere una quantità uguale di substrato HRP e potenziatore per sviluppare la membrana sotto un chemiluminometro (Figura 1C).
      NOTA: Per confermare l'assenza di contaminazione da proteine citosoliche, abbiamo sondato il Western blot con un anticorpo anti-PknB (Figura 1C). L'anticorpo è stato allevato presso l'Istituto Nazionale di Immunologia, una struttura per animali, contro il dominio extracitoplasmatico purificato di PknB. Si può osservare la banda PknB nel WCL, non nei filtrati di coltura, e PknB è esclusivamente citosolico e legato alla membrana e non dovrebbe essere presente nel filtrato di coltura.

4. Preparazione di campioni per spettrometria di massa

  1. Eseguire la digestione delle proteine in soluzione mediante tripsina.
    1. Prelevare 100 μg di proteine filtrate di coltura, aggiungere 6 volte il volume di acetone ghiacciato e mantenerlo a -20 °C per una notte.
      NOTA: Utilizzare articoli di vetro per preparare tutti i reagenti per il campione di spettrometria di massa. Utilizzare provette per microcentrifuga a basso contenuto proteico e puntali a basso contenuto proteico. Non utilizzare materiale plastico per evitare la contaminazione del polimero nell'analisi di spettrometria di massa.
    2. Far precipitare le proteine mediante centrifugazione a 18.000 x g a 4 °C per 30 minuti. Scartare il surnatante.
    3. Lavare il pellet con 500 μl di acetone, pellettare a 18.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Rimuovere l'acetone residuo con l'aiuto di un concentratore a vuoto.
    4. Aggiungere 20 μl di urea 8 M disciolta in 25 mM di bicarbonato di ammonio (2 M di brodo preparato in acqua di grado MS). Agitare i campioni e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    5. Versare 60 μL di bicarbonato di ammonio 25 mM per diluire l'urea 8 M in 2 M. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Aggiungere 4 μL di TCEP (concentrazione finale di 10 mM realizzata in 25 mM di bicarbonato di ammonio) e incubare a temperatura ambiente per 30 min, agitando a 1.800 x g.
    6. Aggiungere 4 μl di IAA (concentrazione finale di 25 mM realizzata in bicarbonato di ammonio 25 mM) e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, agitando a 1.800 x g al buio. Aggiungere 110 μl di bicarbonato di ammonio 25 mM.
    7. Aggiungere la tripsina (1:20; Tripsina: proteina in μg) nella soluzione e mantenerla a 37 °C, agitando a 300 giri/min, per la digestione notturna (Figura 2). Arresta la reazione digestiva aggiungendo il 10% di TFA (acido trifluoroacetico). Aspirare i campioni in modo che si asciughino completamente.
  2. Dissalazione del campione
    1. Aggiungere 100 μl di ACN al 5% + TFA allo 0,1% ai peptidi digeriti. Vortice per 30 min a 1.500 giri/min a temperatura ambiente.
    2. Centrifugare a 18.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Portare il surnatante (peptide) senza toccare il pellet in provette fresche per microcentrifuga e procedere con la desalinizzazione. Preparare tutte le soluzioni di lavaggio e di eluizione prima della fase di desalinizzazione.
    3. Equilibrare il puntale della colonna C-18 con 100 μl di ACN al 100% + TFA allo 0,1% pipettando la soluzione e ripetendo il processo 5 volte.
    4. Aggiungere 100 μl di ACN al 50% + TFA allo 0,1% e ripetere il processo 5 volte. Aggiungere 100 μl di ACN al 5% + TFA allo 0,1% e ripetere il processo 5 volte.
    5. Consentire il legame del peptide nel puntale della colonna C-18 pipettandolo 30x. Mantenere la soluzione a -20 °C fino a quando il campione non viene processato per la spettrometria di massa. Ora, il peptide è legato alla colonna C-18.
    6. Lavare la colonna C-18 con 100 μL di acqua di grado MS + 0,1% TFA mediante pipettaggio e ripetere il processo 5 volte.
    7. Lavare la colonna C-18 con 100 μl di ACN al 5% + TFA allo 0,1% mediante pipettaggio e ripetere il processo 5 volte. Eluire i peptidi dalla colonna C-18 in 100 μl di ACN al 50% + TFA allo 0,1% pipettando 30x (Figura 2).
      NOTA: Dopo l'eluizione, la punta della colonna C-18 può essere conservata a 4 °C fino al termine della spettrometria di massa.
    8. Aspirare il peptide eluito e conservarlo a -20 °C fino a quando il campione non viene somministrato per la spettrometria di massa.
  3. Iniezione dei campioni di peptidi in una spettrometria di massa.
    1. Aggiungere 20 μl di soluzione A (fornita dall'impianto di spettrometria di massa) ai campioni di peptidi essiccati. Agitare i campioni per 30 minuti e centrifugare per 90 minuti a 4 °C.
    2. Iniettare 20 μl di campione nella macchina per spettrometria di massa per un'esecuzione in gradiente di 90 minuti.

5. Analisi dei dati per proteine secrete presenti nel filtrato di coltura

  1. Identificazione delle proteine
    1. Analizza i campioni di proteomica utilizzando lo spettrometro di massa a quadrupolo. Interrogare gli spettri ottenuti sul database Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. Impostare le tolleranze di massa del precursore e del frammento a 10 ppm e 0,5 Da. Impostare l'enzima su tripsina con un valore massimo di scissione mancato pari a due.
    3. Utilizzare il software del proteoma con Sequest come algoritmo di ricerca con la carbamidometilazione della cisteina come modifica fissa.
    4. Identifica tutte le corrispondenze peptidico-spettro (PSM) con un tasso di false scoperte dell'1%. Applica le impostazioni predefinite per tutti gli altri parametri.
    5. Mappare i file grezzi di spettrometria di massa della sequenza peptidica con l'ID UniProt delle rispettive proteine Mtb. Elenca tutte le proteine Mtb, i loro ID Uniprot e la classificazione funzionale utilizzando il database Mycobrowser.
    6. Per ulteriori analisi, mappare gli ID UniProt delle proteine identificate al rispettivo numero Rv . Depositare i dati del secretoma della spettrometria di massa al consorzio ProteomeXchange tramite il partner PRIDE.

6. Trattamento di H37Rv con proteina filtrata di coltura per verificare il cambiamento nella segnalazione dell'ospite

  1. Isolamento dei macrofagi peritoneali dai topi.
    NOTA: Seguire il riferimento21 per l'isolamento dei macrofagi peritoneali, la semina delle cellule e l'infezione.
    1. Iniettare topi Balb/c (4-6 settimane di età) con 1 mL di tioglicolato al 4% e isolare i macrofagi peritoneali dal peritoneo di topo il 4° giorno di infezione21 (Figura 3).
    2. Raccogli le cellule macrofagiche iniettando 1x PBS nel peritoneo del topo. Centrifugare le cellule a 1.800 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e aggiungere 5 ml di terreno 1640-RPMI integrati con il 10% di FBS (siero fetale bovino; terreno completo) e 1x pen-strep (antibiotici).
    3. Seminare 3 x 105 cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti e incubare le piastre in un'incubatrice a 37 °C per una notte. Il giorno successivo, cambia il terreno in terreno fresco e completo e le cellule saranno pronte per l'infezione o il trattamento con proteine filtrate di coltura.
  2. Trattamento dei macrofagi peritoneali con proteine filtrate di coltura
    1. Portare le cellule macrofagiche a BSL-3 e tenerle nell'incubatore. Trattare le cellule con 1 mg/mL di proteine filtrato di coltura (Figura 3). Raccogliere le cellule in diversi momenti di 4 ore, 24 ore e 48 ore di trattamento con filtrato post-coltura.
      1. Seminare le cellule macrofagiche isolate in piastre a 24 pozzetti in triplicati in ogni punto temporale. Trattare le cellule con 1 mg/mL di proteine filtrate di coltura e incubare a 37 °C in incubatore in presenza di CO2. Raccogliere le cellule in tre punti temporali, 4 ore, 24 ore e 48 ore dopo il trattamento.
      2. Trattare le cellule con i) tampone 2x-lamella per produrre i lisati delle cellule macrofagiche e verificare la presenza di diversi marcatori di cellule ospiti eseguendo il Western blotting e ii) diversi tamponi per i saggi immunologici forniti dai produttori insieme ai kit.
    2. Preparare i lisati cellulari dell'ospite e verificare la presenza di diversi marcatori, il profilo delle citochine delle cellule ospiti e varie espressioni proteiche della via di segnalazione su cellule macrofagiche trattate con filtrato di coltura.
      NOTA: Se un laboratorio ha un mutante di sostituzione genica della proteina della via secretoria, i filtrati di coltura preparati da Mtb H37Rv e dal mutante Mtb possono essere utilizzati per valutare il loro impatto sui parametri immunomodulatori dell'ospite.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

In questo protocollo, abbiamo dimostrato l'isolamento di proteine filtrate di coltura da micobatteri (Figura 1A). Le proteine del filtrato di coltura sono state quindi controllate per i diversi marcatori per confermare l'isolamento del filtrato di coltura. Come menzionato nel protocollo, è stata eseguita una colorazione di Coomassie per controllare il carico proteico. Si può osservare una banda proteica striata nella frazione WCL (nell'ultima corsia Figura 1B

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Una delle aree di ricerca critiche riguarda la comprensione della patogenesi delle Mtb e lo sviluppo di diagnostica e vaccini efficaci22,23. L'isolamento delle proteine filtrate di coltura dai terreni di coltura di Mtb è un processo che consente l'identificazione dei fattori di virulenza secreti dal patogeno. Lo studio del ruolo delle proteine secretorie nella modulazione della patogenesi di Mtb produce...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ m Filtri per siringhemdiSYPL0601MNXX204
0,2µ m Membrana di nitrocellulosaAmersham10600001
37% HClMerckH1758
AcetoneEMPLURA MERCKSL9F690866
AcetonitrileSigma-Aldrich34851-2L
AcrilammideBIORAD1610107
AlbuminaBio Basic CanadaNumero di cat: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
Biocarbonato di ammonioSigma-Aldrich09830-500G
Persulpahte di ammonioSigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
anti-topo HRP coniugato anticorpo secondario ThermoFischer62-6520
AsparaginaSigma-AldrichA0884-500G
bis-acrilammideSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 colonnaThermo FischerSEM SS18V
Catalasi Sigma-AldrichC1345
Acido citricoSigma-AldrichC0759-500G
DestrosioSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Middle brook 7H9 brodo   Fisher Scientific271310
Citrato di ammonio ferrico (III)Sigma-AldrichF5879-100G
Acido formico 98-100%MerckZ0823704246
Acido acetico glaciale 100%MerckCD0C700160
GlicinaSigma-AldrichG8898-1KG
GlicinaSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Substrato HRP chemiluminescente occidentaleMerckWBKLS0500
IodoacetamideAmershamRPN6302V
Magnesio solpatoSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
Acido oleicoSigmaCat No: O1008
Kit per il dosaggio delle proteine BCA PierceThermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtasiThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (esperimenti di proteomica - sequenziamento dei peptidi, identificazione e quantificazione delle proteine)Thermo Fischer Scientific
Cloruro di sodioSigmaCat No: S3014
Cloruro di sodioSigma-AldrichS7773-1KG
Sodio dodecil solfatoSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt banca dati
proteica UreaMP Bio194857

Riferimenti

  1. Campbell, I. A., Bah-Sow, O. Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment. Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).
  2. Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).
  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
  4. Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria. J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).
  5. Feltcher, M. E., et al. Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).
  6. McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).
  7. Saint-Joanis, B., et al. Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence. J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).
  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
  9. Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation. PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).
  10. Guinn, K. M., et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).
  11. Lewis, K. N., et al. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).
  12. Kana, B. D., et al. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).
  13. Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).
  14. Biketov, S., et al. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. BMC Infect Dis. 7, 146(2007).
  15. Verma, R., et al. Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis. J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).
  16. Malakar, B., et al. Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis. mBio. 14 (5), e0123223(2023).
  17. Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome. Elife. 9, e51466(2020).
  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
  19. Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages. Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).
  20. Putim, C., et al. Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis. Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).
  21. Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs. STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).
  22. Xu, D. D., et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).
  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Proteine secretoriesistemi di secrezionespettrometria di massaconcentrazione proteicafattori di virulenza battericaimmunomodulazione dell'ospitecentrifugazione
Preparazione del filtrato di coltura di Mycobacterium tuberculosis per comprendere la patogenesi della tubercolosi
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.