L'isolamento delle MSCalteMFGE8 di BAMBI, uno dei tre principali sottogruppi che costituiscono UC-MSC umane eterogenee, è utile per comprendere appieno le caratteristiche e le funzioni di questo sottotipo per la sua futura applicazione per migliorare l'efficacia clinica in malattie specifiche. Qui, presentiamo un metodo per lo smistamento di BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule stromali mesenchimali umane derivate dal cordone ombelicalead altoMFGE8
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule mesenchimali stromali/staminali derivate dal cordone ombelicale (UC-MSC) presentano una bassa immunogenicità e potenti effetti immunomodulatori per il trattamento di varie malattie. Le UC-MSC umane sono una popolazione eterogenea composta da tre sottopopolazioni principali con diverse forme cellulari, tassi di proliferazione, capacità di differenziazione e funzioni di regolazione immunitaria. In precedenza, le UC-MSCad altoMFGE8di BAMBI, il primo sottogruppo isolato con successo dalle UC-MSC, non riuscivano ad alleviare la nefrite lupica. Pertanto, la funzione e il meccanismo sottostante di questo sottogruppo nella terapia delle MSC per le malattie rimangono sconosciuti. È necessario isolare e studiare ulteriormentele UC-MSCad altoMFGE8 di BAMBI in termini di fenotipo, metabolismo e funzione per comprendere completamente la natura di questo sottogruppo di MSC. In questo protocollo, descriviamo un metodo dettagliato per isolare la sottopopolazioneBAMBI ad altoMFGE8 da UC-MSC umane. La sottopopolazione di UC-MSC è marcata con due marcatori di superficie, BAMBI e MFGE8, mediante smistamento con citometria a flusso. Le cellule isolate vengono coltivate e verificate mediante analisi di citometria a flusso. I geni specifici espressi nelle UC-MSC alte MFGE8di BAMBIsonoidentificati mediante RT-qPCR. Questo protocollo consente di ottenere un sorting cellulare altamente efficiente e puro e descrive i profili dei marcatoridelle UC-MSCBAMBI ad altoMFGE8.
Introduzione
Le cellule stromali/staminali mesenchimali umane (MSC) sono progenitori somatici in grado di differenziarsi in osteociti, adipociti, condrociti e altri tipi di cellule1. Le MSC sono state isolate per la prima volta dal midollo osseo e sono ampiamente derivate dal cordone ombelicale, dal tessuto adiposo e da altri tessuti2. Poiché le UC-MSC sono facilmente ottenibili e mostrano una bassa immunogenicità ed effetti immunosoppressivi, sono ampiamente applicate negli studi clinici per il trattamento di varie malattie 3,4,5. Sebbene la terapia con MSC mostri un potenziale promettente per il trattamento delle malattie, gli effetti terapeutici sono incoerenti tra gli individui6. Tuttavia, il motivo dell'instabilità della terapia con MSC non è ancora chiaro.
Le fluttuazioni molecolari, la morfologia, la capacità di differenziazione e la funzione terapeutica comprendono l'eterogeneità delle MSC. Alcuni studi hanno anche postulato che le MSC costituiscano sottopopolazioni con funzioni diverse 7,8 e hanno esplorato l'eterogeneità delle MSC tramite il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq)9,10. I risultati hanno rivelato che le UC-MSC umane hanno sottopopolazioni distinte con specifiche caratteristiche trascrittomiche, mentre pochi studi hanno isolato con successo le cosiddette sottopopolazioni di MSC. In precedenza abbiamo sezionato le UC-MSC umane in tre sottogruppi in base alle loro firme tramite scRNA-seq e analisi bioinformatiche, in cui la sottopopolazione di BAMBIad altoMFGE8UC-MSC è stata ulteriormente purificata e testata funzionalmente11. Tuttavia, questo sottogruppo non è riuscito ad alleviare la nefrite lupica. Pertanto, è necessario testare gli effetti terapeutici delle MSCalteMFGE8 di BAMBI in altri disturbi per comprendere le loro funzioni autentiche.
Questo protocollo descrive i metodi per isolare il sottogruppoBAMBI highMFGE8 high da UC-MSC umane tramite smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) mediante citometria a flusso e le caratteristiche del sottogruppoBAMBI highMFGE8 high.
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in conformità con i principi stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1989 e approvato dal Comitato Etico presso l'Ospedale Affiliato Drum Tower della Nanjing University Medical School (numero di approvazione: 202019701). I cordoni ombelicali umani sono stati ottenuti da madri sane presso l'Affiliated Drum Tower Hospital della Nanjing University Medical School dopo il travaglio naturale, che hanno dato il loro consenso informato per il loro uso in questo lavoro. Le UC-MSC primarie sono state isolate dal cordone ombelicale umano, come precedentemente riportato11.
1. Coltura e identificazione delle UC-MSC prima dell'isolamento
- Una volta che le MSC raggiungono il 70-80% di confluenza (P0), lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% per 2 minuti a 37 °C. Quindi, aggiungere 9 mL di terreno completo per neutralizzare la tripsina, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti per raccogliere le cellule. Scartare il surnatante e aggiungere il terreno completo appropriato per risospendere le cellule. Trasferire le cellule in ciascuna piastra in tre fiasche T75 (P1) e la coltura in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% di CO2.
- Dopo aver fatto passare le UC-MSC 2x tramite tripsinizzazione, a P3, raccogliere le cellule attraverso gli stessi passaggi descritti nel passaggio 1.1. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Risospendere le cellule nel tampone di colorazione FACS (1x PBS contenente il 2% di FBS) e contarle. Aggiungere il tampone di colorazione FACS a una concentrazione finale di 5-10 × 106 cellule/mL e mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
- Distribuire 100 μl per provetta di questa sospensione cellulare in diverse provette da 1,5 mL. Aggiungere controlli isotipici e anticorpi FACS contro CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR (tutti a 1:200) alle cellule a 4 °C per 30 minuti.
- Lavare le cellule 2 volte con il tampone di colorazione FACS e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere i precipitati in 200 μL di tampone di colorazione FACS per l'analisi della citometria a flusso per identificare i marcatori MSC.
2. Isolamento di UC-MSC alte MFGE8di BAMBImediante citometria a flusso
- Coltura di UC-MSC a una densità di circa 5-10 × 106 cellule durante l'isolamento di BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs. Dissociare le cellule con EDTA 0,5 mM per 5 minuti fino a quando iniziano ad avere una morfologia rotonda, aggiungere il terreno completo per trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e pipettare la sospensione cellulare su e giù più volte per preparare una sospensione a cellula singola. Utilizzare 10 μl di sospensione cellulare per contare le cellule e calcolare il numero totale di cellule raccolte. Centrifugare la provetta conica con la sospensione cellulare a 300 × g per 5 minuti per raccogliere le cellule.
- Risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo fino a una concentrazione finale di 5-10 × 106 cellule/mL e mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
- Dividere le cellule in quattro provette per microcentrifuga da 1,5 mL (solo celle vuote; cellule marcate con BAMBI; celle marcate con MFGE8; e cellule marcate con BAMBI e MFGE8).
- Aggiungere anticorpi primari a concentrazioni appropriate (MFGE8 e BAMBI, entrambi a 1:100) alle provette, mescolare e incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Lavare una volta le cellule marcate con 1x PBS e centrifugare a 300×g per 5 minuti. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo, aggiungere anticorpi secondari fluorescenti coniugati (IgG H&L Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647 di capra anti-coniglio, tutti a 1:1.000) alle cellule, mescolare e incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti al buio.
- Lavare una volta le celle marcate con 1x PBS, come descritto al punto 2.5. Risospendere le cellule in 500 μL di terreno completo, filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per eliminare grumi e detriti e trasferire il filtrato in una provetta da 15 mL per lo smistamento della citometria a flusso.
- Far scorrere la provetta di cellule vuote senza aggiungere un anticorpo (controllo negativo) e regolare la dispersione diretta (FSC) e la dispersione laterale (SSC) per superare la scala della popolazione negativa con la colorazione anticorpale.
- Esegui le singole provette cellulari marcate con anticorpi (ad esempio, MFGE8 + IgG H&L Alexa Fluor 488 di capra anti-coniglio, o BAMBI + IgG ANTI-CONIGLIO DI CAPRA H&L Alexa Fluor 647) come controllo di gating per determinare dove inizia la positività nel grafico.
- Eseguire le provette del campione sperimentale per ordinare e raccogliere la popolazione cellulareBAMBI ad altoMFGE8.
- Placcare le MSC BAMBIhighMFGE8high in una piastra a 24 pozzetti e coltivare le cellule in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% di CO2.
- Quando le MSC BAMBIhighMFGE8selezionate sono cresciute per due passaggi per ottenere un numero sufficiente di cellule, dissociare le cellule ed eseguire un'analisi post-selezione per garantire la purezza delle popolazioni cellulari selezionate mediante citometria a flusso, come descritto nei passaggi 2.1-2.9. In alternativa, esaminare la purezza delle cellule selezionate con l'immunofluorescenza convenzionale rispetto all'espressione umana di BAMBI e MFGE8 se il numero di cellule raccolte è troppo piccolo.
3. Caratterizzazione dellealte MSC di BAMBIad alto MFGE8
- Coltiva le MSC BAMBIhighMFGE8selezionate in una piastra a 12 pozzetti, esamina la loro morfologia cellulare al microscopio e confrontale con quella delle MSC non selezionate.
NOTA: In generale, le cellule adaltoMFGE8 di BAMBI crescono più velocemente delle UC-MSC non selezionate. - Quando le cellule sono confluenti per circa il 90% nella piastra a 12 pozzetti, aspirare il terreno di coltura cellulare, lavare le cellule una volta con 1x PBS e aggiungere 500 μL di reagente di estrazione dell'RNA alle cellule. Agitare lentamente la piastra a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
- Pipettare la miscela e trasferirla in una provetta priva di RNasi e DNasi. Aggiungere 100 μl di cloroformio, tappare la provetta e agitare energicamente la miscela agitando per 15 s. Quindi, lasciare che il tubo rimanga in RT per 3 minuti.
- Centrifugare la provetta per 15 minuti a 11.000 × g e 4 °C.
- Trasferire circa 200 μl dello strato acquoso superiore in una nuova provetta. Aggiungere lo stesso volume di isopropanolo e pipettare accuratamente su e giù più volte. Quindi, lasciare riposare il composto a RT per 10 minuti.
- Centrifugare per 15 minuti a 11.000 × g e 4 °C. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 500 μl di etanolo al 75% al pellet nella provetta e capovolgere delicatamente la provetta più volte.
- Centrifugare la provetta per 5 minuti a 6.000 × g e 4 °C. Scartare il surnatante. Ripetere la centrifugazione una volta per 10 s a 6.000 × g, aspirare con cura il liquido rimanente tramite pipetta e asciugare la provetta a RT.
- Aggiungere 10 μL di acqua priva di RNasi per sciogliere il pellet di RNA e misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
- Seguire le istruzioni del produttore per sintetizzare il cDNA del primo filamento fino a 1 μg di RNA totale.
- Utilizzare un kit qPCR per rilevare e quantificare l'espressione genica, secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Le sequenze dei primer di DNA utilizzati sono elencate nella Tabella 1.
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Risultati
La Figura 1 mostra i profili di espressione dei marcatori di superficie cellulare delle UC-MSC umane. Le MSC in coltura erano fortemente positive per l'espressione di CD44, CD73, CD90 e CD105 e negative per l'espressione di CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR. Le MSCalte di BAMBIMFGE8sono state selezionate da UC-MSC umane coltivate e la loro espressione di BAMBI e MFGE8 è stata rianalizzata mediante citometria a flusso dopo l'espansione per 3-4 passaggi (
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Discussione
Questo protocollo descrive come isolare e arricchire la sottopopolazioneBAMBI highMFGE8 high da UC-MSC umane. Il metodo è importante per ulteriori studi sulla morfologia, la crescita e la funzione di questo sottogruppo di MSC. Alcuni passaggi sono fondamentali per il successo dell'isolamento e l'elevata resadelle celle BAMBIad altoMFGE8.
In primo luogo, l'aspetto tecnico più critico da considerare è l'uso di una solu...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzione n. 82271843).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per microcentrifuga da 0,6 mL | Corning | Axygen MCT-060-A | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Beijing Labgic Technology | MCT-001-150 | |
| Piatto per colture cellulari da 100 mm. | Beijing Labgic Technology | 12311 | |
| Piastra da 12 pozzetti | Beijing Labgic Technology | 11210 | |
| Provetta da centrifuga da 15 mL | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00115 | |
| Piastra da 24 pozzetti | Beijing Labgic Technology | 11310 | |
| Provetta da centrifuga da 50 mL | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00150 | |
| 5 mL Tubi a fondo tondo | Corning | FALCON 352003 | |
| 70 μ filtro per cellule m | Falcon | 352350 | Diluizione: 1:1000 |
| APC anti-umano CD79a (Ig&alfa;) Anticorpo | BioLegend | 333505 | 581 Diluizione: 1:200 |
| APC/Cianina7 anti-umano CD73 (Ecto-5'-nucleotidasi) Anticorpo | BioLegend | 344022 | G46-6 Diluizione: 1:200 |
| APC-Cy7 IgG1 di topo, κ Controllo degli isotipi | BD Bioscience | 557873 | MOPC-31C (Controllo degli isotipi) Diluizione: 1:200 |
| Anticorpo BAMBI | Bioss | bs-12418R | |
| Brilliant Violet 510 anti-topo/umano CD44 Anticorpo | BioLegend | 103044 | 5E10 Diluizione: 1:200 |
| Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400646 | MOPC-21 (controllo isotipo) Diluizione: 1:200 |
| CD105 (endoglin) Anticorpo monoclonale APC | eBioscience | 17-1057-42 | HM47 Diluizione: 1:200 |
| Vetrini della camera di conteggio delle cellule | Shanghai QIUJING | XB-K-25 | |
| Centrifuga | Pechino BAIYANG | BY-320C | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| Cloroformio | XILONG Scientific | 13700908 | |
| DMEM/F-12 (1:1) basico (1x) | Gibco | C11330500BT | |
| EDTA (0,5 M), pH 8,0, senza RNAsi | Invitrogen | AM9260G | Diluizione: 1:1000 |
| Etanolo | XILONG Scientific | 12803405 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| FITC Topo Anti-Umano CD34 | BD Bioscience | 555821 | IM7 Diluizione: 1:200 |
| FITC Topo Anti-Umano CD45 | BD Bioscience 555482 | AD2 Diluizione: 1:200 | |
| FITC Topo Anti-Umano HLA-DR | BD Bioscience 555811 | SN6 Diluizione: 1:200 | |
| Citometro a flusso | BD Bioscience | FACSAria&commercio; III Cell SorterAria | |
| Flowjo | BD Bioscience | V10 | |
| Reagente di dissociazione cellulare delicato | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| IgG anti-topo di capra H& L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150113 | HI30 Diluizione: 1:200 |
| IgG H& L (AlexaFluor 594) | abcam | ab150080 | Diluizione: 1:1000 |
| HiScript II Q RT SuperMix per qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| Microscopi invertiti Nikon | ECLIPSE Ts2 | ||
| Alcool isopropilico | XILONG Scientific | 12802505 | |
| MFGE8 anticorpo | Biorbyt | orb388429 | Diluizione: 1:100 |
| Microcentrifuga | Thermo Fisher Scientific | FRESCO 21 | |
| Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC | eBioscience | 17-4714-42 | P3.6.2.8.1 (Controllo dell'isotipo) Diluizione: 1:200 |
| Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC | eBioscience | 11-4714-42 | eBMG2b (Isotype Control) Diluizione: 1:200 |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC | eBioscience | 11-4732-42 | RTK4530 (controllo isotipico) Diluizione: 1:200 |
| PBS (10x) | Sangon Biotech (Shanghai) | E607016-0500 | |
| PE-Cy5 Topo Anti-Umano CD90 | BD Bioscience | 555597 | P3.6.2.8.1 (Controllo isotipico) Diluizione: 1:200 |
| PE-Cy5 IgG1 di topo κ Controllo degli isotipi | BD Bioscience | 550618 | |
| Penicillina-Streptomicina 100x | Cytiva | SV30010 | Diluizione: 1:100 |
| Sistema PCR in tempo reale | Biosistemi applicati diThermo Fisher Scientific | Q6 | |
| Spettrofotometro QIAGEN | 129112 | ||
| Thermo Fisher Scientific | NanoDrop One (840-317400) | ||
| Puntali sterili per micropipette | Labgic Technology | Diluizione: Pallone per colture cellulari 1:100 | |
| T75 | Beijing Labgic Technology | 13212A | |
| Termociclatore | Biosistemi applicati byThermo Fisher Scientific | Reagente Veriti | |
| Tri Sigma | Aldrich | T9424 | |
| Soluzione Typsin-EDTA | Bio-Channel Biotechnology | BC-CE-005 | |
| Camicia d'acqua CO2 Incubatrice | Thermo Fisher Scientific | 3111 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
