Descriviamo un semplice protocollo per la rimozione della statocisti e dei tessuti associati nello ctenoforo Mnemiopsis leidyi, che è suscettibile di imaging dal vivo.
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Articolo metodologico
Rimozione chirurgica di un organo sensoriale complesso in ctenofori altamente rigenerativi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo ctenoforo Mnemiopsis leidyi è un classico modello animale di rigenerazione di tutto il corpo. L'aumento della trattabilità di molte tecniche di laboratorio e la loro collocazione filogenetica come probabile gruppo gemello dei restanti Metazoi ha portato a un recente rinnovamento dell'interesse scientifico nel lavorare con gli ctenofori. Possono rigenerare qualsiasi organo o tipo di cellula mancante, inclusa la rigenerazione completa di tutto il corpo da un frammento piccolo come ~15% del corpo, nel corso di pochi giorni. Come la maggior parte degli ctenofori, M. leidyi ha un organo sensibile alla gravità localizzato aboricamente che collega l'input sensoriale all'output motorio per controllare la posizione e l'orientamento del corpo. Questo protocollo dimostra la rimozione chirurgica del complesso dell'organo aborale (AO) e delle strutture associate in M. leidyi insieme a metodi di coltura, manipolazione e montaggio appropriati per visualizzare i processi di guarigione e rigenerazione delle ferite che avvengono nelle ore o nei giorni successivi. Queste semplici tecniche sono ampiamente adattabili a diversi paradigmi sperimentali e contesti di laboratorio.
Introduzione
Gli ctenofori, noti anche come meduse a pettine, sono cosmopoliti per gli ambienti marini della Terra e possono essere i principali attori degli ecosistemi, in particolare come parte della rete alimentare. Lo ctenoforo Mnemiopsis leidyi è un modello animale storicamente istoriato e sempre più popolare di rigenerazione di tutto il corpo 1,2. La loro capacità di rigenerare qualsiasi organo o tipo di cellula mancante sorge verso la fine dell'embriogenesi e persiste per tutta la loro vita postembrionale 3,4 (da ~0,1 a >1.000 mm di dimensioni corporee). Sono anche trasparenti per tutta la loro vita e sono suscettibili a diverse tecniche di imaging dal vivo e fisse. L'antenato comune più recente di tutti gli ctenofori aveva molti tipi di cellule e organi complessi; la maggior parte degli ctenofori esistenti possiede la maggior parte di questi durante almeno una fase della vita: un organo aborale, sensibile alla gravità (storicamente chiamato organo apicale e qui chiamato organo aborale, AO), strutture locomotorie specializzate composte da macrociglia altamente organizzate che battono in modo coordinato (file di pettini), tentacoli di alimentazione retrattili e fotociti che bioluminescono in risposta a stimoli nocivi (Figura 1).
Nonostante i loro numerosi tipi di cellule e i comportamenti complessi e dipendenti dal contesto, un robusto corpo di dati genomici supporta il posizionamento degli ctenofori come probabile gruppo gemello di tutti gli altri animali viventi 5,6,7,8. Le principali differenze nelle basi cellulari e funzionali del sistema nervoso dello ctenoforo rispetto ad altri animali che possiedono un sistema nervoso (bilateri e cnidari) hanno suggerito l'ipotesi che il sistema nervoso dello ctenoforo rappresenti un'origine indipendente; tuttavia, questo rimane incerto 9,10,11,12.
Il complesso dell'organo sensoriale aborale include la statocisti, che comprende molti tipi di cellule, inclusi diversi tipi di cellule neurosensoriali putative 13,14,15,16,17,18, ed è in costante manutenzione in ctenofori non manipolati. Le cellule meccanosensoriali portano grandi fasci ciliari, che vengono deviati da uno statolite costituito da cellule biomineralizzate (chiamate litociti) per rilevare la gravità. Due "campi polari", che contengono strutture sensoriali putative di funzione sconosciuta14 e probabili cellule fotosensoriali16, sono adiacenti alla statocisti.
L'indagine sperimentale sulla capacità rigenerativa di M. leidyi ha abbracciato gli animali più piccoli nella transizione da embrione a schiusa (~100 μm) fino agli adulti macroscopici a vita libera (>2 cm). M. leidyi di ~1 mm di diametro corporeo sono abbastanza grandi da consentire la manipolazione chirurgica manuale senza strumenti speciali come i micromanipolatori, ma sono abbastanza piccoli da essere montati su un vetrino da microscopio standard per l'imaging con obiettivi ad alta potenza. Questo protocollo dimostra la rimozione chirurgica dell'organo sensoriale aborale e delle strutture associate, insieme a metodi di coltura e imaging appropriati per documentare i processi di guarigione e rigenerazione delle ferite che avvengono nelle ore o nei giorni successivi.
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Protocollo
1. Preparare strumenti e forniture
- Utilizzando un bruciatore Bunsen standard, estrarre a mano gli aghi di dissezione in vetro dalle micropipette capillari in vetro. Per animali di dimensioni superiori a 1 mm, utilizzare micropipette calibrate in vetro sodo-calcico destinate alla manipolazione di liquidi.
NOTA: La dimensione di 100 μl funziona bene nell'intervallo focale di 0,5-3 mm.- Stabilisci un cono di fiamma blu affilato nel bruciatore Bunsen.
- Tenere il punto centrale della pipetta di vetro nella fiamma finché non si è ammorbidita abbastanza da potersi muovere con una leggera pressione.
- Togliete la pipetta dal fuoco e separate immediatamente i due lati per creare un ago corto e forte.
NOTA: L'ago di vetro può essere rifuso se non si ottiene un risultato soddisfacente al primo tentativo e gli aghi rotti possono essere salvati e tirati nuovamente. Vedere la Figura 2 per esempi di aghi utilizzabili e inutilizzabili tirati con questo metodo.
ALTERNATIVA: Anche gli aghi da 26 G 1/2 pollice funzionano bene, soprattutto all'estremità più grande della gamma di dimensioni focali.
- Preparare l'acqua di mare sterile facendo passare l'acqua di mare naturale o artificiale attraverso un filtro da 0,22 μm.
- Creare pipette di misurazione.
- Usando forbici affilate o una lama di rasoio, tagliare una pipetta di trasferimento in plastica per produrre un'apertura con il diametro interno della dimensione preferita. Tenere a portata di mano almeno una pipetta per la parte superiore dell'intervallo desiderato e una per la parte inferiore dell'intervallo desiderato. Vedere la Figura 3 per un esempio di set di pipette di misurazione.
NOTA: Queste pipette funzionano bene fino a ~8 mm. È anche possibile stimare le dimensioni con un micrometro o strumenti di misurazione da fotografie.
- Usando forbici affilate o una lama di rasoio, tagliare una pipetta di trasferimento in plastica per produrre un'apertura con il diametro interno della dimensione preferita. Tenere a portata di mano almeno una pipetta per la parte superiore dell'intervallo desiderato e una per la parte inferiore dell'intervallo desiderato. Vedere la Figura 3 per un esempio di set di pipette di misurazione.
2. Prepara gli animali per l'esperimento
- Selezionare individui morfologicamente normali delle dimensioni e dello stadio desiderati.
NOTA: Troviamo che gli animali di ~0,5-3 mm di diametro siano ottimali per il montaggio su scivoli. Verificare che gli animali non entrino nella pipetta di dimensionamento inferiore ma che si adattino comodamente alla pipetta di dimensionamento superiore di gamma. - Affamare gli animali da esperimento per 8-16 ore.
NOTA: Sebbene i M. leidyi siano otticamente trasparenti e non altamente autofluorescenti, il cibo che circola attraverso il loro sistema digestivo è generalmente opaco e spesso autofluorescente.
3. Eseguire tagli
- Utilizzare una pipetta di trasferimento più larga delle dimensioni corporee dell'animale da esperimento per trasferirla in una capsula di polistirene da 35 mm contenente acqua di mare sterile.
- Visualizzare il campione utilizzando il microscopio da dissezione. Fai rotolare un animale sul suo lato adesofageo (Figura 1). Questa vista offre l'accesso più facile per rimuovere l'organo aborale. Concentrati sull'organo aborale.
NOTA: L'ingrandimento più utile può variare in base alle dimensioni dell'animale e alle preferenze dell'utente. Generalmente l'ingrandimento 12-20x funziona bene. - Tenere delicatamente l'animale in posizione con un ago di vetro usando la mano non dominante.
- Usando la mano dominante, inserire la punta di un ago leggermente sotto l'organo aborale. Entrare obliquamente per fare un taglio da un bordo visibile dell'organo aborale fino a sotto la sua base. Estrarre l'ago e fare un secondo taglio per rimuovere un pezzo di tessuto a forma di cuneo contenente tutte le strutture dell'organo aborale (vedi Figura 4, pannello superiore). Esaminare attentamente l'animale e il tessuto asportato per assicurarsi che l'operazione abbia avuto successo.
- Utilizzare la stessa pipetta di trasferimento per spostare l'animale appena tagliato in un piatto fresco contenente acqua di mare sterile.
NOTA: La ferita si chiuderà rapidamente, quindi a seconda degli obiettivi sperimentali (ad esempio per più campioni che si rigenerano in modo sincrono o per visualizzare le prime fasi di guarigione e rigenerazione), è necessario muoversi rapidamente per generare diversi campioni. Usa un timer per limitare il tempo chirurgico e mantenere più vicine coorti di animali in rigenerazione.
4. Verificare che i tagli siano corretti
NOTA: Anche controllando attentamente al microscopio da dissezione, a volte è possibile non notare errori chirurgici.
- Seguire i passaggi di montaggio riportati di seguito per montare temporaneamente ogni individuo post-chirurgico su un vetrino per verificare al microscopio composto con DIC che tutte le strutture previste siano state rimosse correttamente. Eseguire questo controllo anche se non si eseguono ulteriori immagini in questo momento.
NOTA: Le ottime capacità curative degli ctenofori li prestano bene agli esperimenti di innesto; Rimuoviamo sempre gli organi aborali asportati dal recipiente di coltura per evitare la possibilità che i lati tagliati di un AO rimosso e il resto dell'animale da cui è stato rimosso possano attaccarsi e fondersi.
Se non si procede direttamente all'imaging a lungo termine, non sigillare il vetrino. Ciò faciliterà il rapido recupero e il ritorno alla coltura di questo animale da esperimento. Si consiglia di controllare l'accuratezza chirurgica ad alto ingrandimento. In particolare, lo statolite può essere espulso dalla cupola senza completare l'intervento chirurgico.
5. Imaging dal vivo
- Montante
- Trattare un vetrino da microscopio in vetro standard con un agente silanizzante, come un idrorepellente per il trattamento del vetro, e lasciare asciugare completamente.
- Trasferire un animale post-chirurgico su un vetrino preparato con una pipetta di trasferimento. Conferma che l'acqua gocciola con l'animale all'interno.
- Metti una piccola quantità di argilla da modellare (~1,5 mg) su ogni angolo di un coprioggetto per formare dei "piedini" che serviranno da distanziatore per sollevare il coprioggetto dall'animale.
- Posizionare delicatamente il vetrino, con l'argilla rivolta verso il basso, sopra l'animale. Tenendo ogni angolo del vetrino, far rotolare l'animale in posizione per l'imaging. Premere verso il basso per comprimere leggermente l'animale, tenendolo in posizione. Riposizionare il campione quanto necessario per ottenere una visione soddisfacente.
- Per immagini più lunghe di ~30 minuti, applicare un sottile strato di vaselina su ciascun bordo del vetrino coprioggetto per evitare l'essiccazione del campione.
NOTA: M. leidyi montato in questo modo può essere recuperato facilmente per ulteriori colture o altri saggi. Tuttavia, gli animali generalmente si liberano e si riposizionano entro 1-2 ore, quindi un'acquisizione time-lapse continua più lunga di 2 ore richiederebbe un approccio di imaging diverso.
6. Coltura
- Condizioni di coltura dei cidippidi
- Animali manipolati chirurgicamente e controlli in acqua di mare naturale o artificiale filtrata vicino alla temperatura ambiente. Utilizzare un incubatore impostato a 20-22 °C per garantire risultati coerenti.
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Risultati
M. leidyi allo stadio di cidippide in genere completa la chiusura della ferita entro ~20 minuti dalla lesione (Figura 4 e Figura 5), mentre la rigenerazione completa dell'organo può richiedere 1-3 giorni. Questa tempistica ha una certa variabilità biologica, ma è quasi invariabilmente completata entro 72 ore dall'intervento chirurgico (Figura 6).
La rimozione chirurgica delle cellule e della meso...
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Discussione
Esperimenti simili potrebbero essere eseguiti su qualsiasi dimensione di M. leidyi desiderata; La morfogenesi dell'organo si completa in concomitanza con l'inizio della capacità rigenerativa4. Gli animali possono essere raccolti in natura19 o allevati in laboratorio20,21. Se si desidera una particolare dimensione corporea, gli animali possono essere autorizzati a deporre le...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Jovita Joseph.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m Filtro per siringa SFCA | Thermo/Nalgene | 723-2520 | creare acqua di mare sterile |
| Piastra di Petri in polistirene da 35 mm | Falco/Corning | 351008 | eseguire tagli; Cultura Piccoli Animali |
| Siringa luer-lock monouso da 60 mL | Forniture BH | BH60LL | creare acqua di mare sterile |
| Pipette in vetro calibrate, 100 &; L | Drummond | 2-000-100 | eseguire tagli |
| Occhiali di copertura, #1,5, 18 mm quadrati | VWR | 16004-326 | Supporto per l'imaging |
| ctenofori | Esemplari del Golfo | animali vivi | |
| Vetrini a depressione a doppia cavità, 1,3 mm | VWR | 470200-930 | Supporto per l'imaging |
| vetrini per microscopio | VWR | 16004-398 | Supporto per l'imaging |
| Sale marino istantaneo dell'oceano | Oceano istantaneo | terreno di coltura animale | |
| mini righello | Ted Pella | 13623 | Misurare le pipette di plastica |
| argilla da modellare (plastilina) | Pepy Plastilina | Supporto per l'imaging | |
| gelatina di petroelum | Vaselina | Supporto per l'imaging | |
| Pipette di trasferimento in plastica (misure assortite) | Cole-Parmer | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | spostare piccoli animali |
| Trattamento del vetro Rain-X | Pioggia-X | Silanizzare i vetrini per microscopio | |
| righello | Westcott | 10564 | Misurare le pipette di plastica |
| forbici | OXO | Pipette in plastica tagliate |
Riferimenti
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