Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

Summary

Presentiamo un metodo per un modello di patogenesi fungina che preserva il posizionamento naturale delle spore fungine nelle vie aeree polmonari per l'analisi tramite microscopia a fluorescenza.

Abstract

I funghi infettano gli esseri umani quando le spore ambientali vengono inalate nei polmoni. Il polmone è un organo eterogeneo. Le vie aeree conduttrici, compresi bronchi e bronchioli, si ramificano fino a terminare nello spazio aereo alveolare dove avviene lo scambio di gas. Le infezioni che hanno origine nei bronchioli o negli alveoli suscitano risposte distinte dell'ospite e manifestazioni della malattia. Pertanto, capire con precisione dove le spore si localizzano naturalmente nei polmoni, in particolare subito dopo l'infezione, amplia le opportunità di indagine sulle interazioni ospite-patogeno. In questo articolo, descriviamo in dettaglio un'analisi in situ dei polmoni di topi infettati con artroconidi Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. I metodi convenzionali per la conservazione istologica prevedono il gonfiaggio liquido delle vie aeree con una soluzione fissativa, che sposta la posizione naturale delle particelle fungine aspirate, spingendo le spore dai bronchioli prossimali agli spazi aerei terminali.

Al contrario, questo metodo di gonfiaggio dell'aria con la perfusione-fissazione della vascolarizzazione sanguigna preserva la posizione fisiologica delle spore fungine all'interno dei bronchioli. Inoltre, descriviamo un approccio semplice alla crioconservazione, all'inclusione e all'imaging di campioni polmonari. Condividiamo anche tecniche computazionali ad alto rendimento tramite il programma open source QuPath per analizzare la distribuzione spaziale delle spore fungine all'interno del polmone. Il metodo qui presentato è semplice e veloce, richiede un'attrezzatura minima per essere eseguito e può essere facilmente adattato per l'uso con molti modelli di infezione fungina respiratoria.

Introduction

Gli esseri umani possono inalare fino a miliardi di spore al giorno da una varietà di funghi ambientali¹. Per comprendere le nostre difese di barriera contro queste spore inalate, dobbiamo apprezzare i precisi ambienti microanatomici in cui queste spore atterrano all'interno delle vie aeree e del parenchima polmonare. La composizione cellulare delle vie aeree (cioè le cellule epiteliali) si trasforma in modo significativo lungo la trachea, i bronchi, i bronchioli e gli alveoli. Ognuna di queste regioni distinte è composta da diversi tipi di cellule con funzioni discrete che si avvalgono di un arsenale di difese per prevenire l'infezione patologica.

La posizione precisa della deposizione di spore fungine polmonari può variare tra i lumi delle vie aeree dei bronchioli colonnari rivestiti di epiteli, dei dotti alveolari o degli alveoli². La maggior parte delle specie fungine clinicamente rilevanti produce spore di diametro compreso tra 1 μm e 10 μm³. La deposizione di queste particelle di spore nel polmone dipende da diversi fattori, come l'aerodinamica, la densità, la carica elettrica e le forze foretiche, che possono influenzare il meccanismo di sedimentazione dopo l'inalazione⁴. Generalmente, le particelle di grandi dimensioni (> 6 μm) si depositano nelle vie aeree superiori, le particelle di medie dimensioni (2-6 μm) possono depositarsi nelle vie aeree più piccole e le particelle piccole (<2 μm) raggiungono la regione alveolare⁵. È stato riportato che le spore di Aspergillus (2-3 μm) raggiungono gli spazi alveolari, ma i referti di patologia clinica indicano anche un carico significativo di malattia bronchiale e bronchiolare⁶. C'è anche un crescente riconoscimento delle infezioni fungine endobronchiali di Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida species, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum e Zygomycetes a causa della crescente popolarità della broncoscopia flessibile⁷. Recenti progressi nell'imaging microscopico delle infezioni da Aspergillus nei topi hanno anche rivelato che gli spazi aerei più prossimali, come bronchi e bronchioli, possono sopportare il carico più elevato per la proliferazione fungina patologica⁸. La ricerca sulla risposta dell'ospite alle infezioni fungine polmonari ha dimostrato che sia le cellule epiteliali bronchiolari che le cellule epiteliali alveolari svolgono un ruolo importante come sentinelle immunitarie, quindi chiarire i siti esatti di deposizione delle spore e l'interazione epiteliale sarà vitale per il lavoro futuro ^2,9,10.

Lo studio di queste dinamiche di patogenesi delle vie aeree prossimali è difficile perché le tecniche standard di fissazione polmonare e preparazione del sezionamento possono spostare le spore da queste posizioni prossimali nelle vie aeree rivestite di epitelio e spingerle verso le regioni alveolari terminali distali. Comunemente, il 10% di formalina o il 4% di paraformaldeide viene utilizzato per gonfiare i polmoni ed esporre rapidamente l'intero polmone al fissativo. Quando si preparano i polmoni per la criosezione, alcuni gruppi somministrano ai polmoni un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) per migliorare le prestazioni di criosezione¹¹. Queste pratiche sono utili nel giusto contesto, ma è stato scoperto dal nostro laboratorio e da altri gruppi che spostano spore e particelle dalle posizioni prossimali, interferendo così con le interpretazioni sui tipi di cellule esposte alle spore e la successiva risposta dell'ospite¹².

Per stabilire con precisione la localizzazione microanatomica delle spore fungine inalate, abbiamo sviluppato un metodo rapido e a basso consumo di risorse per la conservazione della posizione delle spore fungine nelle vie aeree dei topi. Abbiamo adattato un metodo murino di fissazione della perfusione vascolare con gonfiaggio dell'aria da Thomas et al. (2021), in cui abbiamo ridotto la quantità di attrezzature, il tempo e le competenze tecniche necessarie per ottenere un risultato soddisfacente¹³. Dal metodo qui descritto, abbiamo osservato che gli artroconidi Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (di dimensioni 3-5 μm) si accumulano più prossimalmente di quanto precedentemente dimostrato, vale a dire nei bronchioli distali e nelle giunzioni bronco-alveolari piuttosto che negli alveoli terminali. Queste informazioni possono focalizzare questioni biologiche riguardanti i tipi di cellule critiche associate a queste regioni del polmone e la loro influenza sulle risposte precoci alle spore fungine inalate.

Protocol

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Marcare le spore con fluorescenza intracellulare

1. Colorare 1 x 10⁶ spore in carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), Cell Tracker Orange o Cell Tracker Red (o colorante intracellulare a scelta) a 5 μM per 30 minuti a 30 °C, quindi lavare con PBS e centrifugare le spore a 12.000 x g. Ripetere questo lavaggio una volta.
2. Preparare l'inoculo di spore alla concentrazione appropriata in modo che 25 μl contengano la dose di spore appropriata per un topo.

2. Inoculazione di spore nel topo mediante inalazione per aspirazione mediante anestesia con isoflurano

ATTENZIONE: L'isoflurano è un agente anestetico volatile e deve essere utilizzato all'interno di una cabina di biosicurezza canalizzata o di una cappa aspirante.

1. Per preparare il barattolo per l'esposizione all'isoflurano, metti un tovagliolo piegato in un barattolo Nalgene da 1 litro con tappo a vite e posiziona un cerchio di rete di plastica sopra il tovagliolo come piattaforma per i topi. Aggiungere 2 ml di isoflurano al tovagliolo, chiudere il barattolo e attendere 1-2 minuti affinché il gas si equilibri nel contenitore.

Figura 1: Apparecchio per il metodo di inoculazione delle spore a goccia aperta di isoflurano. Un tovagliolo piegato viene posizionato sul fondo di un barattolo con tappo a vite da 1 L, quindi viene inserita una rete circolare di plastica che funge da piattaforma per i topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Prima di esporre il topo all'anestesia, preparare una pipetta con 25 μl di inoculo. Posizionare il topo nel contenitore dell'isoflurano e inclinare il contenitore per monitorare la perdita del riflesso raddrizzante, dove il topo ha perso conoscenza ed è capovolto. Questo di solito richiede circa 10 s.
3. Monitorare la frequenza respiratoria (RR) fino a quando non rallenta a 50-80 respiri al minuto (bpm), circa il 50% della RR a riposo. Questo di solito richiede altri 10 secondi. A questo punto, rimuovere il topo dal barattolo di isoflurano.
   NOTA: Questa è un'alta concentrazione di isoflurano, che produrrà una rapida induzione dell'anestesia, e il topo deve essere monitorato molto attentamente. Il sovradosaggio letale di isoflurano è un rischio, poiché la concentrazione di isoflurano può essere variabile e la curva dose-risposta all'isoflurano è molto ripida. Se la frequenza respiratoria scende al di sotto di 50 bpm e/o è irregolare, rimuovere il topo dall'isoflurano, lasciarlo recuperare per 3-5 minuti e riprovare (un massimo di due tentativi ripetuti).
4. Confermare la profondità dell'anestetico in caso di mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Quindi, posiziona il mouse in posizione supina con una mano e consenti al mouse di fare 3-5 respiri ansimanti regolari con velocità crescente (a partire da 50-60 bpm) e vigore. All'inizio, posizionare la punta della pipetta nella parte posteriore dell'orofaringe del topo e rilasciare l'inoculo durante l'inalazione.
   NOTA: Questi rantoli attraverso la bocca scuotono la testa inferiormente a causa del reclutamento di muscoli accessori per la respirazione. Quando la pipetta viene inserita durante questi sussulti, la bocca dovrebbe aprirsi ad ogni rantolo. Se la bocca non si apre, il topo non è sufficientemente anestetizzato e probabilmente non inalerà il contenuto dall'orofaringe. La pipetta deve premere la lingua, spingendola verso il fondo e la parte anteriore della bocca per evitare l'ingestione dell'inoculo. Quando la pipetta è in bocca e il topo è adeguatamente anestetizzato, il topo aprirà la bocca ad ogni rantolo.
5. Con la mano e il pollice che tengono il topo, sentire la presenza di crepitii sugli aspetti posteriore e anteriore del torace del topo per confermare l'inalazione dell'inoculo.

3. Eutanasia dei topi

1. Iniettare nel topo per via intraperitoneale un cocktail di 200 mg/kg di ketamina e 24 mg/kg di xilazina 10 minuti prima del momento del sacrificio.
2. Attendere 10 minuti dopo l'iniezione fino a quando il topo entra in un piano chirurgico di anestesia, confermato dalla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.

4. Perfusione dei polmoni con PBS e formalina

1. Spruzzare il topo anestetizzato con etanolo al 70%. Usa le forbici per tagliare la pelle del mouse e separare la pelle per esporre il peritoneo su tutti i lati. Tirare la pelle dalla metà superiore del topo sopra la sua testa, estraendo le braccia dalla pelle.
2. Tagliare la membrana peritoneale allo sterno e lungo la faccia inferiore della gabbia toracica, esponendo il peritoneo. Sposta il fegato inferiormente, rivelando il diaframma. Usa le forbici per perforare con cura il diaframma lontano dal parenchima polmonare per evitare di perforare un foro nei polmoni stessi.
   NOTA: La perforazione involontaria dei polmoni renderà impossibile il successivo gonfiaggio dell'aria.
3. Dopo che il diaframma è stato perforato, l'aria entra nel torace, facendo collassare i polmoni. Taglia la gabbia toracica sul lato sinistro per rivelare il cuore. Iniettare 5-10 ml di PBS nel ventricolo destro con un ago da 30 G a una velocità di 1 ml per 5 s (per evitare di danneggiare i vasi), sbiancando rapidamente i polmoni.
   ATTENZIONE: La formalina è una sostanza volatile pericolosa che deve essere maneggiata all'interno di una cabina di biosicurezza canalizzata o di una cappa aspirante.
4. Al termine, rimuovere l'ago e utilizzare un nuovo ago per iniettare 5 mL di formalina tamponata neutra (NBF) al 10% nel ventricolo destro alla stessa velocità.

5. Gonfiare l'aria del polmone perfuso

1. Rimuovere la metà anteriore della gabbia toracica. Per esporre la trachea, tagliare le costole superiori e le clavicole a destra e a sinistra del collo. Fare attenzione a evitare di tagliare vicino alla linea mediana dove si troverà la trachea. Con una pinza, afferrare le costole superiori e le clavicole rimanenti sulla linea mediana del collo e tirare superiormente fino a quando la trachea non è esposta.
2. Preparare un filo di sutura di 10 cm di lunghezza, tirarlo sotto la trachea e pre-legare un nodo sciolto all'estremità inferiore della trachea esposta. Preparare una siringa da 1 ml di aria con un catetere da 18 G. Utilizzare un ago da 18 G per praticare un foro nella trachea all'estremità superiore della regione esposta.
3. Posizionare il catetere in quel foro, assicurandosi che si adatti relativamente bene per evitare la fuoriuscita dell'aria. Iniettare lentamente 1 ml di aria nei polmoni nel corso di 10 s, osservando il gonfiaggio polmonare di tutti i lobi. Il gonfiaggio completo fa sì che i polmoni si avvolgano leggermente intorno al cuore e riempiano il volume che occupano nel diaframma non perforato.
4. Tirare il nodo stretto attorno alla trachea e rimuovere il catetere. Tenere la trachea e usare le forbici smussate per rimuovere i polmoni dal topo, facendo attenzione a non perforare il polmone.

6. Fissazione per immersione e disidratazione

1. Posizionare i polmoni sul bordo superiore di una provetta conica da 50 mL riempita con 20 mL di NBF al 10%. Tenere i fili di sutura all'esterno del conico, avvitare il tappo e capovolgere il conico in modo che i polmoni siano sospesi a testa in giù in 20 ml di NBF. Posizionare a 4 °C per 24-48 h.
2. Sciacquare i polmoni in PBS, quindi immergerli in una soluzione di saccarosio-PBS al 30% (p/v) per 72-96 ore a 4 °C per disidratare i polmoni in preparazione alla crioconservazione. Rimuovere i polmoni dal saccarosio, posizionare i polmoni in un criomold con temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelare il campione a -80 °C.

7. Criosezione

1. Equilibrare i campioni nei crioblocchi OCT alla temperatura di -20 °C del criostato per 1 ora prima del sezionamento. Sezionare i blocchi con spessori di 20-100 μm.
   NOTA: Il gonfiaggio dell'aria può portare a una maggiore fragilità del campione e il taglio a uno spessore maggiore può prevenire la rottura del tessuto durante il sezionamento.
2. Raccogliere le sezioni sui vetrini e lasciarle asciugare per 30 minuti a 1 ora per garantire l'aderenza dei tessuti al vetrino.
   NOTA: In questa fase i vetrini possono essere mantenuti a -80 °C.

8. Preparazione e blocco dei vetrini

1. Posizionare i vetrini nel bagno PBS (in un piatto o in un barattolo Coplin) per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere l'OCT dai vetrini.
   NOTA: Le sezioni più spesse (40-100 μm) potrebbero non aderire ai vetrini così come le sezioni più sottili, quindi è meglio tenerle piatte e verticali in un piatto piuttosto che metterle su un lato in un barattolo Coplin.
2. Asciugare i vetrini dopo che l'OCT si è dissolto dal tessuto. Utilizzare una salvietta per asciugare le goccioline in eccesso dal perimetro del vetrino attorno al campione di tessuto.
3. Usa un Pap pen idrofobo per disegnare un perimetro attorno al campione e lascialo asciugare per 5 minuti.
4. Preparare un tampone bloccante di soluzione bloccante animal-free con Tween-20 allo 0,3% e blocco Fc 1:100 in 300 mL per vetrino.
   NOTA: Per bersagli intracellulari, può essere utilizzato l'1% di Tween-20. Un volume di 300 μl è solitamente sufficiente, ma il volume necessario per coprire completamente il tessuto dipende dalla dimensione perimetrale del marcatore idrofobico. Il tessuto non dovrebbe asciugarsi da questo punto in poi.
5. Lasciare la soluzione bloccante sui vetrini per 1 ora a RT.

9. Immunocolorazione

1. Lavare il vetrino pipettando il fluido e aggiungendo 300-500 μl di PBS. Ripetere il lavaggio una volta.
2. Preparare l'anticorpo primario AlexaFluor-647 coniugato EpCAM (clone G8.8) di ratto (clone G8.8) in soluzione bloccante priva di animali con lo 0,33% di Tween-20 (o l'1% per i bersagli intracellulari). Aggiungere 300 μl per vetrino di questa soluzione e colorare per una notte a 4 °C.
   NOTA: Gli anticorpi devono essere testati empiricamente per la concentrazione, il tempo e la temperatura di colorazione. Le sezioni sottili (8-20 μm) vengono colorate per 30 minuti a 37 °C e le sezioni più spesse (20-100 μm) a 4 °C durante la notte utilizzando diluizioni 1:100 per la maggior parte degli anticorpi. Se si utilizzano anticorpi non coniugati, lavare 2 volte (come sopra) e applicare un anticorpo fluorescente secondario per un tempo e una temperatura determinati empiricamente. Generalmente, la colorazione secondaria degli anticorpi viene eseguita a RT per 1 ora a diluizione 1:1000.
3. Rimuovere la soluzione di anticorpi dal campione e lavare il vetrino con 300 mL di PBS per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio una volta. Asciugare i vetrini, rimuovendo tutto il liquido in eccesso dal campione e dal vetro circostante.
4. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio RT soft set (ad es. SlowFade Glass) su ciascun pezzo di tessuto. Fare attenzione a evitare bolle lasciando che la bottiglia si depositi a testa in giù e lasciando cadere lentamente ogni goccia sui fazzoletti. Posizionare un vetrino coprioggetti di dimensioni adeguate per estendersi oltre il perimetro del campione e del marcatore idrofobo.

10. Imaging tramite microscopia a fluorescenza

1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza multicanale per scansionare intere sezioni polmonari in modo imparziale utilizzando un obiettivo con risoluzione sufficiente per risolvere le singole spore e le cellule ospiti (ad esempio, Zeiss Axioscan 7 utilizzando un obiettivo a olio 20x con NA = 0,8 o simile).
   NOTA: Assicurarsi che la potenza del laser e il guadagno di tensione PMT siano impostati per massimizzare i rapporti segnale/rumore del bersaglio sullo sfondo determinati con un controllo a fluorescenza meno uno (FMO).
2. Raccogli un numero sufficiente di tessere dell'immagine per catturare l'intero lobo polmonare (ad esempio, ~200 tessere di dimensioni 400 μm x 400 μm). Utilizzare il programma software del microscopio (ad es. Zeiss ZEN 3.7 o simile) per esportare l'immagine della piastrella unita per l'elaborazione a valle.

11. Analisi spaziale tramite QuPath

1. In QuPath, un software open source gratuito¹⁴, crea un file di progetto e aggiungi le immagini fluorescenti al file.
2. Classificare i pixel EpCAM+ come epitelio facendo clic sull'opzione del menu in alto Classifica, quindi su Classificazione pixel > Crea soglia. Selezionate la risoluzione, il canale, il sigma di levigatura e il valore di soglia che meglio identifica la regione di destinazione. Salvare il classificatore con un nome univoco e selezionare Crea oggetti.
3. Nella nuova finestra Crea oggetti , selezionare Nuovo tipo di oggetto come Annotazione. Per l'epitelio polmonare, impostare la dimensione minima dell'oggetto e la dimensione minima del foro su 100 mm². Non è necessario selezionare Dividi oggetti qui. Dopo aver selezionato OK, le annotazioni verranno create e potranno essere modificate a occhio nudo utilizzando lo strumento Pennello nell'area in alto a sinistra.
4. Per classificare le spore, ripetere i passaggi da 11.3 a 11.4 utilizzando il canale in cui sono state catturate le spore e impostare il nuovo tipo di oggetto Rilevamento anziché Annotazione. Impostare la dimensione minima dell'oggetto e la dimensione minima del foro su 0 mm² e selezionare Dividi oggetti.
5. Per eseguire l'analisi spaziale delle spore, selezionare l'opzione di menu in alto Analizza > Analisi spaziale > Calcola distanza con segno dalle annotazioni 2D. Le distanze dall'epitelio EpCAM+ saranno calcolate per ogni spora rilevata. Esportali tramite l'opzione del menu in alto Misura > Esporta misure.

Results

Questo metodo produce infine immagini immunofluorescenti dei polmoni di topo utilizzando il gonfiaggio fisiologico dell'aria per lasciare indisturbate le vie aeree. È importante sottolineare che più punti di controllo lungo il percorso confermeranno che i componenti del protocollo sono stati eseguiti correttamente. Durante l'inoculazione, è importante confermare che l'inoculo sia stato aspirato sentendo la presenza di "crepitii" sulla parete toracica posteriore del topo che indicano che il liquido è entrato nelle vie aeree. Se non c'è sensazione di crepitii, è possibile che il topo abbia ingoiato l'inoculo. La perfusione dei polmoni di topo con PBS dovrebbe provocare una screziatura bianca dei polmoni seguita da uno sbiancamento completo dell'intero polmone (Figura 2A). In caso di sbiancamento incompleto, la successiva perfusione di formalina non raggiungerà tutte le aree del parenchima polmonare (Figura 2B). Quando si gonfia il polmone con aria, i polmoni devono distendersi lentamente fino a raggiungere le dimensioni fisiologiche. Dopo aver legato la sutura tracheale per fissare l'aria all'interno dei polmoni, i polmoni non devono contrarsi di dimensioni. Se lo fanno, è probabile che il polmone sia stato perforato durante la procedura.

Qui, mostriamo immagini rappresentative di sezioni con spore marcate di Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (verde) e epitelio bronchiolare colonnare EpCAM+ (magenta) sia nei polmoni gonfiati ad aria che in quelli gonfiati a liquido in formalina (Figura 3A, B rispettivamente). Queste spore si accumulano principalmente all'interno dei bronchioli distali e negli spazi alveolari immediatamente adiacenti a quei bronchioli distali, probabilmente nei dotti alveolari. I polmoni gonfiati ad aria con fissativo perfuso contengono spore che compaiono più frequentemente all'interno dei bronchioli e si raggruppano più vicino ai bronchioli (Figura 3A), piuttosto che il fissativo liquido dove le spore appaiono leggermente più disperse dall'epitelio bronchiolare (Figura 3B). Attraverso l'analisi spaziale QuPath, misuriamo la distanza delle singole spore dall'epitelio bronchiolare EpCAM+ più vicino per indicare il livello di dispersione delle spore lontano dal bronchiolo e negli spazi alveolari più distali. Mostriamo che l'inflazione liquida disperde le spore più lontano dai bronchioli rispetto all'inflazione fisiologica dell'aria (Figura 4A, B). La perfusione vascolare ad aria preserva il posizionamento naturale di queste spore nei bronchioli distali e previene la dispersione artificiale di queste spore negli spazi alveolari più distali mediante instillazione fissativa intratracheale.

Figura 2: Indicazione del successo della perfusione polmonare. (A) I polmoni perfusi con successo saranno completamente bianchi. (B) I polmoni non completamente perfusi appariranno rosa o screziati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative della distribuzione delle spore nei polmoni perfusi in formalina gonfiati ad aria rispetto ai polmoni gonfiati in formalina. Si è visto che le spore fluorescenti intracellulari (verde) sono distribuite più vicino all'epitelio bronchiolare EpCAM+ (magenta) nei polmoni (A) gonfiati ad aria rispetto ai polmoni (B) gonfiati in formalina. Le immagini sono state ottenute da sezioni con una profondità di 1,2 mm dalla superficie posteriore dei lobi sinistri dei topi in ciascun gruppo di trattamento su un microscopio fluorescente multicanale con ingrandimento 20x e le piastrelle sono state cucite utilizzando un software di microscopia. Barra di scala = 800 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto della distanza delle spore (mm) dall'epitelio bronchiolare tra polmoni gonfiati ad aria e polmoni trattati con spore gonfiate in formalina. I polmoni di 3 topi per gruppo di trattamento sono stati raccolti, elaborati e sottoposti a imaging per 1,5 ore dopo l'inoculazione con 1 x 10⁶ Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Quattro sezioni per topo sono state campionate a 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm e 2,0 mm dalla superficie posteriore del lobo sinistro, colorate e visualizzate su un microscopio fluorescente multicanale. Tutte le spore di ciascun gruppo sono state rilevate e analizzate spazialmente in QuPath per determinare la (A) distanza dall'epitelio bronchiolare colonnare EpCAM+ più vicino e (B) la mediana e gli intervalli di confidenza al 95% sono visualizzati in unità di micrometri. Spore di gonfiaggio atmosferico, n = 11.673. Spore di inflazione liquida, n = 9,837. Il t-test di Mann-Whitney è stato eseguito a causa della mancanza di normalità e p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Abbiamo stabilito una pipeline per l'inalazione delle spore e l'analisi della deposizione spaziale delle spore inalate. Questa pipeline fornisce informazioni preziose per determinare le regioni stromali rilevanti del polmone colpite dall'inalazione di artroconidi Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Abbiamo osservato che le spore di Coccidioides e le particelle inerti di dimensioni simili (dati non mostrati) si accumulano nelle regioni bronchiolari distali e nelle giunzioni bronco-alveolari piuttosto che essere completamente disperse nei lumi delle vie aeree alveolari. Questo modello richiede un livello relativamente basso di attrezzature e competenze tecniche per produrre criosezioni per l'immunofluorescenza (o altre condutture a valle come l'immunoistochimica [IHC]) che mantengono l'integrità fisiologica del contenuto delle vie aeree mantenendo la naturale morfologia polmonare. Senza gonfiaggio dell'aria, il collasso degli alveoli distorce l'architettura naturale del parenchima polmonare che circonda i bronchioli^13,15. La perdita del volume d'aria del polmone durante l'elaborazione istologica è stata indicata come un "problema serio" da una dichiarazione politica di ricerca ufficiale congiunta dell'American Thoracic Society e della European Respiratory Society nella definizione di standard per la valutazione quantitativa della struttura polmonare¹⁶. Inoltre, l'instillazione intratracheale di fissativo può interrompere la natura e la posizione dei componenti molecolari e cellulari delle vie aeree prossimali come mucine, tensioattivi e ciglia delle vie aeree 17,18,19. Il metodo qui descritto preserva sufficientemente sia il volume d'aria del polmone che i componenti molecolari e cellulari lungo le vie aeree che interagiscono con le spore fungine inalate.

La microscopia a immunofluorescenza fornisce un potente strumento per interrogare le dinamiche spaziali dei componenti polmonari ed è ben recensita^20,21. Non ci sono limitazioni ai bersagli che possono essere colorati tramite immunofluorescenza di queste sezioni, tranne per il fatto che gli anticorpi con epitopi sensibili alla fissazione della formalina potrebbero non legare i loro bersagli in modo soddisfacente. Quando si utilizza un nuovo anticorpo, è meglio preparare un controllo a fluorescenza meno uno (FMO) per determinare se l'anticorpo genera un segnale sopra il fondo. Se si utilizza un secondario, utilizzare un gruppo di trattamento senza l'anticorpo primario per controllare il legame fuori bersaglio dell'anticorpo secondario. Gli anticorpi monoclonali coniugati primari sono molto specifici, quindi la colorazione a temperature più elevate (37 °C) per un tempo inferiore (30 minuti) è comune e generalmente si lega specificamente al loro bersaglio. D'altra parte, gli anticorpi policlonali non coniugati sono più sensibili a rilevare gli antigeni ma meno specifici, quindi incubazioni più lunghe (~16 h) a temperature più fredde (4 °C) ottimizzano il rapporto segnale/rumore. Tutti gli anticorpi richiederanno un'ottimizzazione empirica.

Il modello di analisi spaziale utilizzato in questo studio per la localizzazione delle spore misura la distanza delle singole spore dall'epitelio bronchiolare più vicino. Ciò richiede un'appropriata identificazione dell'epitelio bronchiolare utilizzando il suo alto segnale EpCAM e l'aspetto morfologicamente distinto come un epitelio colonnare che riveste strutture tubolari. L'EpCAM può anche essere espressa a livelli più bassi dall'epitelio alveolare, quindi è importante sogliezzare il segnale EpCAM in QuPath per limitare le annotazioni definite alle regioni bronchiolari morfologicamente confermate. Poiché i bronchioli hanno una dimensione anatomica minima, possiamo limitare la definizione QuPath di queste regioni all'area minima di 100 mm², come indicato al punto 11.3. Ciò escluderà dalle annotazioni QuPath le cellule isolate ad alta espressione di EpCAM o gli artefatti in tutti gli spazi alveolari, come le cellule epiteliali alveolari di tipo II. Questi passaggi ci permettono di definire esclusivamente l'epitelio bronchiolare come annotazioni QuPath e determinare la vicinanza delle spore a questo epitelio bronchiolare definito.

Il modello di infezione qui descritto utilizza l'anestesia con isoflurano per indurre una risposta al rantolo orale nei topi per l'aspirazione delle spore fungine. Il metodo a goccia aperta di isoflurano è stato sviluppato come tecnica rapida e a basse risorse per indurre l'anestesia a breve termine nei topi ^9,22,23. Questo metodo richiede un po' di pratica per essere eseguito in modo coerente. Il tempo sotto anestesia deve essere sufficientemente lungo da anestetizzare sufficientemente il topo per aspirare il contenuto faringeo. Se il topo non è sufficientemente anestetizzato, può ingoiare l'inoculo invece di aspirarlo. Il segno di una sufficiente anestesia viene raggiunto quando il topo produce un rantolo orale regolare di vigore crescente ad una velocità di circa 50-60 sussulti/min. La testa del topo supino dovrebbe muoversi in avanti ad ogni rantolo. Un'anestesia insufficiente può essere determinata da una mancanza di rantolo o da qualsiasi movimento dei baffi, della lingua o degli arti. È buona norma premere la lingua con la punta della pipetta durante la somministrazione dell'inoculo per evitare la deglutizione. Il sovradosaggio di isoflurano può provocare la morte del topo e deve essere prevenuto. Una buona regola empirica per evitare che ciò accada è quella di rimuovere il mouse dall'isoflurano dopo lo stesso tempo impiegato dal mouse per perdere il riflesso raddrizzatore. Ad esempio, se il mouse impiega 10 s per perdere il riflesso raddrizzato, rimuovere il mouse dopo altri 10 s. Poiché il gas isoflurano fuoriesce nel corso di più trattamenti con topi, questo lasso di tempo può aumentare. Nelle nostre mani, possiamo trattare 6-8 topi senza aggiungere altro isoflurano.

Esistono alcune limitazioni ai componenti di questo protocollo. La procedura di inoculazione utilizza spore sospese in 25 μL di terreno fluido PBS, che è meno fisiologico di un'inoculazione di spore aerosol. Rimane una questione aperta se l'uso di fluido aspirato alteri la localizzazione di spore/particelle rispetto ad altri metodi di inoculazione, come l'inalazione di spore trasportate dall'aria. Tuttavia, l'inalazione per aerosol richiede un notevole investimento di risorse e presenta altre limitazioni (dimensioni limitate dell'inoculo, esposizione variabile, rischio professionale) che potrebbero non essere ottimali a seconda della natura dello studio e dell'ambiente di laboratorio. Un'altra limitazione di questo protocollo è che durante la criosezione può verificarsi fragilità tissutale, che potrebbe essere dovuta alla presenza di aria in tutto il tessuto o alla ridotta efficacia della fissazione vascolare rispetto alla fissazione intratracheale. Questa fragilità della criosezione può essere superata tagliando sezioni più spesse di 60-100 μm e utilizzando la microscopia confocale per visualizzare piani bidimensionali (2D) all'interno del tessuto.

Crediamo che la semplicità e l'adattabilità di questo metodo consentiranno ad altri gruppi di trovare utilità con i patogeni per via inalatoria scelti e le risposte di interesse dell'ospite.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 ago (305185)	Fisher	305185
1 L  Barattolo con tappo a vite  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Siringhe non sterili sfuse Air-Tite 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (soluzione sterile di xilazina)	Akorn	59399-110-20
Bloccante e diluente senza animali, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Catetere IV schermato alato con catetere BD Vialon Materiale 18 G x 1,88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Arancione CMRA Colorante	Fisher Scientific NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Filtri Corning da 70 micron	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 anticorpo monoclonale	Biolegend	118211
Exel International Aghi HYpodermic 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Siringhe sterili monouso (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucosio Monoidrato	Azer Scientific	ES17530-500G
Grasso per alto vuoto	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Soluzione 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurano USP	Covetrus	29405
Ketamina cloridrato	Dechra	1000001250
KIMWIPES Tergicristalli per attività delicate (4,4'' x 8,4")	VWR	21905-026
Lexer Forbici per bambini	FST	14078-10
Pinze Micro-Adson	FST	11018-12
Formalina tamponata neutra (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask fiaschette per coltura tissutale, T75, tappi filtro	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way stampi per inclusione	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Filo di sutura in seta misura 3/0	FST	18020-30
VetriniMicro vetrini Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.
Vector Laboratories Set di 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover, rettangolari (24 mm x 40 mm #1,5)	VWR	48393-230
Rete metallica in plastica bianca	MAPORCH	789862904922
estratto di lievito	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	microscopio fluorescente multicanale
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	software per microscopia