Articolo metodologico

Modello di abbuffata intermittente nei topi

DOI:

10.3791/67560

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10 gennaio 2025

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1Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In questo articolo

Sommario

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Un modello di abbuffata è stato stabilito nei topi utilizzando l'accesso intermittente a M&M's (un alimento altamente appetibile a base di grassi e zuccheri). I topi con accesso intermittente a questo alimento ad alto contenuto di grassi e zuccheri hanno mostrato comportamenti simili allo stress, un aumento dell'apporto calorico e una preferenza per quel cibo rispetto al cibo standard rispetto ai topi con accesso continuo o nullo al cibo.

Abstract

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L'obesità colpisce un individuo su otto a livello globale. L'eccesso di cibo, in particolare i cibi ipercalorici, gioca un ruolo significativo nell'obesità. Il disturbo da alimentazione incontrollata (BED) è una condizione complessa causata da una combinazione di fattori biologici, psicologici e sociali. Comporta un consumo eccessivo di cibi ipercalorici in un breve periodo ed è spesso legato ad ansia e voglie.

Qui, presentiamo un protocollo che impiega l'accesso continuo e intermittente a un nuovo alimento altamente appetibile (HPF) - M&M's - per sviluppare un modello murino per studiare il disturbo da alimentazione incontrollata (BED). L'HPF, scelto per il suo alto contenuto di grassi e zuccheri, rappresenta un'ottima fonte alimentare da studiare grazie alla sua forte appetibilità, che lo rende particolarmente adatto per esaminare i comportamenti alimentari compulsivi. Utilizzando i mouse C57BL/6, abbiamo fornito un accesso continuo o intermittente agli M&M's, consentendo al contempo l'accesso illimitato al cibo e all'acqua standard. Entro l'ottavogiorno, i topi nel gruppo ad accesso intermittente hanno mostrato comportamenti di abbuffata pronunciati, che sono persistiti fino al 26° giorno. Questi topi hanno anche consumato significativamente più calorie – prevalentemente dal dolciumi – rispetto a quelli dei gruppi ad accesso continuo e di controllo. Il contrasto tra accesso continuo e intermittente sottolinea il ruolo critico dei programmi di alimentazione nel promuovere il consumo eccessivo di alimenti appetibili.

Inoltre, le valutazioni comportamentali hanno rivelato un accesso intermittente ai comportamenti ansiosi indotti dall'HPF, evidenziando l'impatto psicologico dei modelli di accesso sia sul comportamento alimentare che sugli stati emotivi. Incorporando questi due distinti paradigmi di alimentazione, questo studio offre preziose informazioni su come la disponibilità di alimenti altamente appetibili possa esacerbare le tendenze al binge-food. Questo modello fornisce un approccio più realistico allo studio dei comportamenti di abbuffata e delle loro conseguenze metaboliche. Evidenzia l'importanza dei modelli standardizzati nella ricerca biomedica. I nostri risultati offrono approfondimenti sui meccanismi fisiologici e neurali alla base del BED, che potrebbero aprire la strada allo sviluppo di interventi terapeutici efficaci per il BED e l'obesità.

Introduzione

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Secondo i dati dell'Organizzazione Mondiale della Sanità1, una persona su otto in tutto il mondo è obesa. Sebbene mangiare sia una necessità fisiologica, è noto che l'eccesso di cibo senza un bisogno fisiologico è un fattore associato al sovrappeso e all'obesità2. È risaputo che gli esseri umani preferiscono cibi appetibili e ricchi di calorie, come grassi e zuccheri, rispetto a cibi più sani3.

Dal punto di vista della scienza della complessità, i disturbi alimentari, in particolare il disturbo da alimentazione incontrollata (BED), sono fenomeni multiformi che emergono dall'interazione di vari fattori biologici, psicologici e sociali che esibiscono comportamenti emergenti come modelli ciclici di abbuffate, comportamenti compensatori complessi e relazioni interpersonali disfunzionali4. Il BED è caratterizzato dall'assunzione eccessiva di cibi ipercalorici in un breve periodo, circa 2 ore, secondo il Manuale Diagnostico e Statistico dei Disturbi Mentali, 5a ed.5 (DSM-V). Inoltre, il BED è associato a comorbidità comportamentali come ansia e voglie 6,7. La complessità di questi disturbi richiede modelli sperimentali migliori in grado di catturare questa interazione di fattori e fornire una comprensione più completa del comportamento di alimentazione incontrollata e delle sue implicazioni per l'obesità.

I modelli più utilizzati per il comportamento simile alle abbuffate nella ricerca di base sono stati principalmente i ratti. Questi modelli in genere utilizzano un accesso limitato e intermittente a cibi ricchi di grassi o zuccheri per indurre comportamenti simili ad abbuffate 8,9,10. Un approccio alternativo consiste nel fornire cibo appetibile per un breve periodo (2 ore) ogni 8 giorni, noto come modello ciclico, utilizzando una pasta alimentare altamente appetibile (HPF) contenente un mix di grassi e zuccheri11. Un altro metodo presenta l'HPF come cookie in modo imprevedibile12. Nei modelli murini, i comportamenti simili alle abbuffate sono spesso studiati utilizzando lo stesso modello ciclico13. Un altro studio con i topi utilizza l'accesso limitato al saccarosio per indurre comportamenti simili ad abbuffate14.

Nonostante l'ampia ricerca sui comportamenti alimentari simili alle abbuffate nei ratti, i modelli per le abbuffate nei topi rimangono limitati. Questo studio mira a proporre un modello di alimentazione binge-like utilizzando M&M's (di seguito denominato "HPF") come HPF secondo i criteri nutrizionali di HPF proposti da Fazzino e colleghi15. Inoltre, miriamo a valutare le proprietà gratificanti dell'HPF in base al fatto che siano presentate in modo continuo o intermittente. Nella nostra ricerca, abbiamo mirato a osservare somiglianze tra specifici criteri diagnostici del DSM-V per le abbuffate nell'uomo all'interno di un modello murino: consumare cibo entro un breve periodo (2 ore), ingerire una grande quantità di cibo rispetto al solito, mangiare una quantità sostanziale nonostante si sia in uno stato di sazietà e sperimentare episodi di abbuffate almeno due volte a settimana.

L'uso di modelli murini di laboratorio è uno strumento inestimabile nella ricerca biomedica, in particolare per lo studio delle malattie umane, poiché i topi condividono il 99% dei loro geni con gli esseri umani16. L'utilizzo dei topi offre anche vantaggi significativi nella comprensione delle informazioni trascrittomiche e nella modifica dei bersagli terapeutici relativi alle funzioni cellulari e ai circuiti neurali associati a varie malattie17.

Pertanto, questo studio propone un modello di accesso continuo e intermittente agli M&M's (un HPF composto da grassi e zuccheri) per osservare il binge-like eating nei topi C57BL/6 senza privazione standard di cibo o acqua. Questo modello è nuovo e necessario per la ricerca biomedica, in quanto rappresenta un approccio migliore allo studio di questi problemi complessi. La standardizzazione dei modelli animali è essenziale per ottenere risultati riproducibili e comparabili, il che è fondamentale per far progredire la ricerca traslazionale e sviluppare interventi terapeutici efficaci per il BED e l'obesità. L'approccio qui descritto amplierà la portata della ricerca sul comportamento alimentare simile alle abbuffate negli studi futuri, facilitando la sperimentazione di vari farmaci come potenziali bersagli terapeutici per il BED. L'implementazione di modelli più realistici e standardizzati nei topi consentirà una migliore comprensione delle complesse dinamiche coinvolte nei disturbi alimentari e delle loro conseguenze metaboliche, offrendo così nuove alternative per il trattamento e la prevenzione del BED.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo lo Standard Ufficiale Messicano delle Specifiche Tecniche per la Produzione e l'Uso di Animali da Laboratorio (NOM-062-ZOO-1999) e nel pieno rispetto delle linee guida stabilite dal Comitato Interno per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (CICUAL) presso l'Università Nazionale Autonoma del Messico (UNAM).

1. Animali

  1. Per seguire questo protocollo, alloggiare singolarmente 27 topi maschi C57BLC/6, di età compresa tra 1 mese e peso di 16-20 g, in gabbie in condizioni ambientali controllate: un ciclo luce-buio di 12-12 ore (06:00 acceso, 18:00 spento), mantenendo la temperatura a 21 ± 22 °C e i livelli di umidità al 70 ± 10%.
    NOTA: In questo studio, abbiamo utilizzato esclusivamente topi maschi per eliminare gli effetti degli ormoni femminili durante l'assunzione di tipo abbuffato. Tuttavia, in un altro studio18, abbiamo applicato lo stesso modello a topi femmine e non abbiamo osservato differenze nell'assunzione di abbuffate.

2. Assuefazione

  1. Fornire ai topi di 30 giorni l'accesso ad libitum al cibo e all'acqua standard. Posizionarli in gabbie individuali per facilitare la misurazione del consumo di acqua e cibo.
  2. Fornire un ambiente arricchito, compreso un tubo di carta, a tutti i topi e fornire trucioli di legno come lettiera.
  3. Misurare il peso corporeo, il consumo di cibo e acqua ogni 24 ore per 7 giorni.

3. Modello di alimentazione incontrollata

  1. Il giorno 7 del periodo di assuefazione, assegnare in modo casuale i roditori (N= 27) in uno dei tre gruppi seguenti.
  2. Fornire a tutti i soggetti l'accesso all'HPF (contenuto nutrizionale per 100: 480 kcal, 19g di grassi, 70 g di carboidrati, 5,1 g di proteine, 0,13 g di sale) per 2 h (dalle 16:00 alle 18:00) per ridurre al minimo la neofobia verso l'HPF.
  3. Continuare le condizioni di alimentazione specificate per ciascun gruppo in modo coerente per un periodo di 26 giorni.
    1. Chow Group (CG) n = 9: fornisce l'accesso ad libitum al chow e all'acqua standard.
    2. Gruppo continuo (CoG) n = 9; fornire unaccesso diretto al cibo standard, all'HPF e all'acqua.
    3. Gruppo intermittente (IG) n = 9: fornisce l'accesso ad libitum al cibo e all'acqua standard, ma fornisce loro HPF solo in giorni specifici (1, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 24 e 26) per 2 ore (dalle 16:00 alle 18:00).
  4. Dalla prima sessione alla sessione 26, misurare il peso corporeo, l'assunzione standard di cibo, l'assunzione di cibo appetibile e il consumo di acqua per tutti i soggetti alle 16:00 e di nuovo alle 18:00.

4. Istruzioni specifiche

  1. Posizionare il chow standard sulle griglie della gabbia e l'HPF in piccoli contenitori di plastica. In ogni sessione, posiziona casualmente questi contenitori agli angoli delle gabbie (posteriore sinistro, posteriore destro, anteriore destro e anteriore sinistro).
  2. Rabboccare l'acqua (280-300 ml) e il cibo standard (10-15 g) il lunedì, mercoledì e venerdì.
  3. Sostituire l'HPF (4-4,5 g) al giorno con il CoG. Per l'IG, posizionare l'HPF (4-4,5 g) il lunedì, mercoledì e venerdì alle 16:00. Distribuire casualmente l'HPF per colore (marrone, blu, rosso, arancione, verde e giallo), senza alcuna preferenza osservata per alcun colore.
  4. Il 7° giorno di assuefazione, somministrare l'HPF ai topi assegnati al gruppo CoG alle 16:00. Misura tutti gli animali per l'assunzione standard di cibo, il peso corporeo e il consumo di acqua.

5. Analisi dei dati

  1. Per le misurazioni dell'assunzione di 24 ore, registrare i valori alle 16:00 del giorno precedente e alle 16:00 del giorno corrente. Ad esempio, per valutare il consumo del giorno 2, sottrarre i valori del cibo standard, dell'HPF, dell'acqua e del peso corporeo del giorno 1 da quelli del giorno 2 per gli stessi parametri.
  2. Per le misurazioni dell'assunzione di 2 ore, registrare i valori alle 16:00 e alle 18:00 dello stesso giorno. Ad esempio, sottrarre i valori per il cibo standard, l'HPF, l'acqua e il peso corporeo alle 16:00 da quelli alle 18:00 per gli stessi parametri.
  3. Raccogli tutti i dati ogni giorno in due punti temporali (16:00 e 18:00), inseriscili in un foglio di calcolo ed esegui calcoli in kcal.
    1. Per calcolare la kcal, convertire i grammi consumati di cibo standard e HPF in kcal in base al valore energetico di ciascun alimento utilizzando una proporzione (ad esempio, cibo standard: 3,02 kcal/g; HPF: 4,80 kcal/g).
  4. Analizza e traccia i dati utilizzando il software preferito.
    1. Per l'analisi statistica, utilizzare i test U di Kruskal-Wallis e Mann-Whitney.

6. Test in campo aperto

NOTA: Un test in campo aperto di 22 giorni, ore 14:00, è stato condotto secondo il protocollo descritto da Kraeuter e colleghi19. Questo protocollo consiste nel posizionare gli animali al centro di una scatola di fogli acrilici neri. Il pavimento dell'arena era bianco e la griglia era nera. Il comportamento è stato registrato e quantificato con un sistema di tracciamento video. Il sistema registrava la distanza, la velocità e il tempo che gli animali trascorrevano al centro o alla periferia dell'arena.

  1. Allestimento della sala prove e delle apparecchiature in campo aperto
    1. Per l'arena, utilizzare una camera quadrata di 60 cm (lunghezza) x 60 cm (larghezza) x 20 cm (altezza) in plastica nera non porosa.
    2. Pulire il dispositivo prima e tra un utilizzo e l'altro con etanolo al 70% vol/vol per rimuovere i segnali di odore.
    3. Posizionare la telecamera sopra l'apparecchio per un'esplorazione ottimale view.
    4. Per ridurre al minimo lo stress, mantenere la temperatura e l'umidità come le normali condizioni abitative. Se i topi vengono spostati da una stanza di stabulazione all'altra per l'esperimento, acclimatarli nella nuova stanza per almeno 1 ora al giorno prima dell'uso.
  2. Esecuzione della prova in pieno campo
    1. Per rimuovere un singolo topo dalla gabbia, afferra delicatamente la sua coda e posizionalo al centro del labirinto in campo aperto. Attiva il software di tracciamento video utilizzando la funzione di avvio automatico, che rileva l'investigatore e inizia a registrare non appena l'investigatore non è più a fuoco della telecamera.
    2. Lascia che il mouse si muova liberamente lungo il labirinto per 5 minuti. Durante questo periodo, il software di tracciamento registrerà il movimento.
    3. Al termine del periodo di prova, rimuovi l'animale dall'arena e rimettilo nella sua gabbia di casa.
    4. Prima di pulire il labirinto, conta visivamente le feci depositate e registrale per un'analisi successiva.
    5. Rimuovere tutti i pellet fecali e pulire eventuali macchie di urina. Spruzzare il pavimento e le pareti dell'apparecchio con etanolo al 70%, quindi pulire con un tovagliolo di carta pulito. Lasciare asciugare completamente la soluzione di etanolo.
    6. Dopo aver testato tutti gli animali, torna al vivaio, pulisci l'arena e organizza tutti i materiali utilizzati.
  3. Analisi dei dati
    NOTA: Il software di tracciamento video facilita l'estrazione di una serie di dati, come la velocità media degli animali, la distanza percorsa e il tempo trascorso al centro e alla periferia dell'apparato.
    1. Seleziona la distanza percorsa e il tempo trascorso dagli animali al centro e alla periferia dell'apparato.
    2. Esporta i dati dal software di tracciamento in un foglio di calcolo o in un altro formato preferito per ulteriori analisi statistiche.
    3. Analizza i dati con il software che preferisci.

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Risultati

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Utilizzando HPF, abbiamo stabilito con successo un modello di abbuffata nei topi C57BL/6. Entro l'ottavo giorno, il comportamento di abbuffata (consumo eccessivo di cibo per 2 ore) era saldamente stabilito e mantenuto fino al giorno 26 (Figura 1A). Durante le sessioni intermittenti, il gruppo IG ha mostrato un consumo totale di kcal significativamente più elevato (sia dal cibo standard che dall'HPF rispetto ai gruppi CG e CoG) (Figura 1A, ### p < 0,0001, *** ...

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Discussione

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Abbiamo utilizzato il modello di abbuffata proposto da Corwin nel 2006 come base per lo sviluppo di questo protocollo. Tuttavia, il presente studio ha modificato la variabile di fornire cibo appetibile per 2 ore per il CoG8. Invece, abbiamo offerto cibo appetibile ad libitum a CoG, in quanto simula meglio una realtà in cui abbiamo accesso 24 ore su 24 a qualsiasi cibo. Abbiamo anche usato M&M's come HPF perché combinano grassi e zuccheri, a differenza di ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Vogliamo esprimere la nostra gratitudine al Programma di Dottorato in Scienze Biomediche presso l'Università Nazionale Autonoma del Messico e al supporto fornito dal Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT), No. CVU: 11025222. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalla sovvenzione UNAM-DGAPA-PAPIIT IN207423. Ringraziamo Andrea Mondragón García e José Enrique Ramírez Sánchez per il loro supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Software di tracciamento video ANY-mazeStoelting Co.4.73
C270 HD WebcamLogitechC270 HDNon è necessario utilizzare un videoregistratore specifico; qualsiasi webcam o videocamera con una qualità dell'immagine e una risoluzione soddisfacenti saranno sufficienti.
Guanti Ambiderm (nero)Ambiderm7.50222E+12
GraphPad Prism 9GraphPad
Laboratory Dieta per roditori 5001LabDiet1320https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
M& Ms 43.8g (confezione marrone)M& M&acuto; s Contenuto nutrizionale per 100 : 480 kcal, 19 g di grassi, 70 g di carboidrati, 5,1 g di proteine, 0,13 g di saleIngredienti:  zucchero, pasta di cacao, scremato  latte  polvere, burro di cacao,  lattosio, amido,  latte  grasso, grasso di palma, sciroppo di glucosio, grasso di karité, stabilizzante (gomma arabica), destrina, agenti di rivestimento (cera d'api, cera di carnauba), coloranti (E100, carminio, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), concentrato di barbabietola, emulsionanti (soia  lecitina, E445), sale, aromi, olio di palmisti, antiossidante (E306). (Può contenere:  arachidi, nocciole, mandorle). Il cioccolato al latte contiene almeno il 14% di solidi del latte. Il cioccolato al latte contiene grassi vegetali oltre al burro di cacao.
Labirinto in campo aperto 
Polipropilene Gabbia per TopiOrchidea ScientificaSMP 01
Abbeveratoi per RoditoriSunnypetSP-3656
Uline Balanza-220 g x 0,01 gunike.mxH-9884
UniMask4Uniseal
Bottiglie di plasticaunike.mxS-14487
Letto sanitario, Segatura per animaliBIOINVERTNumero10 kg
Versione

Riferimenti

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