Tecniche di coltivazione e elaborazione degli organoidi tridimensionali per la generazione di fibromi miometriali e uterini

Summary

Questo protocollo delinea una tecnica eseguita manualmente per creare idrogel contenenti collagene incorporati con colture organoidi 3D di cellule staminali da tessuto miometriale e fibromato uterino.

Abstract

I fibromi uterini sono i tumori benigni, monoclonali e ginecologici più comuni nell'utero di una donna. Per superare gli ostacoli comuni legati ai metodi utilizzati nello studio di queste patologie, abbiamo puntato a ideare una strategia per generare modelli organoidi tridimensionali di cellule staminali miometriche e fibromi uterini utilizzando idrogel contenenti collagene come impalcature di incorporazione. In particolare, sono stati sfruttati idrogel contenenti collagene in piastre a basso attacco a V a 96 pozzi. Questo metodo permise lo sviluppo di organoidi 3D di due tipi di cellule staminali dal miometrio normale e dal miometrio contenente fibromi uterini, incorporandoli in idrogel contenenti collagene e formando organoidi in un mezzo adatto per la proliferazione delle cellule staminali. Gli organoidi riuscirono a differenziarsi, proliferare e auto-organizzarsi in strutture complesse, sviluppando un sistema sostenibile. L'importanza di questo modello è la comprensione della fisiopatologia ed etiopatogenesi, nonché il test di nuovi farmaci per prevenire o trattare i fibromi uterini.

Introduction

I fibromi uterini, o leiomiomiomi, sono i tumori benigni più comuni^{dell'utero 1}. Influenzano una parte significativa delle donne durante gli anni riproduttivi, con ricerche che suggeriscono che circa il 77% delle donne le sperimenti in qualche momento. Sebbene molte donne presentino fibromi senza sintomi, un consistente 25% presenta sintomi come sanguinamento uterino anomalo, dolore pelvico o^{infertilità 2}. Lo sviluppo e la crescita dei fibromi sono influenzati da una varietà di fattori, tra cui ormoni sessuali, fattori di crescita, cambiamenti genetici e altri meccanismi

Protocol

Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etnico dell'Università di Chicago, con il numero di approvazione IRB#20-1414. Secondo la banca dei tessuti dell'Università di Chicago, è stato ottenuto il consenso informato da tutti i soggetti da cui è stato prelevato il tessuto.

1. 3D Cultura dell'organoide

1. Coltivare e mantenere le cellule miometriali e UF isolate e purificate come descritto in^{precedenza 9}.
2. Ottieni gli SC dall'azoto liquido e lasciali scongelare. Un diagramma di flusso del processo di coltura è mostrato nella Figura 1.
....

Results

Già il primo giorno dopo la semina, gli SC iniziarono ad auto-aggregarsi, formando organoidi, come mostrato. Abbiamo determinato che la densità ottimale di semina era di 10.000 SC, che formavano costantemente organoidi quando coltivati in un sistema di coltura definito. Questo sistema impiegava idrogel contenenti collagene come impalcatura ECM per le cellule staminali incorporate e il Mezzo di proliferazione delle cellule staminali per 7 giorni in una las.......

Discussion

Gli organoidi sono strutture tridimensionali che assomigliano a organi miniaturizzati e sono costituite da cellule auto-organizzate derivate da cellule staminali o campioni di tessuto¹¹. Gli organoidi delle cellule staminali derivati dal tessuto dei pazienti hanno il potenziale di rivoluzionare la ricerca biomedica e le applicazioni cliniche grazie alla loro straordinaria capacità di replicare accuratamente la fisiologia e^{la malattia} 12 del.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-fotoni confocali   Microscopio	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Micropiastre Sferoidi Akura 96	InSphero	CS-09-004-03	Piastre a basso attacco a V
Alexa Fluor 488 anti-topo IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 anti-coniglio per capre IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticorpi anti-muscolo liscio alfa dell'Actina	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 & micro; g/mL
Anticorpi anti-Collagene III	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Anticorpi anti-SOX1	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Fattore di attaccamento	Gibco, USA	S-006-100
Buffer di blocco	Dako	X0909	5%  siero di cavallo + 0,5%  Triton X-100  in 1X  PBS
Criostato	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo)	Thermo Scientific, Germania	62248	1 mg/mL
DNasi I	Termoscientifica, Lituania	EN0521
Dullbecco' s Eagle modificata s medium DMEM e  F12	Gibco, USA	21041-025
Siero bovino fetale	Omega Scientific,   Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (idrogel contenenti collagene)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (mezzo proliferante senza siero con cellule staminali  )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canada	5446
Composto OCT (Composto a temperatura di taglio ottimale)	Sakura, USA	4583
Microscopio Olympus BX41	Olympus America, Center Valley, PA
Soluzione di inibitori della proteasi ovomucoide	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	soluzione di attivazione (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoetanolo, 5,5 mM L-cisteina HCl)
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Gibco, USA	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldeide) 4%	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  QuPath: Software open source per l'analisi delle immagini patologiche digitali.  Rapporti scientifici  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software per l'analisi di bioimaging
Microscopio a tempo di corsa
Fiaschette per coltura tissutale	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsina	Gibco, USA	A12859-01	0,25% di tripsina e 0,1% di EDTA in HBSS senza calcio o magnesio
Mezzo di montaggio antifade VECTASHIELD integrato con DAPI	Vector Laboratories, CA, USA	#  UX-93952-24	1  ng/mL