Tecniche di coltivazione e elaborazione degli organoidi tridimensionali per la generazione di fibromi miometriali e uterini

Sommario

Questo protocollo delinea una tecnica eseguita manualmente per creare idrogel contenenti collagene incorporati con colture organoidi 3D di cellule staminali da tessuto miometriale e fibromato uterino.

Abstract

I fibromi uterini sono i tumori benigni, monoclonali e ginecologici più comuni nell'utero di una donna. Per superare gli ostacoli comuni legati ai metodi utilizzati nello studio di queste patologie, abbiamo puntato a ideare una strategia per generare modelli organoidi tridimensionali di cellule staminali miometriche e fibromi uterini utilizzando idrogel contenenti collagene come impalcature di incorporazione. In particolare, sono stati sfruttati idrogel contenenti collagene in piastre a basso attacco a V a 96 pozzi. Questo metodo permise lo sviluppo di organoidi 3D di due tipi di cellule staminali dal miometrio normale e dal miometrio contenente fibromi uterini, incorporandoli in idrogel contenenti collagene e formando organoidi in un mezzo adatto per la proliferazione delle cellule staminali. Gli organoidi riuscirono a differenziarsi, proliferare e auto-organizzarsi in strutture complesse, sviluppando un sistema sostenibile. L'importanza di questo modello è la comprensione della fisiopatologia ed etiopatogenesi, nonché il test di nuovi farmaci per prevenire o trattare i fibromi uterini.

Introduzione

I fibromi uterini, o leiomiomiomi, sono i tumori benigni più comuni^{dell'utero 1}. Influenzano una parte significativa delle donne durante gli anni riproduttivi, con ricerche che suggeriscono che circa il 77% delle donne le sperimenti in qualche momento. Sebbene molte donne presentino fibromi senza sintomi, un consistente 25% presenta sintomi come sanguinamento uterino anomalo, dolore pelvico o^{infertilità 2}. Lo sviluppo e la crescita dei fibromi sono influenzati da una varietà di fattori, tra cui ormoni sessuali, fattori di crescita, cambiamenti genetici e altri meccanismi^{biologici 3}.

Per studiare la patogenesi e sperimentare l'efficacia dei farmaci, sono stati sviluppati modelli in vitro e animali. Le cellule nelle colture 2D sono costrette a crescere su una superficie piana, distorcendo la loro forma e modificando il loro comportamento rispetto a come si comporterebbero in un ambiente tissutale 3D. Il principale svantaggio della coltivazione 2D rispetto a quella 3D è che rappresenta scarsamente l'ambiente cellulare naturale all'interno di un tessuto, non riuscendo a imitare accuratamente le complesse interazioni cellula-cellula e matrice cellulare che avvengono in un organismo vivente, portando a risultati potenzialmente imprecisi nello studio del comportamento cellulare e della risposta agli^{stimoli 4}. Inoltre, l'UF e le cellule miometriali perdono rapidamente la risposta ormonale nella coltura^{2D 5}. Nel complesso, i diversi modelli animali hanno fornito informazioni rilevanti riguardo alla fisiopatologia^{UF 6}. Rispetto ai modelli animali, gli organoidi 3D offrono diversi vantaggi: semplificano gli esperimenti, sono compatibili con l'imaging in tempo reale e permettono lo studio di aspetti specifici dello sviluppo e delle malattie umane che non sono ben rappresentati nei modelli^{animali 7}. D'altra parte, gli esperimenti con animali più sofisticati, come i primati, sono molto difficili da giustificare eticamente, oltre a costi^{elevati 8}. Il modello organoide 3D è generalmente superiore alle colture cellulari 2D perché imita più da vicino l'architettura tissutale in vivo , pur essendo più controllato, efficiente ed economico rispetto ai modelli animali. Pertanto, è essenziale sviluppare modelli alternativi più efficaci che replichino con precisione la crescita cellulare naturale e le complessità dei tessuti malati.

Abbiamo puntato a impostare la procedura per eseguire la coltura 3D di organoidi di cellule staminali miometriali e fibromi uterini utilizzando idrogel contenenti collagene, con una procedura manuale, evidenziando i principali vantaggi e limitazioni.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etnico dell'Università di Chicago, con il numero di approvazione IRB#20-1414. Secondo la banca dei tessuti dell'Università di Chicago, è stato ottenuto il consenso informato da tutti i soggetti da cui è stato prelevato il tessuto.

1. 3D Cultura dell'organoide

1. Coltivare e mantenere le cellule miometriali e UF isolate e purificate come descritto in^{precedenza 9}.
2. Ottieni gli SC dall'azoto liquido e lasciali scongelare. Un diagramma di flusso del processo di coltura è mostrato nella Figura 1.
3. Aggiungi 5 mL della proteina del fattore di attaccamento per preparare le fiaschette pre-rivestite. Incubare per almeno 4 ore a 37 °C. Poi scarta la proteina del fattore di attaccamento in eccesso.
4. Coltivare le SC nelle² fiaschette pre-rivestite da 75 cm utilizzando 10 mL del mezzo che comprende sia il medium d'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) sia F12 integrato con siero bovino fetale al 12% (FBS). Incubare la fiaschetta in un incubatore per ipossia a 37 °C con una concentrazione di ossigeno del 2% fino a raggiungere il 90% di confluenza, come mostrato nella Figura 2A.
   NOTA: L'ipossia può svolgere un ruolo significativo nella crescita delle cellule staminali, poiché può favorire la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule staminali.
5. Al raggiungimento della confluenza, si staccano le cellule utilizzando una soluzione 25% di tripsina-0,1% EDTA in HBSS senza calcio né magnesio.
   1. Per farlo, rimuovi il mezzo di coltura cellulare. Lava le cellule con 1x PBS. Aggiungi 1 mL di tripsina a una cellula da 25 cm² e incuba per 2-3 minuti.
   2. Quando le cellule iniziano a staccarsi, aggiungi un substrato con il siero per fermare la reazione alla tripsina. Aspira la soluzione della cella in un tubo da 15 mL e centrifuga per 5 minuti a 500 x g a temperatura ambiente.
   3. Con attenzione, scartate il surnadante, lasciando intatto il pellet.
6. Successivamente risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo staminale proliferante privo di siero. Interrompi eventuali grumi con un pipetto delicato.
7. Esegui la quantificazione cellulare utilizzando un emocitometro.
   1. Mescola 100 μL di sospensione cellulare con 10 μL di soluzione di Trypan Blue allo 0,4%.
   2. Vortice brevemente la miscela e pipetta 10 μL di sospensione a cellule blu di Tripan nella camera dell'emocitometro tra la tacca della camera e il vetrato di vetro ( Figura 2B).
   3. Contando le celle nelle caselle 1-4, usate le seguenti equazioni per calcolare il conteggio delle celle:
      Celle/mL = (totale delle celle contate/numero totale di scatole contate) x fattore di diluizione x 10.000
      Cellule totali nel campione = cellule/mL x volume totale del campione
8. Mescolare circa 10.000 cellule con 2 μL di idrogel contenenti collagene e 98 μL di mezzo proliferante senza siero, ottenendo un volume finale di 100 μL per ogni^{pozzo 5}per una piastra a fondo a V a 96 pozzi.
9. Pipetta 100 μL della miscela della cella in ciascun pozzetto di una piastra a basso attacco a V a 96 pozzi. Centrifuga a temperatura ambiente per 5 minuti a 100 x g.
10. Metti il piatto in un incubatore a 37 °C con il 5% di_CO2 per 30 minuti.
11. Aggiungere un volume aggiuntivo di 100 μL di mezzo proliferante senza siero senza idrogel contenenti collagene in ciascun pozzo per fornire il nutrimento necessario alla crescita degli organi.
12. Compensare l'evaporazione del mezzo aggiungendo 10-20 μL di cellule staminali senza siero in ogni pozzo in caso di evaporazione eccessiva, cosa che si verifica raramente.
13. Coltivare le cellule per 7 giorni per la crescita completa degli organoidi Figura 2C-H. Cambiare il mezzo proliferante delle cellule staminali senza siero due volte a settimana (aspirando delicatamente il substrato vecchio e poi aggiungendo nuovo substrato) per permettere di prolungare la coltivazione degli organoidi derivati dalla SC fino a 21 giorni.

2. Sezionamento congelato

1. Raccogliere le celle dalla piastra a 96 pozzi in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
2. Per la criosezionazione, lavare gli organoidi 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 1x). Aggiungere 500 μL di PBS agli organoidi, poi centrifugare e scartare il soprantantante.
3. Fissare gli organoidi con 500 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 60 minuti a 4 °C e lavare di nuovo con 1x PBS.
4. Risospendere gli organoidi in 100 μL di blu di metilene al 2% per colorare per 20 minuti. Lavare con 1x PBS e crioprotect durante la notte per sospensione in 500 μL di saccarosio al 30%.
5. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di saccarosio tramite centrifugazione. Inserire gli organoidi in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelare rapidamente a −80 °C.
6. Sezione gli organoidi incorporati in OCT tramite un criostato, la profondità ottimale di sezione è di 10 μm, e posiziona immediatamente le sezioni sui vetri, una sezione per vetrina.
7. Conservare i vetrini a 4 °C fino a quando la colorazione da immunofluorescenza non viene eseguita secondo il seguente metodo.
8. Lava il vetrino 3 volte con 100 μL di 1x PBS. Poi, aggiungi 100 μL di Tritone allo 0,1% in PBS (1x) per 15 minuti a temperatura ambiente.
9. Bloccare gli organoidi con il 5% di BSA in 1x PBS per 60 minuti e incubare durante la notte con anticorpi primari per Sox-2 con diluizione (1:500) e α-muscolo liscio actina (α-SMA) con concentrazione finale di 1 μg/mL.
10. Lavare gli organoidi con 100 μL di 1x PBS 3x e poi incubare per 1 ora al buio con anticorpi secondari fluorescenti marcati con Alexa Fluor (1:1000).
11. Lavare con 100 μL di 1x PBS 2x, poi montare in Antifade Mounting Medium integrato con DAPI (1 ng/mL).
12. Acquisire immagini utilizzando un microscopio fluorescente con ingrandimento 20x. Vedi la Figura 3A e analizza le immagini con un software per l'analisi di bioimaging.

3. Colorazione immunofluorescenza degli organoidi a montaggio intero

1. Rimuovi gli organoidi dal mezzo (passo 1.11) in un tubo microcentrifuga e lava 2 volte con 500 μL di 1x PBS.
2. Fissare gli organoidi con 500 μL di PFA al 4% per 60 minuti a temperatura ambiente. Poi scarta il PFA e lava con 500 μL di PBS 3 volte.
3. Permeabilizza gli organoidi fissi con 0,5 mL di buffer bloccante durante la notte a 4 °C.
4. Il giorno successivo, rimuovere il tampone bloccante, aggiungere anticorpi primari (300-500 μL) di Collagene III (COL3A1) con diluizione (1:500) e AHR con diluizione (1:1000), e incubare i campioni a 4 °C durante la notte.
5. Lavare gli organoidi 3 volte con 500 μL di 1x PBS e poi incubare con anticorpi secondari (594 IgG anti-coniglio di capra e 488 IgG anti-topo di capra) durante la notte a 4 °C al buio.
6. Lavare gli organoidi 3 volte con 500 μL di 1x PBS, poi incubare con 5 μg/mL di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in 1x PBS (300-500 μL per campione) a temperatura ambiente per 20 minuti.
7. Lavare gli organoidi tre volte con 500 μL di PBS 1x e immaginere con un microscopio confocale (Figura 3B).

4. Dissociazione organoide

1. Ricostituire 100 mg di papaina in una soluzione di attivazione sterilizzata con filtro a una concentrazione di 250 U/mL, incubare la soluzione a 37 °C per 30 minuti per attivare l'enzima
   NOTA: Può essere conservato a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Prepara una soluzione di dissociazione (immediatamente prima dell'uso) con 30 U/mL di papaina e 125 U/mL di DNasi I nella Soluzione Salina Bilanciata di Hanks (HBSS).
3. Trasferire gli organoidi (passo 1.11) su piastre a 24 pozzi e aggiungere 500 μL di soluzione dissociativa.
4. Incubare i campioni a 37 °C per 30-60 minuti su uno shaker orbitale impostato a 90 giri/min.
5. Triturare intermittentemente 5x-6x usando un pipetttore da 1 mL a temperatura ambiente per ottenere una sospensione composta principalmente da singole cellule.
6. Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo centrifugo da 15 mL contenente una soluzione inibitrice della proteasi (1 mL da 10 mg/mL) e centrifugare a 300 x g per 5 minuti per bloccare le cellule a pellet e scartare il soprannatante.
7. Risospendendo le celle nel buffer appropriato, la sospensione a singola cella risultante è mostrata nella Figura 2I.

Risultati

Già il primo giorno dopo la semina, gli SC iniziarono ad auto-aggregarsi, formando organoidi, come mostrato. Abbiamo determinato che la densità ottimale di semina era di 10.000 SC, che formavano costantemente organoidi quando coltivati in un sistema di coltura definito. Questo sistema impiegava idrogel contenenti collagene come impalcatura ECM per le cellule staminali incorporate e il Mezzo di proliferazione delle cellule staminali per 7 giorni in una las...

Discussione

Gli organoidi sono strutture tridimensionali che assomigliano a organi miniaturizzati e sono costituite da cellule auto-organizzate derivate da cellule staminali o campioni di tessuto¹¹. Gli organoidi delle cellule staminali derivati dal tessuto dei pazienti hanno il potenziale di rivoluzionare la ricerca biomedica e le applicazioni cliniche grazie alla loro straordinaria capacità di replicare accuratamente la fisiologia e^{la malattia} 12 del...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-fotoni confocali   Microscopio	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Micropiastre Sferoidi Akura 96	InSphero	CS-09-004-03	Piastre a basso attacco a V
Alexa Fluor 488 anti-topo IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 anti-coniglio per capre IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticorpi anti-muscolo liscio alfa dell'Actina	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 & micro; g/mL
Anticorpi anti-Collagene III	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Anticorpi anti-SOX1	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Fattore di attaccamento	Gibco, USA	S-006-100
Buffer di blocco	Dako	X0909	5%  siero di cavallo + 0,5%  Triton X-100  in 1X  PBS
Criostato	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo)	Thermo Scientific, Germania	62248	1 mg/mL
DNasi I	Termoscientifica, Lituania	EN0521
Dullbecco' s Eagle modificata s medium DMEM e  F12	Gibco, USA	21041-025
Siero bovino fetale	Omega Scientific,   Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (idrogel contenenti collagene)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (mezzo proliferante senza siero con cellule staminali  )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canada	5446
Composto OCT (Composto a temperatura di taglio ottimale)	Sakura, USA	4583
Microscopio Olympus BX41	Olympus America, Center Valley, PA
Soluzione di inibitori della proteasi ovomucoide	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	soluzione di attivazione (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoetanolo, 5,5 mM L-cisteina HCl)
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Gibco, USA	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldeide) 4%	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  QuPath: Software open source per l'analisi delle immagini patologiche digitali.  Rapporti scientifici  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software per l'analisi di bioimaging
Microscopio a tempo di corsa
Fiaschette per coltura tissutale	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsina	Gibco, USA	A12859-01	0,25% di tripsina e 0,1% di EDTA in HBSS senza calcio o magnesio
Mezzo di montaggio antifade VECTASHIELD integrato con DAPI	Vector Laboratories, CA, USA	#  UX-93952-24	1  ng/mL