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Articolo metodologico

Modello murino di immunomodulazione indotta per via epicutanea

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DOI:

10.3791/67578

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24 giugno 2025

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1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Lo studio dimostra il ruolo della pelle nella modulazione delle risposte immunitarie nei topi attraverso l'immunizzazione epicutanea (EC). L'immunizzazione EC con un antigene proteico può sopprimere le risposte immunitarie nell'ipersensibilità da contatto o invertire la soppressione indotta dalla pelle se combinata con modelli molecolari associati a patogeni. L'immunizzazione EC si dimostra promettente come approccio efficace e senza ago all'immunoterapia.

Abstract

La pelle, in quanto organo più grande del corpo umano che si interfaccia con l'ambiente esterno, svolge ruoli fisiologici cruciali, tra cui (1) proteggere l'organismo da xenobiotici e microrganismi, (2) facilitare la termoregolazione, (3) mantenere l'equilibrio idrico ed elettrolitico, (4) sintetizzare la vitamina D e (5) partecipare all'immunità. Questo articolo evidenzia il coinvolgimento fondamentale della pelle nei meccanismi immunologici, mostrando la sua capacità di immunomodulare sopprimendo o potenziando la risposta immunitaria. Risultati precedenti rivelano che, nei topi, l'immunizzazione epicutanea (EC) con un antigene, da sola o in combinazione con pattern molecolari associati a patogeni (PAMP), può sopprimere o potenziare le risposte immunitarie, rispettivamente. In particolare, è stato osservato che l'immunizzazione EC con un antigene può sopprimere le risposte immunitarie in vari modelli murini di malattie autoimmuni o dermatite allergica da contatto. I risultati indicano che l'immunizzazione EC con un antigene combinato con PAMP potrebbe servire come strategia efficace per aumentare l'immunità contro gli agenti patogeni o alleviare le allergie dipendenti dai linfociti T helper di tipo 2 (Th2). Questo protocollo delinea un metodo per indurre la soppressione cutanea attraverso l'applicazione epicutanea di un antigene in un modello murino di dermatite allergica da contatto umana (ACD)-ipersensibilità da contatto (CHS) mediata da cellule Th1. Tuttavia, può essere applicato anche a vari modelli di disturbo murino. L'articolo presenta l'immunomodulazione indotta da EC come un attraente modello murino per l'immunoterapia senza ago in vari disturbi.

Introduzione

Questo articolo presenta un metodo per indurre la tolleranza (indicata come "soppressione" in tutto questo testo) in un modello murino di ipersensibilità da contatto (CHS) e per invertire questa tolleranza (indicata come "controsoppressione" in questo testo) attraverso l'applicazione epicutanea (EC) di un antigene da solo o in combinazione con ligandi per i recettori di riconoscimento dei patogeni (PRR), rispettivamente1. Nel protocollo descritto (a) le immunoglobuline di topo aptenizzate (TNP-Ig) sono utilizzate come antigene per sopprimere l'ipersensibilità da contatto o (b) antigene con pattern molecolari associati a patogeni (PAMP), ligandi per i recettori Toll-like (TLR) e recettori NOD-like (NLR) del dominio di oligomerizzazione legante i nucleotidi, per invertire la soppressione cutanea 2,3,4. I risultati indicano che l'immunomodulazione indotta dalla EC è mediata dalle cellule T soppressori (Ts) antigene-non specifiche e dalle cellule contrasoppressori T antigene-specifiche (Tcs). Queste cellule possono essere esaminate in un modello murino di trasferimento cellulare adottivo per determinare il meccanismo delle reazioni testate. L'attuale protocollo descrive due modelli di trasferimento cellulare, "trasferimento adottivo IN" e "trasferimento adottivo OUT". Il trasferimento adottivo IN è utile per testare l'immunomodulazione nelle fasi afferente ed efferente della SIC. D'altra parte, il "trasferimento adottivo OUT" riflette l'effetto dell'immunomodulazione solo nella fase efferente della SIC.

L'articolo descrive un metodo di soppressione indotta dalla pelle attraverso l'applicazione epicutanea di un antigene in un modello murino di dermatite allergica da contatto umana (ACD) - ipersensibilità da contatto (CHS) mediata da linfociti T helper di tipo 1 (Th1)5. Tuttavia, questo approccio è stato anche testato per la sua efficacia nella regolazione (soppressione, tolleranza) di modelli sperimentali di CHS 6,7 mediata da linfociti citotossici T di tipo 1 (Tc1), malattie autoimmuni come l'artrite indotta da collagene (CIA)8,9, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)10,11 e la colite ulcerosa12. Inoltre, il protocollo descrive il metodo di contrasoppressione indotta dalla pelle (soppressione inversa) tramite l'applicazione EC di un antigene insieme a ligandi PRR in un modello murino di CHS 13,14,15,16. I risultati presentati indicano che la soppressione antigene-aspecifica indotta da EC può essere invertita purificando i ligandi TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 e NOD2. Il metodo della contrasoppressione cutanea è stato impiegato anche in un modello animale di dermatite atopica (AD), dimostrando che il trattamento EC con un antigene in presenza di molecole sintetiche di DNA a singolo filamento contenenti oligodeossinucleotidi non metilati (CpG) - ligando per TLR9 può sopprimere le risposte mediate da Th2 in modo antigene-specifico (sposta la risposta immunitaria verso un fenotipo Th1/Th17)17. Il metodo descritto è stato testato anche nella polmonite pneumococcica, dimostrando che l'immunizzazione EC con polisaccaride pneumococcico coniugato all'albumina sierica bovina (PC-BSA), insieme a CpG, potrebbe potenzialmente migliorare l'immunità allo Streptococcus pneumoniae18.

Un aspetto fondamentale dell'immunomodulazione indotta da EC è la selezione del modello e la natura dell'antigene. L'articolo include una tabella che descrive in dettaglio gli antigeni utilizzati, la durata dell'esposizione all'antigene e la specificità delle cellule T dei modelli testati (vedi Tabella 1). Il metodo descritto per l'immunomodulazione è mirato alle malattie che coinvolgono i linfociti T antigene-specifici. L'efficacia di questo metodo è stata valutata utilizzando un antigene compatibile applicato all'EC. La compatibilità dell'antigene è fondamentale per garantire che interagisca efficacemente con i linfociti T coinvolti nel processo patologico. L'applicazione di un cerotto proteico o peptidico sulla pelle intatta facilita la penetrazione dell'antigene attraverso l'epidermide19,20. Questa maggiore penetrazione dell'antigene è attribuita a una maggiore sudorazione sotto la medicazione. Le alterazioni della permeabilità epidermica si verificano entro 4-10 ore dall'applicazione del cerotto, mentre l'immunomodulazione indotta da EC può rimanere efficace fino a due settimane 5,14.

Sebbene il trattamento EC sia ampiamente utilizzato, l'esistenza di molte varianti di questo metodo potrebbe sollevare interrogativi. Le conoscenze attuali suggeriscono che l'entità del danno epidermico prima della somministrazione dell'antigene può influenzare la natura della risposta immunitaria risultante21. Il danno epidermico superficiale innesca il rilascio di citochine antinfiammatorie da parte delle cellule di Langerhans, favorendo l'inizio della risposta Th222. Al contrario, un danno epidermico più esteso promuove il rilascio di citochine pro-infiammatorie e facilita la consegna dell'antigene alle cellule dendritiche dermiche23. Il protocollo presentato evidenzia (a) il riconoscimento delle sfide nell'applicazione di questo metodo in animali piccoli e attivi, in particolare nei topi; b) considerare fattori quali le condizioni della pelle dopo la rasatura con rasoio, il corretto contatto delle sostanze con la pelle, il tempo di esposizione e le condizioni igieniche della pelle durante il trattamento EC che possono determinare l'efficacia del trattamento. È fondamentale considerare il metodo di depilazione cutanea, sia fisico che chimico, prima dell'applicazione dell'antigene, poiché diversi preparati cutanei possono influenzare le condizioni della pelle in vari modi. È noto che tutte queste procedure possono attivare le cellule immunitarie della pelle, portando potenzialmente a infezioni della pelle o influenzando la progressione della malattia. I potenziali effetti collaterali sulle condizioni della pelle dopo la depilazione dovrebbero essere una considerazione primaria nella scelta del metodo di depilazione. I ricercatori hanno descritto un metodo di soppressione immunitaria mediata dalle cellule T indotta tramite l'applicazione EC di un antigene sulla pelle dorsale rasata con un rasoio, dimostrando il suo effetto su vari modelli murini di risposte immunitarie. L'applicazione dell'antigene EC, insieme ai PAMP, induce cellule contrasoppressori T antigene-specifiche. Inoltre, il metodo presentato per l'applicazione della CE, in particolare con l'esposizione ripetuta ad antigeni o PAMP, non provoca effetti collaterali preoccupanti.

Il protocollo descritto sottolinea l'importanza di vari fattori per ottenere risultati affidabili e ripetibili con questo metodo, soprattutto in piccoli animali come i topi. La natura non invasiva di questo approccio si traduce in genere in un minor rischio di reazioni avverse (come dolore, infezione o cicatrici) rispetto alle tecniche di immunizzazione intradermica o iniettabile. L'immunizzazione epicutanea è facile da usare e facilmente somministrabile in contesti non clinici, migliorando l'accessibilità e la compliance rispetto ai metodi più invasivi.

Tabella 1: Modulazione della risposta immunitaria indotta dalla EC in diversi modelli murini di malattia. Abbreviazioni: ACD = dermatite allergica da contatto; AD = dermatite atopica; Ag = antigene; CIA = artrite indotta da collagene; CHS = ipersensibilità da contatto; CFA = adiuvante di Freund completo; COLL II = collagene di tipo II; DNFB = 2,4-dinitrofluorobenzene; DNP-BSA = dinitrofenile coniugato all'albumina sierica bovina; EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; EC = epicutaneo; LPS = lipopolisaccaride; OVA = ovoalbumina; PAMP = pattern molecolare associato a patogeni; PC-BSA = polisaccaride pneumococcico coniugato all'albumina sierica bovina; Th1 = linfocita T helper di tipo 1; Tc1 = T linfocita citotossico di tipo 1; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenzene; TNP-Ig = immunoglobuline di topo coniugate con 2,4,6-trinitrofenile; Ts = cellule T soppressori; Tcs = Cellule T contrsoppressori. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti presentati in questo articolo sono stati approvati e condotti in conformità con le linee guida del 1° e 2° Comitato Etico Locale sulla Sperimentazione Animale di Cracovia, Polonia. Le procedure sono state conformi alle raccomandazioni locali, in particolare per quanto riguarda la somministrazione di ketamina/xilazina o isoflurano come anestetici, la rasatura della pelle del topo con lame di rasoio, l'applicazione di sostanze/apteni sulla pelle rasata e su entrambi i lati delle orecchie e la raccolta di organi immunitari periferici. Lo studio ha utilizzato topi maschi e femmine CBA/J (H-2k), di età compresa tra 6 e 12 settimane, con pesi corporei compresi tra 20 e 25 g. I dettagli sui reagenti e sulle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. I topi domestici insieme; È importante prevenire gli effetti negativi dell'isolamento sul loro umore. Per la significatività statistica, utilizzare 10-12 animali per gruppo.

2. Preparazione dell'area operativa

  1. Pulire il tavolo operatorio con una soluzione di etanolo al 70% prima e dopo tutte le procedure. Se l'uso di topi richiede condizioni sterili, condurre tutte le operazioni all'interno di una cabina di biosicurezza.

3. Induzione di cellule soppressori (Ts) per la reazione CHS mediata da Th1

NOTA: Questa procedura è illustrata nella Figura 1A.

  1. Il giorno "0" anestetizzare i topi con isoflurano al 30% in glicole propilenico. Tieni il mouse con la mano sinistra, esponendo il lato dorsale del suo corpo. Con la mano destra, insaponare il sapone grigio con abbondante acqua e applicarlo sulla pelle.
    1. Utilizzando una lama di rasoio sterile, radere delicatamente un'area cutanea di 2 cm². Evitare di ferire la pelle. Eventuali lesioni cutanee squalificheranno i topi da ulteriori procedure.
      NOTA: Il sapone grigio è un prodotto naturale e ipoallergenico a base di una delicata base vegetale. Rigenera e idrata efficacemente la pelle secca e sensibile. Questo sapone non contiene coloranti artificiali, fragranze sintetiche o ingredienti di origine animale. Gli ingredienti includono palmato di sodio, kernelato di palma di sodio, acqua (acqua), glicerina, estratto di fiori/foglie/steli di tarassaco officinale (tarassaco), acido di palma, acido di palmisti, cloruro di sodio, glicole propilenico, EDTA tetrasodico, acido etidronico. Il sapone grigio è progettato per pelli sensibili e delicate, soggette a irritazioni e psoriasi. Deterge efficacemente la pelle problematica prevenendo l'eccessiva secchezza e la sensazione di tensione. Questo sapone lenisce anche le irritazioni, idrata e favorisce una rigenerazione più rapida della pelle. È importante sottolineare che non compromette la barriera protettiva della pelle.
  2. Metti i topi nella gabbia. Dopo la rasatura, attendere almeno sei ore prima di applicare l'antigene per consentire alla pelle di asciugarsi ed essere pulita dall'animale.
  3. Il giorno "+1", preparare una soluzione da 1 mg/mL di immunoglobulina di topo coniugata con antigene 2,4,6-trinitrofenile (TNP-Ig), in soluzione salina tamponata con fosfato sterile di Dulbecco (DPBS). Preparare il volume di un antigene 1200 μL per dieci topi. Miscelare le soluzioni appena prima dell'uso in un flaconcino da 2 mL. Proteggere il TNP-Ig dalla luce coprendo la fiala con un foglio di alluminio.
    NOTA: Includere un gruppo di controllo CHS di topi trattati solo con il veicolo (DPBS) per valutare le reazioni infiammatorie non specifiche causate dalla rasatura e dall'applicazione del solvente sul punto rasato. Un diverso tipo di antigene deve essere utilizzato per l'induzione delle Ts per testare la loro specificità antigenica. Le immunoglobuline di topo (Ig) sono state preparate da sieri di topo e coniugate con TNP aptene (File supplementare 1). Una singola preparazione con il livello di sostituzione di 40 TNP per molecola di Ig (TNP40-Ig) è stata utilizzata per tutto il 24,25.
  4. Lo stesso giorno, anestetizzare i topi con isoflurano al 30% in glicole propilenico. Applicare l'antigene sul punto precedentemente rasato posizionando un cerotto di garza da 1 cm2 imbevuto di 100 μL di antigene (preparato al punto 3.3). Coprilo con un sottile cerotto di plastica (2 cm²) e fissalo con del nastro adesivo in tessuto. Nel gruppo di controllo CHS, applicare solo DPBS.
    NOTA: Per il cerotto in plastica è possibile utilizzare custodie portadocumenti trasparenti da 30 μm. Il nastro adesivo in tessuto deve essere facilmente rimovibile, flessibile, adattarsi alle forme del corpo e consentire la permeabilità all'aria e al vapore acqueo.
  5. Il giorno "+5", anestetizzare i topi con isoflurano al 30% in glicole propilenico. Tagliare con cura la toppa con le forbici di sicurezza con angoli arrotondati, quindi rimuovere delicatamente il nastro adesivo. Lascia che i topi si muovano liberamente e pulisci naturalmente la pelle per almeno 4 ore. Se necessario, radere i peli ricresciuti nel sito di applicazione dell'antigene, anche se di solito non è necessario.
    NOTA: Tagliare il nastro adesivo solo nell'area di somministrazione dell'antigene (garza e area di plastica), dove aderisce saldamente solo ai bordi della benda. Attendere almeno 4 ore prima di applicare l'antigene per consentire alla pelle di asciugarsi e di essere pulita dall'animale.
  6. Il giorno "+5", ripetere il passaggio 3.3 e il passaggio 3.4.
  7. Il giorno "+8", ripetere il passaggio 3.5. Questo segna il completamento di una settimana di esposizione cutanea all'antigene. Dopo questo periodo, utilizzare i topi per testare la soppressione della reazione CHS - modelli attivi in vivo (fase 6) o sopprimerli per fungere da donatori di cellule Ts in "trasferimento adottivo IN" (fase 8) o in "trasferimento adottivo OUT" (fase 9).

4. Induzione di cellule T contrsoppressori (Tcs) per la reazione CHS mediata da Th1

NOTA: Questa procedura è illustrata nella Figura 1B.

  1. Il giorno "0" eseguire i passaggi 3.1-3.2.
  2. Il giorno "+1", preparare una miscela di 100 μg di antigene TNP-Ig e 100 μg di LPS (esempio di PAMP) in 100 μL di DPBS. Preparare la soluzione immediatamente prima dell'uso in un flaconcino da 2 ml e proteggerla dalla luce avvolgendo il flaconcino in un foglio di alluminio se l'antigene è fotosensibile.
    NOTA: Per valutare la controsoppressione (inversione della soppressione indotta dalla pelle), deve essere incluso un controllo per la soppressione (gruppo di controllo Ts), in cui i topi sono trattati solo con l'antigene TNP-Ig. Inoltre, i topi trattati esclusivamente con DPBS (controllo CHS) e LPS da solo (controllo PAMP) dovrebbero essere inclusi per determinare l'entità della modulazione non specifica delle risposte immunitarie. LPS è un esempio di particella immunostimolante26. Le caratteristiche specifiche di qualsiasi stimolatore immunitario dipendono dal modello murino utilizzato, dai tipi di cellule immunitarie coinvolte nella risposta immunitaria oggetto di studio e dalla farmacocinetica delle sostanze in esame.
  3. Lo stesso giorno, anestetizzare i topi con isoflurano al 30% in glicole propilenico. Applicare un cerotto di garza da 1 cm2 sulla pelle precedentemente rasata, imbevuta di una soluzione contenente 100 μL della miscela (preparata al punto 4.2). Fissare la garza con un cerotto di plastica sottile (2 cm²) e fissarla in posizione utilizzando un cerotto adesivo per tessuti. Nei gruppi di controllo, applicare DPBS (controllo CHS) o LPS (controllo PAMP) o TNP-Ig da solo (gruppo di controllo Ts).
    NOTA: Per il cerotto in plastica è possibile utilizzare custodie portadocumenti trasparenti da 30 μm. Il nastro adesivo in tessuto deve essere facilmente rimovibile, flessibile, adattarsi alle forme del corpo e consentire la permeabilità all'aria e al vapore acqueo.
  4. Il giorno "+5", esegui il passaggio 3.5.
  5. Il giorno "+5", ripetere i passaggi 4.2-4.3.
  6. Il giorno "+8", ripetere il passaggio 3.5. Una settimana di esposizione cutanea all'antigene miscelato con LPS è terminata. Dopo questo periodo, testare i topi in modelli attivi di reazione CHS - in vivo (fase 6) o eseguire l'eutanasia per fungere da donatori di cellule Tcs in "trasferimento adottivo OUT" (fase 10).

5. Induzione di cellule effettrici T (Teff) per la reazione CHS mediata da Th1 (fase di sensibilizzazione della CHS)

  1. Il giorno "0", radere il torace e l'addome dei topi (area di 2 × 2 cm) usando sapone grigio con acqua seguito da una lama di rasoio. Lasciare riposare la pelle per 6 ore prima di applicare l'aptene per garantire l'assenza di irritazioni.
  2. Lo stesso giorno, poco prima dell'uso, preparare la soluzione di aptene (5%) in un flaconcino di vetro e coprirla con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce: 2,4,6-trinitroclorobenzene (TNCB) in una miscela acetone-etanolo (rapporto 1:3).
  3. Lo stesso giorno, sensibilizzare i topi applicando 150 μL di aptene sul punto precedentemente rasato. Applicare il veicolo da solo (miscela acetone-etanolo) nel gruppo di controllo negativo per valutare la reazione infiammatoria aspecifica. Prima di rimettere l'animale nella gabbia, attendere 30 s per lasciare asciugare la pelle.
    ATTENZIONE: Utilizzare i guanti; Il TNCB provoca gravi reazioni allergiche nella maggior parte delle persone.

6. Modello attivo: Test di cellule Ts o Tcs in CHS mediata da Th1

NOTA: Questa procedura è illustrata nella Figura 2.

  1. Indurre la cellula Ts o Tcs seguendo i passaggi 3 e 4. Questa procedura durerà dal giorno "0" fino al giorno "+8".
  2. Il giorno "+8", inizia a indurre le cellule di Teff seguendo il passaggio 5.
  3. Quattro giorni dopo, valutare la risposta della SIC eseguendo la fase di elicitazione (challenge). In breve, applicare TNCB su entrambi i lati delle orecchie. Quindi, quantifica lo spessore delle orecchie misurandole con un micrometro. Una descrizione dettagliata di questo test e di altri possibili endpoint è riportata altrove (Zemelka-Wiacek M. et al.27).

7. Isolamento di cellule Teff, Ts o Tcs da topi donatori

  1. Sterilizzare il tavolo operatorio con una soluzione di etanolo al 70% sia prima che dopo ogni procedura. Condurre tutte le procedure all'interno di una cabina di biosicurezza per mantenere la sterilità e utilizzare strumenti sterilizzati. Per isolare le cellule Ts, Tcs e Teff il giorno "+8", utilizzare topi immunizzati con EC descritti rispettivamente nei passaggi 3, 4 e 5.
    NOTA: Rispettare un rapporto donatore/ricevente di 1:1.
  2. Anestetizzare i donatori con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato per almeno 5 minuti.
  3. Disinfettare l'intera zona addominale del topo anestetizzato con etanolo al 70%, quindi incidere lo strato addominale (3-4 cm) per esporre la cavità peritoneale. Isolare i linfonodi ausiliari e inguinali (ALN) e la milza (SPL) con la pinza sterile in tubi riempiti con DPBS sterile integrato con siero fetale bovino (FBS) all'1%. Raccogli gli ALN di tutti i donatori in una fiala e gli SPL in un'altra e mantieni le fiale sul ghiaccio. Ogni ascella contiene due linfonodi ascellari, mentre un singolo linfonodo inguinale è situato nella regione dell'anca adiacente a tre vasi sanguigni. Gli SPL sono posizionati sul lato sinistro del corpo, dietro l'intestino e lo stomaco.
    NOTA: Lavorare con strumenti sterili sotto la cabina di biosicurezza per mantenere le condizioni di sterilità. Dopo questa procedura, i topi devono essere soppressi seguendo protocolli approvati istituzionalmente.
    1. Schiacciare il tessuto tra le estremità smerigliate di due vetrini da microscopio. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare con una dimensione dei pori di 70 μm.
  4. Sciacquare le cellule con 30 mL di DPBS integrato con FBS all'1%. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1-5 mL di DPBS.
  5. Contare la vitalità della cellula utilizzando un emocitometro e il Trypan Blue. Miscelare 10 μL di sospensione cellulare con 90-990 μL di Trypan Blue, regolando il volume in base alla conta cellulare. Incorporare questo fattore di diluizione nel calcolo della vitalità.
  6. Preparare una miscela di ALN e SPL (rapporto 1:1). Rispettare il numero di cellule: utilizzare da 1 a 5 x 10cellule da 7 Ts o Tcs per ricevente in 1 mL di DPBS integrato con l'1% di FBS e 7 x 10cellule da 7 Teff/ricevente in 1 mL di DPBS. Mantieni il rapporto donatore-ricevente per tutte le popolazioni cellulari 1:1 e anche il rapporto donatore-DPBS 1:1. Conservare le fiale con le cellule sul ghiaccio.
    NOTA: L'esecuzione di ulteriori esperimenti in vitro richiede un aumento proporzionale del numero di donatori di cellule.
    NOTA: Inoltre, le cellule Teff, Ts e Tcs isolate possono essere sottoposte a ulteriori purificazioni o analisi mediante citometria a flusso, come la fenotipizzazione o la valutazione della secrezione di citochine. È anche possibile avviare colture cellulari per esplorare la capacità di proliferazione cellulare o quantificare i livelli di citochine nei surnatanti di coltura. La conduzione di ulteriori esperimenti richiede un aumento proporzionale del numero di donatori di cellule.

8. Trasferimento adottivo IN: Test di Ts nella SIC mediata da Th1

NOTA: Questa procedura è illustrata nella Figura 3. Lavorare in modo sterile e utilizzare una soluzione di etanolo al 70% sia prima che dopo ogni procedura. Assicurarsi che tutte le operazioni cellulari siano condotte all'interno di una cabina di biosicurezza per mantenere la sterilità e utilizzare strumenti sterilizzati.

  1. Indurre e isolare le cellule Ts (donatori) seguendo i passaggi 3 e 7. Sciacquare le celle con 30 ml di DPBS. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di DPBS per ricevente (rapporto donatore-ricevente 1:1).
  2. Riceventi (topi singenici naïve): anestetizzare i riceventi con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato per almeno 5 minuti.
  3. Somministrare un'iniezione endovenosa (endovenosa) di una miscela preparata di 1-5 x 10cellule 7 Ts (fase 8.2) in 200 μL nel ricevente anestetizzato.
  4. Lo stesso giorno, indurre la reazione CHS mediata da Th1. In breve, indurre la cellula di Teff (fase di sensibilizzazione) descritta nei passaggi 5.1-5.3). Quattro giorni dopo, valutare la risposta CHS eseguendo la fase di elicitazione (challenge) descritta nel passaggio 6.3.

9. Trasferimento adottivo OUT: test di Ts nella SIC mediata da Th1

  1. Indurre e isolare le cellule Ts e Teff (donatori) seguendo i passaggi 3, 5 e 7. Conservare il Ts e il Teff isolati in due fiale separate. Dividere le cellule di Teff in due fiale: una per il "gruppo test Ts" e una per il "controllo CHS".
    NOTA: Lavorare in modo sterile e utilizzare una soluzione di etanolo al 70% sia prima che dopo ogni procedura. Assicurarsi che tutte le operazioni cellulari siano condotte all'interno di una cabina di biosicurezza per mantenere la sterilità e utilizzare strumenti sterilizzati. Includere un gruppo di controllo di riceventi a cui verranno somministrate solo cellule Teff ("controllo CHS"). Per questo gruppo, i donatori in più dovrebbero essere utilizzati per aderire al rapporto donatore-ricevente di 1:1. Per migliorare la qualità dei risultati, è necessario aggiungere cellule di controllo che ricevono cellule di controllo trasferite da donatori trattati con EC con una soluzione solvente. La decisione di aggiungere un ulteriore gruppo di riceventi e donatori deve essere attentamente pianificata, perché questo approccio richiede molti topi, il che non è conforme al principio delle 3R (Ridurre, Perfezionare, Sostituire).
  2. Aggiungi le cellule Ts alle celle Teff per il "gruppo di test Ts". Aggiungere un DPBS adeguato alle cellule di Teff nella fiala "Controllo CHS".
    NOTA: Conservare il numero di cellule 1-5 x 107 Ts e 7 x 10cellule 7 Teff per ricevente.
  3. Mescolare delicatamente tutte le fiale Conservare i flaconcini a bagnomaria (37 °C) per 30 minuti, mescolando delicatamente ogni 5 minuti.
  4. Sciacquare ogni fiala di cellule con 30 ml di DPBS integrato con FBS all'1%. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 200 μL di DPBS/ricevente.
  5. Far passare ogni sospensione cellulare attraverso un filtro a celle porose da 70 μm. Se necessario, regolare il volume di 200 μL di DPBS/ricevente.
  6. Riceventi (topi singenici naïve): anestetizzare i riceventi con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato per almeno 5 minuti.
  7. Somministrare un'iniezione endovenosa (e.v.) di cellule preparate.
  8. Lo stesso giorno, indurre la fase di elicitazione della CHS (provocazione) descritta al punto 6.3. Includi il "controllo negativo", dove condurre solo la sfida CHS.

10. Trasferimento adottivo OUT: Test di Tcs in CHS mediata da Th1

  1. Indurre e isolare le cellule Ts, Tcs e Teff (donatori) seguendo i passaggi 3-5 e il passaggio 7.
    NOTA: Lavorare in modo sterile e utilizzare una soluzione di etanolo al 70% sia prima che dopo ogni procedura. Assicurarsi che tutte le operazioni cellulari siano condotte all'interno di una cabina di biosicurezza per mantenere la sterilità e utilizzare strumenti sterilizzati. Includere due gruppi di controllo di riceventi: un "controllo CHS" in cui verranno somministrate solo cellule Teff e un "controllo Ts" in cui le cellule Teff saranno incubate esclusivamente con cellule Ts. Per questi gruppi, utilizzare donatori extra per aderire al rapporto donatore-ricevente di 1:1.
  2. Conservare le cellule Ts e Tcs isolate in fiale separate. Dividere le cellule di Teff in tre fiale: una per il "gruppo test Tcs", una per il "controllo Ts" e una per il "controllo CHS".
  3. Prima incubazione: per il (a) "gruppo di prova Tcs" aggiungere cellule Tcs alle cellule Teff. Per (b) "controllo Ts" e (c) "controllo CHS", aggiungere una quantità adeguata di DPBS alle cellule Teff (vedi Tabella 2).
    NOTA: Conservare il numero di celle 1-5 x 107 Tcs e 7 x 10celle 7 Teff per ricevente.
  4. Mescolare delicatamente tutte le fiale Conservare a bagnomaria (37 °C) per 30 min, mescolando delicatamente ogni 5 min.
  5. Sciacquare ogni fiala di cellule con 30 ml di DPBS integrato con FBS all'1%. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 1 mL di DPBS integrato con l'1% di FBS per ricevente. Mantenere un rapporto miscela cellulare-DPBS 1:1.
  6. Seconda incubazione: per il (a) "gruppo test Tcs" aggiungere le cellule Ts alla miscela di cellule Teff e Tcs preincubate. Per il (b) "controllo Ts", aggiungere le cellule Ts alla miscela di cellule di Teff preincubate con DPBS. Per il (c) "controllo CHS", aggiungere un adeguato DPBS alle cellule di Teff preincubate.
    NOTA: Conservare il numero di cellule 1-5 x 107 Ts per ricevente. Condurre incubazioni in tutti i gruppi sperimentali (a, b e c) per garantire l'uniformità della perdita cellulare durante le procedure di lavaggio e centrifugazione.
  7. Mescolare delicatamente tutte le fiale Conservare a bagnomaria (37 °C) per 30 min, mescolando delicatamente ogni 5 min.
  8. Sciacquare ogni fiala di cellule con 30 ml di DPBS. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 200 μL di DPBS/ricevente.
  9. Far passare ogni sospensione cellulare attraverso un filtro a celle porose da 70 μm. Se necessario, regolare il volume di 200 μL di DPBS/ricevente.
  10. Riceventi (topi singenici naïve): anestetizzare i riceventi con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato per almeno 5 minuti.
  11. Somministrare un'iniezione endovenosa (e.v.) di cellule preparate.
  12. Lo stesso giorno, indurre la fase di elicitazione della CHS (provocazione) descritta al punto 6.3. Includi il "controllo negativo", dove condurre solo la sfida CHS.

Tabella 2: Schema delle incubazioni cellulari durante il "trasferimento OUT" di Tcs. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Risultati

Questo studio esamina se gli antigeni applicati attraverso la pelle da soli o in combinazione con PAMP possono indurre cellule Ts o Tcs, rispettivamente, che modulano la reazione CHS. L'immunizzazione di topi CBA/J tramite EC con 100 μg di TNP-Ig o TNP-Ig più 100 μg di LPS induce cellule Ts o Tcs, rispettivamente. I topi sono stati quindi sensibilizzati con TNCB al 5% e sfidati con lo stesso aptene 4 giorni dopo. La reazione è stata valutata misurando il gonfiore dell'o...

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Discussione

Le indagini sono state condotte su molti modelli animali diversi e l'utilizzo di molti ceppi di topi come BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 e B10.PL e SJL dimostrano che l'immunizzazione EC con un antigene assegnato può servire come mezzo versatile e potenzialmente illimitato per creare tolleranza e controllare le risposte immunitarie indesiderate. L'attuale protocollo delinea due modelli di trasferimento cellulare: (1) "trasferimento adottivo IN", utile per valutare l'immunomodulazione ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Comitato polacco per la ricerca scientifica 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 e dal National Science Center N N401 3554 33 a M.S. I grafici sono stati disegnati utilizzando il software GraphPad Prism 10.2.3 e le figure 1-3 sono state create in BioRender. Zemelka-Wiacek, M. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Gli autori ringraziano Dorota Woźniak per essersi presa cura delle colonie di topi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,4,6-trinitroclorobenzene (TNCB)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, GiapponeC0307
Immunoglobulina murina coniugata con 2,4,6-trinitrofenil (TNP-Ig)Cattedra di Scienze Biomediche, Facoltà di Scienze della Salute, Facoltà di Medicina dell'Università Jagellonica, Cracovia, Polonia
acetone (reagente ACS, ≥ 99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germania179124
Carta stagnola di alluminioMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ185140   
bilancio analitico  Sartorius Weighing Technology GmbH, Göttingen, GermaniaPRACTUM224-1, 29105177
Albumina sierica bovina (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaA9418
CBA/J (H-2k) Unità di selezione della Cattedra di Scienze Biomediche, Facoltà di Scienze della Salute, Facoltà Medica dell'Università Jagellonica, Cracovia, Polonia
Colino cellulare, dimensione poro 70 e mu; mBIOLOGIX, Cina15-1070
capacità delle pipette usa e getta: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco & prime; Soluzione salina tamponata fosfato (DPBS)ThermoFisher Scientific,   Waltham, Massachusetts, USA14190144
Tubi Eppendorf Safe-Lock 1,5mlEppenforf, Germania30120086
Tubi Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mlEppenforf, Germania30120094
etanolo 100% (alcol assoluto)Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.07017
etanolo 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.59010
Siero fetale bovino (FBS)ThermoFisher Scientific,   Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Vetri per microscopio in vetro (sabbiati con una singola scrampicata)ThermoScientific, Portsmouth, NH, USA421-004T
Prisma Graph PadGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
sapone grigio (saponetta Bialy jelen)Polline Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Polonia163057
EmocitometroVWR, Avantor, USA612-5719
incubatore Heracell 150iElettro Termodinamico & nbsp; LED Gmbh, Germania41071068
isoflurano (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, USA8AGG9623
ketamina 100 mg/mL, soluzione per iniezioneBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poloniacat.# non disponibile
Centrifuga da laboratorio (Heraeus Fresco 21)Thermo Scientific, Germania75002425
Centrifuga da laboratorio (Heraeus Megafuge 1.0R)  Thermo Scientific, GermaniaB00013899
Lipopolisaccaride (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaL-8274
maschera (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti111-0917
MicrometroMitutoyo, Tokyo, Giappone193-111
microscopio con obiettiviLeica Microsystems CMS GmbH, GermaniaDM1000, 294011-082007
glicole propilenico  Chempur, Piekary figure-materials-1 Polonia114489005
lametta di rasoioVWR, Radnor, Pennsylvania, Stati UnitiPERS94-0462
Custodie trasparenti per documenti 30 & micro; mSCHEMA5906961126542
Blu di tripanoMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaT8154
tubi 15 mL steriliMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaCLS430055 (Corninig)
tubi 50 mL, steriliMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaCLS430290 (Corning)
fiale, tappo a vite, vetro trasparente (solo fiala) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germania27173
Viscoplast Polovis, adesivo di seta, 5x0.0125m3M Polonia, Nadarzyn, Polonia7100231620
bagno d'acqua & nbsp;AJL Electronic, PoloniaLW102
Soluzione di xilazina (Xylapan 20 mg/mL) per iniezioneVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poloniacat.# non disponibile

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