Articolo metodologico

Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

DOI:

10.3791/67584

⸱

10 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo rapporto descrive un protocollo automatizzato per saggi di immunofluorescenza multiplex (mIF) su un coloratore automatico per vetrini. Dimostra l'elevata riproducibilità della proteomica spaziale su autocoloratori tissutali standard ad alto rendimento e imager a fluorescenza su vetrini interi, ideale per saggi mIF personalizzati su un gran numero di vetrini tissutali nella ricerca traslazionale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'immunofluorescenza multiplex (mIF) è una tecnica avanzata che consente un'analisi dettagliata e spazialmente risolta di campioni di tessuto visualizzando più biomarcatori proteici all'interno di una singola sezione. Tuttavia, la maggior parte delle tecnologie mIF si trova ad affrontare compromessi significativi tra sensibilità e produttività durante il multiplexing, ponendo un limite critico per rilevare in modo affidabile biomarcatori a bassa abbondanza su più sezioni di tessuto. Un nuovo approccio per il mIF utilizza codici a barre di DNA unici legati agli anticorpi, che vengono amplificati attraverso un meccanismo di amplificazione parallela di una singola molecola. Questo metodo consente di ottenere una qualità di colorazione altamente paragonabile all'immunoistochimica (IHC) di livello clinico, fornendo al contempo elevate capacità di multiplexing e imaging dell'intero vetrino ad alta produttività. Questo test prevede l'amplificazione di un cocktail di anticorpi con codice a barre del DNA sul tessuto, seguito da cicli sequenziali di passaggi di rilevamento per visualizzare quattro oligonucleotidi marcati con fluorescenza per ciclo. Questo processo consente quindi di rilevare otto o più biomarcatori per campione di tessuto. Le fasi chiave di questo metodo includono la preparazione automatizzata dei tessuti, l'applicazione di anticorpi primari coniugati con codici a barre del DNA, l'amplificazione del segnale e i cicli iterativi di rilevamento, imaging e rimozione del segnale. L'acquisizione delle immagini è seguita dalla registrazione delle immagini e dall'analisi delle singole cellule utilizzando una piattaforma di scienza dei dati di immagini spaziali potenziata dall'intelligenza artificiale. Per questo studio, il protocollo è stato applicato a micro-array multi-tessuto (TMA) fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE), tra cui tonsille, melanoma, colon e nuclei linfonodali in triplicato. Le tecnologie avanzate di mIF forniscono maggiori informazioni sulla risposta tumorale, sul microambiente tumorale e sul panorama immunitario. Superando i compromessi intrinseci tra sensibilità, capacità di multiplexing e produttività dell'imaging, i ricercatori possono ora mirare a comprendere l'eterogeneità delle firme molecolari impegnative e dei biomarcatori delle risposte terapeutiche.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'immunofluorescenza altamente multiplexata (mIF) è una tecnica avanzata che sta rivoluzionando il campo dell'analisi tissutale consentendo la visualizzazione simultanea di più biomarcatori proteici all'interno di una singola sezione di tessuto 1,2. Questa capacità fornisce un livello di dettaglio e una risoluzione spaziale senza precedenti, che è spesso cruciale per comprendere le interazioni tra tipi di cellule con morfologie complesse all'interno del microambiente tissutale su più scale spaziali3. La tecnica è particolarmente preziosa nella ricerca oncologica, dove può essere utilizzata per co-localizzare biomarcatori tumorali, bersagli di farmaci proteici, lo stato immunitario locale e di checkpoint, le interazioni tra diversi tipi di cellule e persino i modelli di colocalizzazione subcellulare correlati al metabolismo dei farmaci all'interno del tessuto 4,5,6.

Nonostante il suo potenziale, la maggior parte delle tecnologie mIF deve ancora affrontare sfide significative, in particolare nel bilanciare sensibilità e throughput con le capacità di multiplexing. Questa limitazione è particolarmente critica per il rilevamento di biomarcatori clinici che possono mostrare un'espressione molto bassa come HER2 e PD-L1 7,8,9. Per capire perché è così, è essenziale comprendere altre modalità di mIF. Questi metodi tradizionali hanno aperto la strada a piattaforme mIF più sofisticate, ma presentano una serie di vantaggi e limitazioni.

L'immunofluorescenza diretta (DIF) utilizza anticorpi direttamente coniugati ai fluorofori, o a un oligonucleotide in grado di reclutare fluorofori10. Questo metodo è semplice da multiplexare, ma soffre di una minore sensibilità e difficoltà a risolvere il segnale dal fondo tissutale o dagli artefatti di colorazione.

L'immunofluorescenza indiretta (IIF) utilizza un anticorpo secondario che si lega all'anticorpo primario. Questo ha aumentato il segnale rispetto al DIF basato sulla primaria. Se combinato con un design migliorato delle celle a flusso, l'IIF sequenziale può rilevare fino a 40 biomarcatori in un unico test 2,11. Tuttavia, questi soffrono ancora di una relativa mancanza di sensibilità rispetto alle strategie basate sugli enzimi per l'amplificazione del segnale, come quelle che si trovano nelle tecniche di immunoistochimica (IHC).

L'immunofluorescenza basata sulla catalisi enzimatica è più frequentemente osservata nei metodi IHC che utilizzano la perossidasi di rafano (HRP) per la deposizione di coloranti cromogenici (DAB) o fluorescenti (ad esempio, l'amplificazione del segnale della tiramide (TSA)). Poiché questi saggi si basano sullo stesso enzima catalitico, la loro sensibilità di rilevamento è simile, il che rende i saggi mIF multispettrali basati su TSA adatti per applicazioni cliniche 2,12. Il vantaggio dell'amplificazione del segnale basata sul DNA è l'elevato grado di multiplexing possibile, pur mantenendo un'eccellente amplificazione del segnale e modularità. Al contrario, i metodi basati su HRP sono meno modulari e difficili da ottimizzare, richiedendo ulteriori cicli di sviluppo e test del pannello.

Immunofluorescenza anticorpale con codice a barre del DNA
Il test mIF qui dimostrato utilizza una DNA polimerasi per amplificare simultaneamente gli anticorpi con codice a barre del DNA, seguiti da cicli di colorazione e decolorazione della sonda reporter utilizzando quattro oligonucleotidi fluorescenti per ciclo di imaging (Figura 1).

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Figura 1: Illustrazione grafica del protocollo del saggio di immunofluorescenza multiplex. Gli anticorpi coniugati con codice a barre vengono aggiunti in un unico passaggio e i codici a barre vengono amplificati contemporaneamente. In ogni ciclo vengono aggiunti gruppi di quattro sonde fluorescenti, consentendo di visualizzare quattro marcatori contemporaneamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'aggiunta di anticorpi a ciclo singolo e l'amplificazione a passaggio singolo semplificano notevolmente il protocollo di analisi. Il processo è facilitato da sistemi automatizzati di colorazione e scansione ad alto rendimento, che garantiscono risultati riproducibili da un vetrino all'altro e da un lotto all'altro su un gran numero di campioni utilizzati negli studi clinici13.

Uno dei principali vantaggi di questa tecnologia è la sua capacità di mantenere un'elevata sensibilità consentendo al contempo un ampio multiplexing2. Il flusso di lavoro garantisce inoltre che la produttività dell'imaging rimanga elevata, affrontando così uno dei principali limiti delle tecnologie mIF altamente multiplexate (ad esempio, > 8 biomarcatori) per gli studi clinici. Ciò è particolarmente importante nella ricerca clinica, dove sottili variazioni nei bersagli farmacologici a bassa abbondanza (ad esempio, HER2 basso) tra i pazienti possono fornire informazioni critiche sulla risposta terapeutica.

Oltre a queste caratteristiche chiave, questo test offre anche la configurabilità del pannello, le capacità di imaging dell'intero vetrino ad alto rendimento e la risoluzione ottica necessaria per studiare i processi e i compartimenti subcellulari, nonché le sporgenze cellulari associate ai macrofagi e alle cellule dendritiche. La capacità di studiare fenotipi cellulari complessi su più scale spaziali è un vantaggio fondamentale dell'imaging ottico rispetto ai metodi basati sulla citometria di massa (IMC)2.

In questo lavoro, viene presentato un protocollo per un saggio mIF a 8 plessi utilizzando un autostainer e uno scanner per vetrini interi. Questo test include un pannello di otto anticorpi primari: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 e pan-citocheratina14. Questo pannello di marcatori consentirà l'immunoprofilazione del tessuto tumorale e l'identificazione delle cellule presenti nell'ambiente tumorale o stromale. Questo protocollo utilizza un coloratore automatico per vetrini per la colorazione iniziale e i cicli di scambio della sonda, e la colorazione e l'imaging possono essere completati entro 2 giorni. Vengono inoltre illustrati i metodi per convalidare un saggio mIF e condurre l'analisi delle immagini risultanti.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti devono seguire le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana. Tutte le sezioni di tessuto impiegate in questo protocollo sono state ottenute da un fornitore di tessuti esterno.

1. Preparazione del campione di tessuto

  1. Selezionare il blocco di tessuto FFPE da colorare utilizzando il test mIF. Se si utilizzano vetrini per tessuti FFPE, assicurarsi che i campioni abbiano uno spessore compreso tra 3 e 5 μm, montati su vetrini caricati positivamente e privi di rughe o altri strappi che potrebbero influire negativamente sui risultati finali.
    NOTA: Per ottenere i migliori risultati, evitare di colorare campioni di tessuto che sono stati sezionati più di 2 mesi prima. Inoltre, evita i blocchi che sono stati conservati per più di 10 anni o che sembrano essere visivamente asciutti.
  2. Se si lavora con blocchi di tessuto FFPE, utilizzare un microtomo per tagliare il numero richiesto di vetrini di tessuto a uno spessore di 4 μm, montando i vetrini su un vetrino caricato positivamente. Per ottenere i risultati più coerenti, montare tutte le diapositive con lo stesso orientamento. Assicurati che il tessuto sia privo di rughe e strappi.
  3. Se i campioni non devono essere colorati immediatamente, conservarli in una scatola per vetrini sotto azoto per un massimo di 2 mesi.

2. Registrazione dei reagenti ausiliari e degli anticorpi primari per la messa a punto iniziale

  1. All'interno del software autostainer, accedere alla scheda di configurazione del reagente nella parte superiore dello schermo. Fare clic su Aggiungi per aggiungere nuovi reagenti.
  2. I saggi di colorazione e scambio utilizzeranno nove contenitori di reagenti, seguendo le informazioni riportate nella Tabella 1. Per utilizzarli, ad esempio, per il primo reagente denominato Wash Buffer, con il nome abbreviato ISPWsh1, seguire i passaggi. Seleziona il tipo come Ausiliario e verifica che sia *BWash che DI siano elencati in Bulk compatibili. Seleziona la casella Preferiti prima di salvare.
  3. Ripetere questa procedura per i reagenti ausiliari rimanenti, utilizzando i nomi e i nomi abbreviati riportati nella Tabella 1.
    1. Il reagente della soluzione di amplificazione (ULTAmp1) non è compatibile con Bond Wash. Nella finestra di configurazione dei reagenti, selezionare *BWash e fare clic sul pulsante << per spostare il reagente dall'elenco dei reagenti compatibili alla sezione dei reagenti disponibili. La mancata rimozione di Bond Wash come reagente compatibile per il reagente della soluzione di amplificazione può comportare una riduzione significativa delle prestazioni di colorazione del saggio.
  4. Una volta registrati tutti i contenitori dei reagenti, creare un kit di rilevamento della ricerca prima di iniziare la corsa iniziale. Il kit di rilevamento richiede un contenitore di titolazione da 30 ml.
  5. Aggiungere il contenitore di titolazione da 30 ml al kit di rilevamento. Per evitare che i due vengano separati, fissare il contenitore di titolazione alla bacchetta.
  6. Scansiona il codice a barre sul lato sinistro del kit di rilevamento. Nella finestra pop-up successiva, assegnare un nome al kit di rilevamento (ad esempio, InSituPlex Kit). Impostare la data di scadenza su 10 anni dalla data di registrazione.
    NOTA: La data di scadenza qui impostata non è la data indicata sul reagente, ma è la data di scadenza del reagente nel contenitore di titolazione. L'impostazione della data di scadenza in un lontano futuro garantisce che il kit non scada inutilmente.
  7. Per la prima posizione del reagente del kit, selezionare Wash Buffer come reagente dal menu a discesa.
  8. Fare clic sul campo del codice a barre per la posizione del reagente ed eseguire la scansione del codice a barre del contenitore di titolazione da 30 ml con nastro adesivo per registrarlo come tampone di lavaggio e collegare il contenitore del reagente alla bacchetta di rilevamento.
  9. Una volta collegato il contenitore di titolazione al kit, fare clic sul pulsante Aggiungi per salvare e chiudere la finestra pop-up.
  10. Riempire il contenitore di titolazione con 30 mL di 1x Bond Wash e conservare in frigorifero a 4 °C tra una colorazione e l'altra.

Tabella 1: Reagenti ausiliari per la configurazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

3. Configurazione iniziale del protocollo

  1. Dopo aver registrato correttamente tutti i contenitori di reagenti, accedere alla scheda Configurazione protocollo nella parte superiore della schermata del software autostainer.
  2. Conferma quale versione del software è attualmente in esecuzione facendo clic sul logo in alto a destra dello schermo. Il pop-up risultante mostrerà la versione del software attualmente installata sotto l'intestazione Informazioni sul software.
  3. Se la versione del software è 7.0 o successiva, sarà presente un modello preinstallato del protocollo di colorazione. Nella parte inferiore dello schermo, verifica che la selezione Stato preferito sia impostata su Tutti. Assegna al protocollo modello il nome *ISP Staining Assay. Per le versioni precedenti del software, il protocollo è disponibile nella Tabella 2.
  4. Fare clic con il pulsante destro del mouse su *ISP Staining Assay e copiare il protocollo. Nella finestra pop-up risultante, rinominare il protocollo Staining Assay 1 con il nome abbreviato (ISP_IHC1)
  5. Nel sistema di rilevamento preferito, selezionare quello creato durante l'impostazione iniziale del reagente al passaggio 2.6.

Tabella 2: Protocollo per il protocollo di colorazione in immunofluorescenza multiplex. *MARKER corrisponde alla soluzione anticorpale e Wash Buffer corrisponde alla soluzione BOND Wash. Tutti gli altri reagenti ausiliari hanno i componenti del kit denominati in modo corrispondente. Questo protocollo è compatibile con il software versione 7.0 e successive, BXD 39 e successive. Clicca qui per scaricare questa tabella.

4. Impostazione del reagente

  1. Scongelare tutti i reagenti del kit ad eccezione dei coniugati anticorpali, dell'enzima di amplificazione, dell'iniziatore di scambio e del neutralizzatore di scambio a temperatura ambiente. Conservare il resto dei componenti del kit a -20 °C fino al momento dell'uso.
  2. Se non è già stato fatto, registrare un nuovo contenitore di titolazione per ciascuno dei reagenti definiti al punto 2.3. Inserire un nuovo inserto di titolazione in ciascuno.
  3. Prendi il sistema di rilevamento della ricerca registrato al passaggio 2.6 e assicurati che il contenitore del tampone di lavaggio associato sia riempito a 30 ml con 1 soluzione di lavaggio Bond. Posizionare i contenitori di titolazione per ciascun reagente nel sistema.
  4. Preparare il diluente Ab nel contenitore corrispondente. Il volume richiesto è di 350 + (150 μl x numero di vetrini) ed è composto dal diluente anticorpale fornito. Agitare il tampone per mescolare dopo lo scongelamento.
  5. Preparare la soluzione colorante per anticorpi nel contenitore 1 della soluzione colorante per anticorpi. Aggiungere tutti gli anticorpi a una diluizione 1:100 nel diluente anticorpale fornito. Il volume richiesto è 350 + (150 μL x numero di vetrini). Non agitare le scorte di anticorpi o l'intera soluzione colorante con anticorpi, ma miscelare solo mediante pipettaggio.
  6. Preparare la miscela di preamplificazione nel contenitore della miscela di preamplificazione. Il volume richiesto è di 350 + (150 μl x numero di vetrini) ed è composto dalla miscela di preamplificazione fornita. Vorticare questa soluzione dopo lo scongelamento.
  7. Preparare la soluzione di amplificazione nel contenitore della soluzione di amplificazione. Il volume richiesto è di 350 + (150 μl x numero di vetrini) ed è composto da un enzima di amplificazione diluito 1:10 in tampone di amplificazione. Non agitare l'enzima di amplificazione o la soluzione di amplificazione completata, ma miscelare solo mediante pipettaggio.
  8. Preparare il colorante nucleare in un contenitore per il colorante nucleare. Il volume richiesto è di 350 + (300 μl x numero di vetrini) ed è costituito dalla soluzione di colorante di contrasto nucleare fornita diluita 1:100 in acqua ultrapura. Mescolare a vortice.
  9. Preparare la miscela di sonde fluorescenti corrispondente al primo ciclo di imaging nel contenitore della sonda fluorescente. Il volume richiesto è di 350 + (450 μL x numero di vetrini), costituito dalla soluzione delle sonde fluorescenti 1 diluita 1:20 all'interno del tampone della sonda. Vorticare i componenti dopo lo scongelamento e la miscela completa finale.
  10. Una volta che tutti i reagenti sono stati preparati e collocati nei contenitori corrispondenti, posizionare l'intera bacchetta del reagente nel software per consentire la misurazione del volume del reagente.

5. Eseguire l'installazione

  1. Una volta preparati tutti i reagenti, accedere alla scheda Configurazione vetrino nella parte superiore del software e selezionare il pulsante Nuovo studio . Aggiungi l'ID studio, il nome e i commenti allo studio come desideri. Fare riferimento alla Figura 2 come esempio.
  2. In Volume di erogazione, selezionare 150 μl e *Dewax 4 passaggi come protocollo di preparazione. Se *I passaggi di Dewax 4 non vengono visualizzati nel menu a discesa, individuare questo protocollo nel menu Configurazione protocollo e selezionare la casella Preferito . Premere OK.
  3. Una volta creato lo studio, selezionare il pulsante Aggiungi diapositiva sul lato destro della schermata di configurazione della diapositiva. In Commenti diapositiva assegnare un nome univoco alla diapositiva.
  4. Per i campi aggiuntivi in questa schermata, impostare Tipo di tessuto su Test Tessuto e impostare il volume di erogazione su 150 μL con la modalità di colorazione Singola nel menu a discesa a sinistra e Routine nel menu a discesa a destra. In processo, selezionare IHC, con l'indicatore Soluzione colorante per anticorpi.
  5. Nella sezione protocollo della finestra Aggiungi vetrino, selezionare Saggio di colorazione 1 per la colorazione, * Decerare 4 passaggi come preparazione e *HIER 20 min con ER2 come HIER. Il protocollo enzimatico rimarrà *----. Una volta completato, fai clic su Aggiungi diapositiva. Fare riferimento alla Figura 2 come esempio.
  6. Ripetere questa procedura in base alle esigenze per il numero di vetrini da eseguire nello studio, assicurandosi che il campo Commenti vetrini venga aggiornato per ogni diapositiva aggiunta in modo che possano essere identificati in modo univoco in un secondo momento. Dopo aver aggiunto tutti i vetrini, chiudere la finestra Aggiungi vetrino e stampare tutte le etichette, apponendo le relative sezioni di tessuto.
  7. Caricare ogni vetrino sul vassoio e posizionare i riquadri di copertura sopra ogni sezione prima di caricare il vassoio sul software. Una volta aggiunti i reagenti e i vetrini, selezionare l'autostainer corrispondente sul lato destro del software. Una volta selezionata questa opzione, saranno visibili tutti e tre i vassoi per vetrini e le informazioni per tutti i reagenti sul software, inclusi i reagenti sfusi e quelli aggiunti durante la preparazione dei reagenti.
  8. Assicurarsi che i contenitori dei reagenti sfusi siano pieni e che i contenitori dei rifiuti abbiano un volume sufficiente per completare la seduta, quindi premere il pulsante Riproduci per iniziare la seduta.
  9. Ogni corsa dura circa 5 ore e 15 minuti per essere completata. Prendere nota del tempo di arresto e assicurarsi che i vetrini vengano rimossi prontamente dall'autostainer una volta terminato il protocollo.

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Figura 2: Richieste per il software. (A) Nuovo prompt di studio sul software Autostainer, che mostra le impostazioni corrette per il protocollo di colorazione in immunofluorescenza multiplexata (mIF). (B) Aggiungere il prompt Slide sul software, che mostra le impostazioni corrette per il protocollo di colorazione mIF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Imaging

  1. Al termine del protocollo di colorazione, rimuovere i vetrini e il vetrino coprioggetti macchiati nel supporto di montaggio. Lasciare indurire il supporto di montaggio al buio fino a quando il vetrino coprioggetti non è saldamente fissato in posizione (in genere 1 ora o più, punto di pausa).
  2. Vetrini di immagini su un microscopio a fluorescenza o su uno scanner per vetrini interi con filtri appropriati per il saggio. I coloranti utilizzati in questo test sono in genere compatibili con i filtri per DAPI, FITC, TRITC, Cy5 e Cy7.
  3. Le immagini appariranno simili a quelle della Figura 3A. Assicurarsi visivamente che tutte le aree del tessuto siano correttamente a fuoco e che i segnali appaiano a un livello di intensità appropriato (non sovra/sottoesposti). Se necessario, ricreare l'immagine delle diapositive con diverse impostazioni di esposizione.
  4. Dopo l'imaging, se è necessario un ulteriore ciclo di imaging, immergere i vetrini in PBS 1x fino a quando i vetrini coprioggetti non cadono da soli. (punto di pausa)

7. Configurazione iniziale del protocollo di scambio

  1. Se la versione del software è 7.0 o successiva, sarà presente un modello preinstallato del protocollo autostainer. Nella parte inferiore dello schermo, verificare che la selezione Stato preferito sia impostata su Tutti. Il protocollo modello sarà denominato *ISP Signal Exchg. Per le versioni precedenti del software, il protocollo è disponibile nella Tabella 3.
  2. Fare clic con il pulsante destro del mouse su *ISP Signal Exchg e copiare il protocollo. Nella finestra pop-up risultante, rinominare il protocollo Exchange Protocol 1 con il nome abbreviato ISPEXCH1. Assicurarsi che la casella Preferito sia selezionata prima di procedere e assegnare lo stesso nome del kit come stabilito nel passaggio 2.6.

Tabella 3: Protocollo per il protocollo di scambio del segnale di immunofluorescenza multiplex. Il tampone di lavaggio corrisponde alla soluzione di lavaggio BOND. Tutti gli altri reagenti ausiliari hanno i componenti del kit denominati in modo corrispondente. Questo protocollo è compatibile con il software versione 7.0 e successive, BXD 39 e successive. Clicca qui per scaricare questa tabella.

8. Configurazione ed esecuzione del protocollo Exchange

  1. Scongelare il tampone di scambio a temperatura ambiente. Mantenere il neutralizzatore di scambio e l'iniziatore di scambio a -20 °C fino all'uso. Per eseguire il protocollo di scambio sono necessari due contenitori per la titolazione dei reagenti e il kit di rilevamento.
  2. Preparare la soluzione di scambio nel contenitore corrispondente. Il volume richiesto è di 350 + (450 μL x numero di vetrini) ed è costituito da un iniziatore di scambio diluito 1:500 nel tampone di scambio. Non agitare l'enzima di scambio o la soluzione di scambio completata, ma miscelare solo mediante pipettaggio.
  3. Preparare la seconda miscela di sonde fluorescenti nel contenitore delle sonde fluorescenti 2. Il volume richiesto è di 350 + (450 μL x numero di vetrini) ed è composto dalla soluzione delle sonde fluorescenti 2 diluita 1:20 e dal neutralizzatore di scambio diluito 1:40 all'interno del tampone sonda 2. La miscela della sonda fluorescente e il tampone della sonda possono essere vortex, ma il neutralizzatore di scambio e la soluzione combinata finale devono essere miscelati solo con pipetta.
  4. Una volta preparati tutti i reagenti, posizionare l'intera bacchetta sull'autocoloratore e lasciare che i reagenti vengano sottoposti a test per immersione dalla macchina.
  5. Aggiungi tutte le diapositive seguendo il passaggio 5. Durante l'aggiunta della diapositiva, modificare l'indicatore in *Negativo. Per Preparazione, HIER ed Enzima, selezionare l'opzione *----, poiché non è necessario alcun dewax o recupero dell'antigene per il protocollo di scambio. Una volta completato, fai clic su Aggiungi diapositiva.
  6. Ripetere questa procedura in base alle esigenze per il numero di vetrini da eseguire nello studio, assicurandosi che il campo Commenti vetrini venga aggiornato per ogni diapositiva aggiunta in modo che possano essere identificati in modo univoco in un secondo momento.
  7. Dopo aver aggiunto tutti i vetrini, chiudere la finestra Aggiungi vetrino e stampare tutte le etichette, apponendo le relative sezioni di tessuto.
  8. Caricare ogni vetrino sul vassoio e posizionare i riquadri di copertura sopra ogni sezione prima di caricare il vassoio sul software.
  9. Una volta aggiunti tutti i reagenti e i vetrini, selezionare l'Autostainer corrispondente nel software; Questo sarà sul lato destro. Una volta selezionata questa opzione, saranno visibili tutti e tre i vassoi per vetrini e le informazioni per tutti i reagenti sul software, inclusi i reagenti sfusi e quelli aggiunti durante la preparazione dei reagenti.
  10. Assicurarsi che i contenitori dei reagenti sfusi siano pieni e che i contenitori dei rifiuti abbiano un volume sufficiente per completare la seduta.
  11. Dopo che questa operazione è stata confermata, premere il pulsante Riproduci per iniziare la corsa. Il protocollo richiede circa 90 minuti per essere completato. Prendere nota del tempo di arresto e assicurarsi che i vetrini vengano rimossi prontamente una volta completata la corsa.

9. Imaging

  1. Ripetere l'imaging per il nuovo ciclo di sonde, come al punto 5. Le immagini appariranno come nella Figura 3B.

10. Stacking (per l'imaging di proteine a >4 plex)

  1. Ora esisteranno più immagini per la stessa diapositiva. Combina le immagini nel software di co-registrazione delle immagini per generare un'immagine impilata a 8 plex.
  2. Co-registra le immagini di ogni round come segue.
    1. Ogni immagine rotonda è denominata come segue: _ dove è il nome univoco della diapositiva (codice a barre) e è una stringa che, se ordinata alfabeticamente, metterà prima l'immagine del round 1, poi l'immagine del round 2. Ad esempio, per = 1234ABC, i file possono essere denominati 1234ABC_Round1 e 1234ABC_Round2, con tutti i file che hanno l'estensione appropriata (ad esempio, .czi) dello scanner. Metti tutte le immagini rotonde in un'unica cartella chiamata, ad esempio, Immagini sorgente.
    2. All'interno del software di co-registrazione, fare clic sul pulsante Imposta nella sezione della directory delle immagini sorgente dell'interfaccia utente e, quando richiesto, selezionare la cartella creata in precedenza.
    3. Imposta il tipo di file nella sezione Immagini sorgente sull'estensione delle immagini sorgente (ad esempio, .czi, .qptiff, ecc.). Il software visualizzerà ora le due immagini rotonde insieme in una tabella che mostra che la diapositiva 1234ABC ha 2 immagini rotonde.
    4. Se lo si desidera, impostare la posizione delle immagini impilate di output su una directory diversa da quella delle immagini sorgente utilizzando il pulsante Imposta nella sezione della directory delle immagini impilate dell'interfaccia utente e, quando richiesto, scegliere la cartella di output desiderata . In caso contrario, per impostazione predefinita verrà utilizzata la cartella delle immagini di origine.
    5. Per impostazione predefinita, viene creata solo una rappresentazione del file con estensione afi dello stack. Seleziona l'opzione per salvare un file OME.tif dell'intero stack nella sezione delle opzioni di elaborazione dell'interfaccia.
    6. Per convalidare l'accuratezza della co-registrazione sull'intero campione, selezionare l'opzione Convalida nella sezione di output dell'interfaccia.
    7. Premere il pulsante START per avviare la co-registrazione dell'immagine.

11. Analisi delle immagini

  1. Dopo che le diapositive sono state visualizzate, visualizzatele e analizzatele utilizzando qualsiasi metodo di analisi a vostra scelta, come la suite di elaborazione delle immagini STARVUE di Ultivue o QuPath15.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguendo il protocollo di cui sopra, il tessuto FFPE sarà colorato con bersagli multipli e sono state ottenute immagini di alta qualità di tutti i marcatori in gruppi di quattro (Figura 3A, B). Il software di co-registrazione delle immagini consentirà di combinare e co-registrare le immagini dello stesso vetrino, come mostrato nella Figura 3C. Risultati simili sono mostrati nella Figura 4 per un vetrino di tessuto per cancro del colon-retto (CRC).

Il successo del protocollo deve essere determinato valutando il modello di colorazione previsto. Nell'esempio di CRC mostrato, ciascuno dei bersagli colorati è espresso nel compartimento subcellulare atteso, ad esempio FoxP3 nucleare, CD3 membranoso, CD68 citoplasmatico (Figura 4B-D). Ciascuno dei bersagli funzionali è espresso sul tipo cellulare appropriato, come dimostrato dall'esempio della co-localizzazione di PD1 e CD3 o di PDL-1 e CD68, che mostrano rispettivamente cellule T esaurite e macrofagi immunosoppressivi. La valutazione di un buon rapporto segnale/sfondo, che consente di distinguere con successo il vero segnale positivo dal potenziale rumore di fondo, viene solitamente eseguita qualitativamente da patologi o esperti di analisi delle immagini che confermano la qualità della colorazione, consentendo un'analisi delle immagini di successo. Per confermare ulteriormente la qualità e le prestazioni della colorazione, è possibile aggiungere il confronto con il gold standard IHC (DAB cromogenico) su sezioni seriali (vedere l'esempio nella Figura 5), nonché un campione di tessuto di controllo positivo come la tonsilla umana che, per la maggior parte dei bersagli immunitari, può essere utile per confermare il successo della colorazione. Si noti che i tumori possono mostrare un'espressione inferiore dei bersagli rispetto alla tonsilla16 umana.

Dopo che i risultati sono stati confermati qualitativamente, è possibile eseguire un'analisi quantitativa. In questo lavoro, ciò consiste principalmente nel calcolare la densità cellulare di diversi fenotipi (numero di cellule/mm2) che esprimono un determinato bersaglio o bersagli, nonché nel calcolare i livelli medi di intensità di bersagli funzionali che possono mostrare un ampio intervallo dinamico di espressione. Nel valutare la precisione dei saggi mIF, le sezioni seriali colorate con gli stessi marcatori dovrebbero mostrare segnali comparabili tra i vetrini, come si può vedere qualitativamente nella Figura 6. Esempi di risultati quantitativi delle densità di singoli marcatori in diversi tipi di tessuto sono mostrati nella Figura 7. L'analisi delle immagini su queste immagini consente di identificare le cellule positive e di calcolare una corrispondente densità di cellule positive per ciascun marcatore, nonché l'intensità media del segnale per cella positiva. Ciò consente di calcolare un coefficiente di variabilità (CV) per ciascun marcatore per valutare la precisione del test di multiplexing (Tabella 4).

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Figura 3: Immagini di un nucleo di microarray tissutale (TMA) ottenute da cicli successivi di colorazione nel protocollo di immunofluorescenza a 8 plex. (A) Immagine ottenuta dal primo ciclo di imaging, con i marcatori CD8, PD1, PD-L1 e CD68. Dopo il protocollo di scambio, (B) mostra il secondo ciclo di imaging sullo stesso vetrino per il secondo ciclo di marcatori CD3, CD4, FoxP3 e CK/SOX10 e (C) mostra un'immagine co-registrata che combina le immagini (A) e (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Colorazione rappresentativa del tessuto del cancro del colon-retto (CRC) con colorazione in immunofluorescenza a 8 plex. La figura mostra i fenotipi cellulari che possono essere identificati co-localizzando più bersagli nella stessa cellula. (inizio) Immagine dell'intero vetrino del tessuto CRC. (in basso) Viste dettagliate delle regioni di evidenziazione tissutale (A) cellule T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) cellule che esprimono PD-1 e PD-L1 all'interno del tumore e dello stroma, (C) cellule T citotossiche esaurite (CD3+/CD8+/PD-1), (D) cellule tumorali che eludono il sistema immunitario (PD-L1+/CK+) e macrofagi immunosoppressivi (CD68+/PDL1+). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Confronto qualitativo tra l'immunoistochimica (IHC) e la colorazione in immunofluorescenza (IF). Sezioni seriali colorate con colorazione immunoistochimica a marcatore singolo (DAB, riga superiore), immunofluorescenza a marcatore singolo (ISP monoplex) e vista a canale singolo dell'immunofluorescenza multiplex (ISP multiplex) che dimostrano la concordanza qualitativa tra i diversi metodi di colorazione. Barre di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Colorazione della sezione seriale. (A) Diagramma che mostra il layout di un TMA multitessuto. (B) Immagini rappresentative a 8 plessi di nuclei di tessuto di ciascun tipo di tessuto nella TMA. (C) Immagini rappresentative di CD8 in un nucleo tonsillare attraverso sei sezioni seriali di TMA colorate in un'unica corsa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Quantificazione della densità di un singolo marcatore per tipo di tessuto inclusa nella TMA. Le densità per tessuto sono le densità medie tra tre nuclei rappresentativi di ciascun tipo di tessuto sul vetrino TMA. L'asse y rappresenta le densità dei singoli marcatori in diversi tipi di tessuto sull'asse x, in unità di cellule positive/mm2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Analisi della regione di interesse (ROI) del segnale fluorescente relativo confrontando l'mIF ISP amplificato descritto in questo protocollo con l'IF indiretto. (A) Vetrino rappresentativo colorato per CK (a sinistra) o PD-L1 (a destra) con cinque ROI indicati. (B) Immagini rappresentative del ROI per CK (in alto) e PD-L1 (in basso). Intensità media del segnale ottenuta con mIF amplificato (viola) e IF indiretto (blu) per (C) CK e (D) PD-L1 in cinque ROI, ciascuno dei quali misura 100 μm x 100 μm e contiene circa 200 celle. I valori dell'asse Y mostrano unità fluorescenti arbitrarie e le barre di errore mostrano le deviazioni standard (n=3). (E) L'intensità relativa del segnale ottenuta con l'IF ISP amplificato (viola) e l'IF indiretto (blu) è stata calcolata prendendo il rapporto tra il segnale mIF amplificato medio e il segnale IF indiretto medio in tutte le ROI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 4: Coefficiente di varianza (CV) calcolato. Il CV della densità cellulare positiva e l'intensità media del segnale per le immagini delle tonsille sono mostrati nella Figura 6. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

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Questo rapporto descrive un protocollo per la colorazione in immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento e ad alta sensibilità eseguita utilizzando un autostainer. Nell'esecuzione di questo protocollo, le fasi di preparazione dei reagenti sono fondamentali e meritano attenzione. È necessario assicurarsi che i reagenti siano miscelati in modo appropriato e dosati correttamente per ridurre al minimo la variabilità della colorazione tra vetrini diversi nella stessa seduta o tra vetrini diversi utilizzando gli stessi componenti.

I problemi comuni durante l'esecuzione di questo protocollo includono la mancata miscelazione corretta dei reagenti prima del caricamento e la potenziale perdita di tessuto a causa di una procedura di de-coverslipping impropria. Sebbene questo protocollo di colorazione sia applicabile a qualsiasi tipo di tessuto FFPE, compresi i tipi di cancro, alcuni tipi di tessuto possono richiedere una manipolazione più attenta (ad esempio, tessuti ad alto contenuto di grassi). Per evitare la perdita di tessuto, lasciare in ammollo i vetrini scivolati per un tempo sufficientemente lungo da consentire al vetrino coprioggetto di staccarsi da solo. Non forzare il vetrino coprioggetti a staccare o staccare il vetro.

Una limitazione è che, mentre molti dei bersagli più comunemente usati in immuno-oncologia sono convalidati e pronti per l'uso, alcuni bersagli possono richiedere lo sviluppo di saggi prima di essere inclusi in un pannello multiplex. Sebbene questo processo sia relativamente veloce, potrebbe richiedere alcune settimane in più prima di poter utilizzare un pannello multiplex personalizzato.

Esistono diverse differenze tra questo test e altre tecnologie di immunofluorescenza multiplex. Rispetto alle tecnologie basate sull'immunofluorescenza diretta e indiretta, il test qui dimostrato ha un livello di amplificazione significativamente più elevato, consentendo un miglioramento significativo del rapporto segnale/rumore, in particolare nei canali che tendono a mostrare l'autofluorescenza tissutale, come il canale FITC. Ciò si traduce in un segnale ~30 volte più forte rispetto all'immunofluorescenza diretta e ~10 volte più forte rispetto all'immunofluorescenza indiretta, come quantificato utilizzando l'analisi dell'intensità dell'intero vetrino e l'analisi manuale basata sul ROI (Figura 8). Questo metodo consente di rilevare proteine bersaglio molto più sensibili con tempi di esposizione sostanzialmente inferiori ed elimina la necessità di manipolare l'immagine, inclusa la sottrazione dello sfondo che corre il rischio di rimuovere i segnali a bassa intensità.

Rispetto ai saggi mIF basati sull'amplificazione catalizzata da enzimi, il test qui dimostrato ha una capacità significativamente migliorata di eseguire il multiplexing, oltre ad avere un flusso di lavoro più semplice e un tempo di esecuzione del saggio generalmente più breve (Figura 1). In questo test, gli anticorpi vengono sommati in un unico passaggio e amplificati simultaneamente, semplificando notevolmente il protocollo del test. Inoltre, alcune tecnologie basate su enzimi, come l'amplificazione del segnale della tiramide (TSA), possono mostrare interferenze tra diversi anticorpi, in quello che viene definito l'effetto ombrello 12,17,18. La tecnologia di amplificazione qui utilizzata evita questo problema, consentendo la rilevazione di più marcatori colocalizzati e co-espressi sulla stessa cellula, come si può vedere nella Figura 4.

Circa il 90% dei tumori umani origina da cellule epiteliali19. Questo perché spesso costituiscono la prima linea di difesa contro l'ambiente esterno e proliferano più velocemente, portando a un accumulo più rapido di mutazioni potenzialmente oncogene. Qui, l'infiammazione svolge un ruolo fondamentale nella tumorigenesi, nella progressione e nella disseminazione. Nell'ultimo decennio, molte terapie mirate agli inibitori del checkpoint immunitario e alle cellule immunitarie sono emerse come un potente arsenale contro molti tipi di tumore 5,20,21. Tuttavia, una parte significativa dei pazienti continua a non rispondere. È probabile che il microambiente tumorale (TME) e il paesaggio immunitario locale svolgano un ruolo critico. Profilando le firme molecolari del TME associate alla risposta differenziale ai farmaci in molti pazienti, potrebbe essere possibile definire meglio i biomarcatori terapeutici. Questo rapporto dimostra che la tecnologia mIF può essere utilizzata per profilare più biomarcatori proteici in parallelo, compresi i marcatori a bassa espressione, su centinaia di vetrini di campioni interi o microarray tumorali.

Dichiarazioni

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Gli autori K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. e A. Vasaturo sono dipendenti di Ultivue, che produce i kit di immunofluorescenza multiplex utilizzati in questo lavoro.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da Ultivue.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Clone Anti-CD3UltivueBC33 (BioCare). Parte del ULT50801 clone
anti-CD4UltivueSP35 (Abcam). Parte del ULT50801 clone
anti-CD68UltivueKP1 (BioCare). Parte del clone
Ultivueanti-CD8(BioCare). Parte dei cloni ULT50801
anti-citocheratina + anti-SOX10UltivueAE1/AE3 (Bethyl Labs) e BC34 (BioCare). Parte di ULT50801, fornito come miscela
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo). Fa parte del ULT50801 clone
anti-PD1UltivueCAL20 (Abcam). Parte del ULT50801
clone anti-PDL1Ultivue73-10 (Abcam). Parte del ULT50801
microscopio Axioscan.Z1Zeisschiamato microscopio a fluorescenza nel testo
Soluzione di decera per bondLeicaAR9222
Soluzione per il recupero dell'epitopo di Bond 2LeicaAR9640
rilevamento della ricerca
Inserti per titolazione Bond KitLeicaOPT9049
Bond Universal CovertilesLeicaS21.4611
Bond Wash Solution 10x ConcentratoLeicaAR9590
Autostainer BondRXLeicachiamato "autostainer" nel testo
Software BondRXLeicaversione 6.0 o successiva
Vetrini coprioggetti, spessore #1,5Corning2980-244
Etanolo, 200 proofVWR89370-084
FFPE blocchi di tessutoBioIVTI tipi di tessuto variano
Saggio OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-citocheratina/SOX10)UltivueULT50801contiene tutti gli altri componenti Ultivue
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7,4 con 2,7 mM KCl e 137 mM NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144chiamato "mezzo di montaggio" nel testo
UltiAnalyzer.AIUltivue
UltiStacker.AIUltivue Ultivue
Ampliation BufferUltivueparte del
anticorpale UltivueULT50801 parte di ULT50801
tampone di scambio UltivueUltivueparte dell ULT50801
iniziatore di scambio Ultivuepartedel ULT50801
neutralizzatore di scambio Ultivueparte di ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 1Ultivueparte di ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 2Ultivueparte di ULT50801
Ultivue Pre-Amplification MixUltivueparte di ULT50801
Ultivue Probe BufferUltivueparte di ULT50801
Acqua ultrapuraSigma-AldrichW4502
C8/144B ULT50801 contenitori aperti Bond, kit di Leica OP309700 Bond da 30 mL Leica DS9455 di titolazione Bond Leica OPT9719 diluente

Riferimenti

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