Fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo economico per purificare, espandere e caratterizzare cellule staminali mesenchimali (BMSC) altamente omogenee del midollo osseo dai topi. Questo approccio facilita l'acquisizione di grandi quantità di BMSC con un elevato potenziale di proliferazione e differenziazione, supportando i modelli murini e facendo progredire la ricerca preclinica.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una popolazione di cellule staminali che possono autorinnovarsi e differenziarsi in più linee cellulari. Tra queste, le MSC presenti nel midollo osseo, note come cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC), svolgono un ruolo cruciale nell'osteogenesi, nel supporto ematopoietico, nell'homing/migrazione e nell'immunosoppressione. Le BMSC sono ampiamente utilizzate nella biologia cellulare e nella ricerca sull'ingegneria tissutale grazie al loro potenziale per le strategie terapeutiche cellulari, nonché alla loro facile disponibilità, stabilità genetica e bassa immunogenicità. Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) e le BMSC coesistono nel midollo osseo ma hanno cellule progenitrici distinte. Quando si estraggono cellule dal midollo osseo, in genere si ottengono più tipi di cellule, il che può portare a eterogeneità nella popolazione cellulare, causando potenzialmente distorsioni e non soddisfacendo elevati standard sperimentali. Pertanto, è fondamentale sviluppare tecniche efficaci per migliorare l'omogeneità e la resa delle BMSC in vitro. Questo studio presenta un protocollo dettagliato per la purificazione, l'espansione e la fenotipizzazione basata sulla citometria a flusso di BMSC ottenute da topi BALB/c. L'omogeneità e il fenotipo delle cellule staminali delle BMSC di terzo passaggio sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso, dimostrando positività per CD29, CD44 e Sca-1, negatività per CD45 e CD31 e confermando la loro capacità di differenziazione osteogenica e adipogenica. Questo protocollo economico fornisce un metodo semplice ed efficiente per ottenere un numero sufficiente di BMSC omogenei con un elevato potenziale di proliferazione e differenziazione, essenziale per far progredire la ricerca su modelli murini e studi preclinici approfonditi.

Introduction

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono note per le loro caratteristiche multipotenti e sono ampiamente utilizzate nel trattamento di varie malattie grazie alle loro proprietà autorinnovabili, differenzianti e immunomodulanti ^1,2. Le BMSC sono facilmente ottenibili, sono in grado di espandersi ampiamente, presentano proprietà immunosoppressive e non innescano reazioni immunitarie immediate³, il che le rende interessanti per applicazioni di ingegneria tissutale e vettori efficaci per la terapia cellulare.

Nel midollo osseo, due principali popolazioni di cellule staminali e le loro progenie, le cellule staminali ematopoietiche e le BMSC, sono i residenti primari⁴. Tradizionalmente, le BMSC sono ottenute attraverso l'aspirazione mirata del midollo osseo e identificate come cellule plastico-aderenti in vitro. Tuttavia, questo metodo non è sufficiente per differenziare le BMSC da altre sottopopolazioni del midollo osseo, tra cui cellule endoteliali, periciti, leucociti e cellule staminali ematopoietiche⁵. Pertanto, è necessario un protocollo semplice ed efficace per l'isolamento delle BMSC.

Il lavoro attuale descrive in dettaglio la separazione e la purificazione delle BMSC attraverso la loro aderenza fisica alle piastre di coltura cellulare in plastica. Gli esperimenti di citometria a flusso sono stati condotti su BMSC di terzo passaggio utilizzando i marcatori di superficie CD29, CD44 e Sca-1, come delineato dal comitato 6 della Società Internazionale per la Terapia Cellulare e Genica (ISCT) delle Cellule Stromali Mesenchimali⁽MSC). Secondo i criteri ISCT, le MSC di topo sono caratterizzate da positività per CD29, CD44 e antigene delle cellule staminali 1 (Sca-1) e negatività per il marcatore delle cellule ematopoietiche CD45 e il marcatore delle cellule endoteliali CD31. Inoltre, le BMSC dovrebbero essere multipotenti, dimostrando la differenziazione trilineare in osteoblasti, condrociti e adipociti. In questo esperimento, l'osteogenesi è stata indotta nelle BMSC estratte, con la colorazione ALP eseguita il giorno 7 e un test S rosso alizarina il giorno 21 per valutare la differenziazione. È stata anche indotta la differenziazione adipogenica di BMSC isolate e purificate, con colorazione Oil Red O eseguita il giorno 21 per valutare l'adipogenesi.

Protocol

La manipolazione degli animali è stata approvata in conformità con le linee guida per l'etica degli animali da laboratorio (approvazione etica n.: PZSHUTCM2211070009) dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina BALB/c di otto settimane (grado SPF, 20 ± 1 g di peso corporeo). Questo protocollo delinea la purificazione, il passaggio, la fenotipizzazione basata sulla citometria a flusso e la differenziazione osteogenica e adipogenica delle BMSC derivate dal topo. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Manipolazione degli animali

1. Topi domestici in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) in gabbie ventilate individualmente, con cinque topi per gabbia. Fornire mangime di qualità SPF e acqua sterile. Mantenere un ciclo luce/buio di 12 ore.
   NOTA: Questo metodo è stato testato ed è risultato fattibile sia nei ceppi di topi BALB/c che C57BL/6. Questo articolo utilizza principalmente BALB/c come esempio.

2. Prelievo di femori e tibie dagli arti posteriori del topo

1. Eutanasia degli animali tramite asfissia da CO₂ seguita da lussazione cervicale⁷ seguendo le linee guida etiche.
2. Immergere i topi in etanolo al 75% per 5 minuti (Figura 1A).
   NOTA: Le cellule staminali sono state raccolte entro 30 minuti² dopo l'eutanasia e l'intero processo, compreso il lavaggio del midollo, la filtrazione e la semina nelle piastre di coltura, è stato completato entro 2 ore per garantire una vitalità cellulare ottimale.
   NOTA: Utilizzare topi adulti (≥8 settimane) per una resa BMSC ottimale; I topi di 8-12 settimane sono ideali⁸.
3. Praticare un'incisione di circa 1 cm all'arto posteriore del tendine d'Achille con forbici sterili da dissezione (Figura 1B).
4. Praticare un'incisione circolare attorno all'arto posteriore del tendine d'Achille con forbici sterili per esporre la tibia distale (Figura 1C).
5. Staccare la pelle dall'incisione verso l'anca per rimuoverla da entrambi gli arti posteriori (Figura 1D).
6. Tagliare lungo l'osso iliaco per separare la testa del femore dall'osso dell'anca (Figura 2A).
   NOTA: Evitare di danneggiare le articolazioni bilaterali del femore durante la dissezione per prevenire la perdita di midollo osseo.
7. Posizionare i femori e le tibie raccolti in un piatto da 60 mm contenente PBS sterile pre-freddo contenente il 2% di penicillina/streptomicina (Figura 2B).
8. Tagliare il più possibile i tendini e i muscoli dalla tibia e dal perone utilizzando un bisturi sterile per facilitare il successivo lavaggio (Figura 2C).
9. Riportare le ossa lavorate in PBS contenente il 2% di penicillina/streptomicina e trasferirle nella cappa sterile per le successive fasi di isolamento.

3. Purificazione e coltura di BMSC murini

1. Preparare un terreno completo di modificazione alfa MEM (αMEM) per la coltura BMSC integrando αMEM con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina.
   NOTA: Scegliere il terreno αMEM poiché contiene 1000 mg/L di glucosio, che è una concentrazione relativamente bassa. Questo aiuta a prevenire l'inibizione della proliferazione cellulare che può verificarsi in ambienti ad alto contenuto di glucosio⁹
2. Prendi una siringa da 50 ml e inserisci l'ago fornito con la siringa.
3. Aspirare 20 mL di terreno αMEM nella siringa da 50 mL, quindi sostituire l'ago con quello fornito con la siringa da 1 mL.
   NOTA: Utilizzare un ago per siringa da 1 ml per adattarsi alle dimensioni dell'osso e ridurre al minimo il danno cellulare. Una siringa da 50 ml consente un lavaggio efficiente del midollo osseo con un rischio ridotto di contaminazione cellulare dovuta a inserimenti ripetuti.
4. Usa le forbici per tagliare entrambe le estremità del femore o della tibia separati in un cappuccio sterile.
5. Inserire l'ago nell'osso lungo il bordo tagliato e lavare il midollo osseo in una piastra di coltura da 100 mm contenente un terreno αMEM completo (Figura 2D).
6. Sciacquare ripetutamente le cavità ossee fino a quando i pezzi ossei appaiono pallidi per assicurarsi che la maggior parte del midollo osseo sia stata estratta (Figura 2E).
7. Pipettare delicatamente su e giù 40 volte con un puntale per pipetta per disperdere il più possibile le cellule aggregate.
8. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da centrifuga da 50 ml per rimuovere detriti, frammenti di tessuto e grumi non dispersi.
9. Trasferire la sospensione cellulare filtrata in una piastra per coltura cellulare da 100 mm e aggiungere un terreno αMEM completo fino a un volume finale di 15 mL per piastra.
   NOTA: Colture di tutte le cellule del midollo osseo raccolte dai femori e dalle tibie di ciascun topo in un piatto di coltura da 100 mm per facilitare la crescita cellulare. Sulla base di esperimenti precedenti, circa 1 × 10⁷ BMC può essere isolato da un topo di 8 settimane (da due femori e due tibie). Queste cellule vengono seminate in una piastra di coltura da 100 mm a una densità di 1,8 × 10⁵ cellule/cm² per la coltura primaria.
10. Tenere il piatto con entrambe le mani e farlo roteare delicatamente con un movimento a forma di otto 15 volte per garantire una distribuzione uniforme delle cellule sul piatto.
11. Porre la piastra di coltura a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ e fermentare per 5 giorni (Figura 3A).
    NOTA: Evitare di spostare la piastra di coltura durante questo periodo per garantire una crescita cellulare uniforme.

4. Sostituzione del terreno αMEM per la coltura BMSC

1. Osservare le cellule al microscopio per determinare se hanno raggiunto l'80% di confluenza. In caso contrario, procedere con la sostituzione del mezzo il 5^° giorno.
2. Prelevare 3 mL di PBS con una pipetta Pasteur sterile ed erogarla da un'altezza di 1 cm sopra la piastra di coltura in diverse posizioni.
   NOTA: Evitare di erogare liquido su un lato del piatto, poiché ciò potrebbe rimuovere le cellule aderenti a causa di un'eccessiva forza d'impatto e impedire l'efficace rimozione delle cellule indesiderate.
3. Dopo aver aggiunto 3 mL di PBS, agitare delicatamente la piastra di coltura per lavare accuratamente le cellule e rimuovere la PBS dalla piastra con una pipetta. Ripetere ancora una volta il processo di lavaggio per assicurarsi che le celle siano lavate accuratamente.
4. Prelevare 15 mL di terreno αMEM completo con una pipetta Pasteur sterile ed erogarlo da 1 cm sopra la piastra di coltura in diverse posizioni.
5. Rimettere la piastra di coltura nell'incubatore e monitorare fino a quando le cellule non raggiungono l'80% di confluenza prima di subcolturare (Figura 3B).

5. Passaggio delle BMSC

1. Lavare due volte l'80% delle cellule confluenti con PBS (Figura 3C).
   NOTA: Il lavaggio delle cellule con PBS prima della digestione aiuta a rimuovere il terreno residuo e le secrezioni cellulari e riduce l'adesione delle MSC al piatto di coltura.
2. Digerire le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% incubandole a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 2-3 minuti.
3. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di terreno αMEM completo alla sospensione cellulare.
4. Aspirare la sospensione cellulare dalla piastra di coltura utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml e sciacquare delicatamente il fondo della piastra per staccare tutte le cellule aderenti.
5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Utilizzare una pipetta per scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno αMEM completo.
   NOTA: Per la subcoltura, una densità di semina di circa 4 × 10⁴ cellule/cm² è risultata ottimale per la crescita e la proliferazione continue.
7. Dividere le cellule in un rapporto 1:1-1:2 in nuove piastre di coltura cellulare da 100 mm (questo costituisce il 1^° passaggio, P1) (Figura 3D).
8. Dividere le celle circa ogni tre giorni con un rapporto 1:1,5 quando raggiungono l'80% di confluenza per generare il secondo passaggio (P2) (Figura 3E) e il terzo passaggio (P3) (Figura 3F) delle BMSC.

6. Preparazione di BMSC P3 per l'identificazione fenotipica e il differenziamento osteogenico

1. Scartare il terreno di coltura cellulare.
2. Lavare due volte le BMSC P3 con 3 ml di PBS.
3. Digerire le BMSC P3 con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% incubando a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 2-3 minuti quando raggiungono l'80% di confluenza.
4. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di terreno αMEM completo alla sospensione cellulare.
5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL, centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
   NOTA: I pellet P3 BMSC qui preparati saranno utilizzati per l'identificazione fenotipica tramite citometria a flusso e per valutare la differenziazione osteogenica o adipogenica.

7. Identificazione fenotipica di BMSC mediante citometro a flusso

1. Risospendere i pellet cellulari di BMSC P3 con 1,5 mL di soluzione PBS contenente il 2% di FBS e regolare la concentrazione a 5 × 10⁶ cellule/mL.
2. Aliquotare 100 μl della sospensione cellulare in ciascuna delle 11 provette per ottenere 5 × 10⁵ cellule per provetta. Preparare i seguenti gruppi: etichetta in bianco, controllo dell'isotipo CD29, CD29, controllo dell'isotipo CD44, CD44, controllo dell'isotipo Sca-1, Sca-1, controllo dell'isotipo Sca-1, controllo dell'isotipo CD31, CD31, controllo dell'isotipo CD45 e CD45.
   NOTA: Nel presente studio sono stati utilizzati i seguenti fluorocromi: CD29-FITC, CD29 isotipo-FITC, CD44-APC, CD44 isotipo-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotipo-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotipo-PerCPcy5.5, CD31-PE e CD31 isotipo-PE (come mostrato nella tabella dei materiali). Questi fluorocromi possono essere modificati in base alle configurazioni di diversi citometri a flusso.
3. Per ciascun gruppo, aggiungere i seguenti reagenti: 2 μl di PBS al gruppo bianco dell'etichetta, 2 μl dell'isotipo CD29 al gruppo di controllo dell'isotipo CD29 (diluizione 1:50), 2 μl di CD29 al gruppo CD29 (diluizione 1:50), 0,5 μl dell'isotipo CD44 al gruppo di controllo dell'isotipo CD44 (diluizione 1:200), 0,5 μl di CD44 al gruppo CD44 (diluizione 1:200), 0,5 μl di isotipo Sca-1 al gruppo di controllo dell'isotipo Sca-1 (diluizione 1:200), 0,5 μl di Sca-1 al gruppo Sca-1 (diluizione 1:200), 2 μl di isotipo CD31 al gruppo di controllo dell'isotipo CD31 (diluizione 1:50), 2 μl di CD31 al gruppo CD31 (diluizione 1:50), 2 μl di isotipo CD45 al gruppo di controllo dell'isotipo CD45 (diluizione 1:50), e 2 μL di CD45 al gruppo CD45 (diluizione 1:50).
   NOTA: Gli anticorpi sono stati utilizzati secondo le raccomandazioni ottimizzate del produttore per la citometria a flusso. Gli esperimenti preliminari hanno confermato la colorazione e la specificità ottimali per le cellule bersaglio. Fare riferimento alle linee guida sul dosaggio del produttore ed eseguire i test preliminari del titolo, se necessario.
4. Mescolare delicatamente, centrifugare con una centrifuga di palma e incubare al buio per 30 minuti a 4 °C.
5. Aggiungere 900 μl di PBS a ciascuna provetta, mescolare capovolgendo e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante per rimuovere gli anticorpi in eccesso.
6. Risospendere il pellet cellulare in ciascuna provetta con 300 μL di PBS e analizzare utilizzando un citometro a flusso.
   NOTA: Non è necessario fissare le cellule con formaldeide neutra al 2,5% se il test del citometro a flusso può essere completato entro 1-2 ore. Se l'analisi non può essere eseguita entro 1-2 ore, fissare le cellule con formalina tamponata neutra al 2,5% (preparata miscelando formalina tamponata neutra al 10% con PBS in rapporto 1:3) e conservarle a 4 °C al buio per una notte per il successivo test del citometro a flusso.
7. Regolare la tensione del citometro a flusso utilizzando il gruppo vuoto dell'etichetta per assicurarsi che l'autofluorescenza cellulare sia compresa tra circa 1/4-1/3 dell'asse delle coordinate. Caricare in sequenza le cellule dei gruppi CD29, CD29, CD44, CD44, Sca-1, Sca-1, Sca-1, CD31, CD31, CD45 e CD45. Impostare il gate P1 (come definito nel grafico FSC/SSC) per acquisire 10.000 celle, in esecuzione a velocità media.
   NOTA: Assicurarsi che il citometro a flusso sia dotato dei canali appropriati, come quelli comunemente usati negli esperimenti: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 e APC o altri canali che corrispondono alle fluoresceine accoppiate ad anticorpi.

8. Differenziamento osteogenico delle BMSC

1. Risospendere i pellet P3 BMSC in un terreno αMEM completo, regolando la concentrazione a 1 × 10⁵ cellule/mL.
2. Seminare le BMSC P3 in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti aggiungendo 1 mL di terreno αMEM completo contenente 1 × 10⁵ cellule a ciascun pozzetto.
3. Coltivare le BMSC P3 a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 3-5 giorni fino a raggiungere una confluenza superiore al 90%. Sostituire l'intero terreno αMEM con un terreno fresco ogni 2 giorni.
4. Dividere equamente i diversi pozzetti in due gruppi: il gruppo di controllo negativo (senza induzione della differenziazione osteogenica) e il gruppo di differenziazione osteogenica
5. Preparare il terreno di induzione della differenziazione osteogenica integrando il terreno αMEM completo con 10 mmol/L di β-glicerofosfato, 50 mg/L di acido L-ascorbico e ^10-8 mol/L di desametasone.
6. Eliminare il terreno di coltura cellulare e lavare le BMSC P3 con 1 mL di PBS.
7. Aggiungere il terreno di induzione della differenziazione osteogenica ai pozzetti del gruppo di differenziazione osteogenica per l'induzione della differenziazione osteogenica (1 mL/pozzetto).
8. Aggiungere il terreno αMEM completo ai pozzetti del gruppo di controllo (1 mL/pozzetto).
9. Coltura delle BMSC P3 a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 7 o 21 giorni, sostituendo il terreno di induzione della differenziazione osteogenica o il terreno αMEM completo con lo stesso terreno fresco ogni 3 giorni.
   NOTA: Le cellule con induzione di 7 giorni vengono utilizzate per la colorazione con fosfatasi alcalina (ALP). Le cellule con un'induzione di 21 giorni vengono utilizzate per il saggio del rosso S di alizarina.

9. Identificazione di cellule osteogeniche differenziate con colorazione ALP

1. Lavare una volta le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 1 mL di PBS.
2. Fissare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di formalina tamponata al 10% e incubando per 20 minuti.
3. Lavare nuovamente le cellule in ogni pozzetto con 1 mL di PBS una volta.
4. Aggiungere 0,5 mL di reagente colorante con fosfatasi alcalina 1-Step NBT/BCIP a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 30 minuti con un foglio di alluminio per proteggere il medicinale dalla luce.
5. Scartare la soluzione, lavare una volta le cellule in ogni pozzetto con 1 ml di acqua distillata e lasciare asciugare la piastra.
6. Osservare e acquisire immagini di colonie colorate utilizzando una fotocamera per identificare le cellule ALP-positive con precipitato nero-violaceo.
   NOTA: Il reagente di colorazione con fosfatasi alcalina (ALP) 1-Step NBT/BCIP produce un precipitato nero-viola forte e insolubile dopo la reazione con l'ALP, che può essere facilmente visualizzato.

10. Identificazione di cellule osteogeniche differenziate mediante saggio del rosso S di alizarina

1. Lavare una volta le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 1 mL di PBS.
2. Fissare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di formalina tamponata al 10% e incubando per 20 minuti.
3. Lavare una volta le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 1 mL di PBS.
4. Aggiungere 0,5 mL di rosso alizarina allo 0,1% S in Tris-HCl 0,1 mol/L (pH 8,3) in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 30-60 minuti.
5. Scartare la soluzione, lavare una volta le cellule in ogni pozzetto con 1 ml di acqua distillata e lasciare asciugare la piastra.
6. Osservare e acquisire immagini di colonie colorate utilizzando una fotocamera per identificare le cellule S-positive rosse di alizarina.
   NOTA: Il test S rosso alizarina per la differenziazione delle MSC in cellule ossee mineralizzate mature provoca la formazione di un complesso S-calcio rosso alizarina, che produce una colorazione rosso vivo che può essere osservata visivamente.

11. Preparazione del terreno di differenziazione adipogenico per induzione adipogenica A per BMSC

NOTA: Per la differenziazione adipocitaria delle BMSC, viene spesso utilizzato un kit di differenziazione adipogenica con cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di topo (vedi Tabella dei materiali) secondo le linee guida.

1. Mettere il siero fetale bovino (un componente del kit, denominato siero) in frigorifero a 4 °C per almeno 6 ore prima di scongelarlo completamente.
2. Riporre l'Integratore A-I (componente del Kit) in frigorifero a 4°C almeno 30 minuti prima della preparazione; posizionare l'integratore A-II (componente del kit) a temperatura ambiente fino a completo scongelamento.
3. Capovolgere o picchiettare delicatamente la provetta del reagente per miscelare il contenuto.
4. Centrifugare la provetta del reagente Supplement A-II a 300 × g per 30 s a temperatura ambiente per assicurarsi che il reagente si raccolga sul fondo per un facile recupero.
5. Pulire accuratamente l'imballaggio esterno di tutti i componenti con alcol medico al 75% e aprirli in una cabina di biosicurezza.
6. Aggiungi il siero, l'integratore A-I e l'integratore A-II nel mezzo.
   NOTA: Per garantire una corretta dissoluzione, preriscaldare il terreno basale (un componente del kit) a 37 °C, altrimenti l'integratore A-II potrebbe precipitare a causa dell'esposizione al freddo.
7. Utilizzare una piccola quantità di Basal Medium per sciacquare ogni bottiglia e tubo, assicurandosi di trasferire tutti i componenti nel Basal Medium.
8. Chiudere il tappo del flacone Basal Medium e agitare delicatamente per mescolare accuratamente.
9. Sigillare la bottiglia con pellicola di paraffina, avvolgerla in un foglio di alluminio ed etichettarla con il nome, la data di preparazione e altri dettagli.

12. Preparazione del terreno di differenziazione ad induzione adipogenica B per BMSC

1. Mettere il siero fetale bovino in frigorifero a 4 °C per almeno 6 ore prima di scongelarlo completamente.
2. Porre l'Integratore B (componente del Kit) in frigorifero a 4 °C fino al completo scongelamento per almeno 30 minuti prima della preparazione.
3. Capovolgere o picchiettare delicatamente la provetta del reagente per miscelare il contenuto.
4. Centrifugare la provetta dell'integratore B per concentrare il reagente sul fondo per una raccolta più facile.
5. Pulire accuratamente l'imballaggio esterno di tutti i componenti con alcol medico al 75% e aprirli in una cabina di biosicurezza.
6. Aggiungere il siero e l'integratore B nel terreno basale.
7. Utilizzare una piccola porzione di Basal Medium per lavare ogni bottiglia e tubo, assicurandosi che tutti i componenti siano completamente trasferiti al terreno.
8. Chiudere il tappo del flacone Basal Medium e agitare delicatamente per mescolare accuratamente.
9. Sigilla la bottiglia con parafilm, avvolgila in un foglio di alluminio ed etichettala con il nome, la data di preparazione e altri dettagli.

13. Differenziamento adipocitario delle BMSC

1. Aggiungere 1 ml di gelatina allo 0,1% in una piastra a sei pozzetti, agitandola per ricoprire uniformemente il fondo di ogni pozzetto.
2. Posizionare la piastra a sei pozzetti rivestita con gelatina allo 0,1% in una cappa sterile o in un incubatore di CO₂ per almeno 30 minuti.
3. Aspirare la gelatina e la piastra è pronta per la semina cellulare, oppure attendere che i pozzetti si asciughino prima di seminare dopo 30 minuti.
4. Seminare le BMSC P3 a una densità di 4 × 10⁴ cellule/cm² in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti, aggiungendo 2 mL di terreno completo a ciascun pozzetto.
5. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore a CO₂ con il 5% di CO₂ e umidità satura.
6. Aspirare con attenzione il terreno e aggiungere 2 mL di terreno di induzione della differenziazione adipogenica A a ciascun pozzetto quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza.
7. Aspirare il terreno A dai pozzetti dopo 3 giorni dall'induzione e aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione adipogenico B.
8. Aspirare il terreno B dopo 1 giorno e tornare al mezzo A per un'ulteriore induzione.
9. Alternare tra il terreno A e B e osservare le cellule ogni giorno. Se la contrazione o la morte cellulare si verifica durante l'induzione con il terreno A, passare prontamente al mezzo B.
10. Ripetere il processo di induzione e mantenimento fino a quando non appare un numero sufficiente di goccioline lipidiche di dimensioni adeguate, quindi prepararsi per la colorazione.

14. Colorazione Olio Rosso O (ORO)

NOTA: Eseguire tutte le procedure il più delicatamente possibile per evitare il distacco delle goccioline lipidiche.

1. Aspirare il mezzo di differenziazione per induzione adipogenica dalla piastra a 6 pozzetti dopo aver completato la differenziazione per induzione adipogenica e lavare delicatamente con 1×PBS 2-3 volte.
2. Aggiungere 2 mL di formalina tamponata neutra al 10% per pozzetto e fissare per 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Preparare la soluzione di lavoro di Oil Red O mescolando il brodo Oil Red O con acqua distillata in un rapporto 3:2. Dopo la miscelazione, centrifugare a 250 × g per 4 minuti e utilizzare il surnatante.
4. Aspirare il fissativo e lavare delicatamente con PBS 2-3 volte, assicurandosi di rimuovere completamente il fissativo.
5. Aggiungere 0,8 ml di soluzione di colorante rosso O in ogni pozzetto, lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti.
6. Aspirare la soluzione colorante, lavare due volte con 1 mL di etanolo al 75%.
7. Aggiungere 1 mL di colorante di ematossilina in ciascun pozzetto per 2 minuti, quindi aspirare.
8. Aggiungere 2 mL di PBS a ciascun pozzetto e osservare i risultati della colorazione adipogenica al microscopio.
9. Sigillare la piastra a sei pozzetti colorata con parafilm e conservare a 4 °C.
   NOTA: Non conservare per più di 1 settimana. Le goccioline lipidiche possono fondersi, perdendo lo stato di colorazione.

Results

Le BMSC derivate dal topo sono state isolate e coltivate per circa 2 settimane per generare le BMSC del terzo passaggio (P3) (Figura 3). Come mostrato nella Figura 3A, le cellule appena estratte dal midollo osseo sono rimaste mononucleate con goccioline di grasso visibili. Le cellule a forma di fuso sono apparse nel piatto di coltura, raggiungendo una confluenza del 60%-80% il 5^° giorno di coltura (

Discussion

La terapia con cellule staminali ha suscitato un notevole interesse grazie al suo potenziale di rivoluzionare la medicina rigenerativa. Gli studi preclinici hanno fornito prove sostanziali a sostegno dell'applicazione clinica delle cellule staminali, in particolare delle BMSC¹³. Tuttavia, sfide come la bassa resa cellulare, la contaminazione e la crescita lenta hanno ostacolato la loro applicazione clinica. Pertanto, vi è un urgente bisogno di ricerca incentrata s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siringa da 1 ml (ago per siringa da 22 G)	GRUPPO GENTILE (KDL)	60017031
NBT/BCIP in 1 passaggio	Pierce Biotecnologia, Inc.	34042	Colorazione con fosfatasi alcalina
10% formalina tamponata neutra	Wexis	5200250	Fissazione cellulare
Piastra a 6 pozzetti	Selezione del laboratorio	11110	Coltura cellulare
Piastra a 24 pozzetti	Selezione del laboratorio	11310	Coltura cellulare
40 μ m Filtro cellulare	Cornig	352340	Filtrazione per la rimozione degli agglomerati
Siringa da 50 ml	GRUPPO GENTILE (KDL)	60017040
75% di etanolo	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	31009001	Disinfettare la pelle dei topi
Alizarina Rosso S	Sigma-Aldrich	Codice: A5533	Rilevamento di depositi di calcio e noduli calcificati
Anticorpo monoclonale APC CD44 (clone:IM7)	eBioscience	17-0441-82	Citometria a flusso
Controllo dell'isotipo APC Rat IgG2b kappa (clone:eB149/10H5)	eBioscience	17-4031-82	Citometria a flusso
Autoclave	Giappone Hiryama Azienda	HVE-50	Strumenti chirurgici per sterilizzazione
Incubatore CO2	Thermo Fisher Technology (Cina) Co., Ltd.	300583057	Coltura cellulare
Flussimetria Cytoflex	Beckman Coulter	A00-1-1102	Citometria a flusso
desametasone	Sigma-Aldrich	D4902	Differenziazione osteogenica delle BMSC
Piatto (100mm)	Corning	430167	Coltura cellulare
Piatto (60mm)	Corning	430166	Posizionamento del campione durante il trapianto
Batuffoli di cotone disinfettanti	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Disinfettare la pelle dei topi
Guanti sterili monouso	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd	YT21131	Funzionamento sterile
Dieta per roditori irradiati a doppio leone	Suzhou Shuangshi Sperimentale Tecnologia per l'Alimentazione Animale Co., Ltd.	GB 14924.3	Mangimi
Siero fetale bovino	Shanghai Biosun Sci& Fornitore verificato - Tech Co., Ltd.	BS-0002-500	Coltura cellulare
FITC Criceto Anti-Rat CD29 (clone:Ha2/5)	BD Bioscienze	555003	Citometria a flusso
FITC Criceto IgM, λ 1 Controllo isotipo (clone: G235-1)	BD Bioscienze	553960	Citometria a flusso
gelatina (0,1%)	OriCell	GLT-11301	migliorare la capacità di adesione delle cellule
IVC gabbia per topi	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Barriera per animali
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	Codice: A8960	Differenziazione osteogenica delle BMSC
Segna penna	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Contrassegnare le informazioni cellulari sulla capsula di Petri
Modifica MEM Alpha (1X)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	SH30265	Coltura cellulare
Kit di differenziazione adipogenica delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di topo	Ciageno	MUXMX-90031	Differenziazione adipogenica delle BMSC
Nikon Eclipse Ti2 Microscopio invertito Synstem	Giappone Nikon Corporatin	Ti2-U	Osserva le celle e scatta foto
Forbici oftalmiche	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Taglia la pelle
Pinzette oftalmiche	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Procurarsi del tessuto osseo di topo.
PIPETTA PASTEUR	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-XG-03M	Aspirare il terreno di coltura
PE Rat Anti-Mouse CD31 (clone: Ha2/5)	BD Bioscienze	553373	Citometria a flusso
PE Ratto IgG2a, κ Controllo isotipo (clone:R35-95)	BD Bioscienze	553930	Citometria a flusso
Anticorpo monoclonale PE-Cianina7 Ly-6A/E (Sca-1) (clone:D7)	eBioscience	25-5981-82	Citometria a flusso
PE-Cianina7 Rat IgG2a kappa Controllo dell'isotipo (clone: eBR2a)	eBioscience	25-4321-82	Citometria a flusso
Penicillina-Streptomicina	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	2585636	Coltura cellulare
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 (clone: Ha2/5)	BD Bioscienze	561869	Citometria a flusso
PerCP-Cy5.5 IgG2b di ratto, κ Controllo isotipo (clone:A95-1)	BD Bioscienze	550764	Citometria a flusso
Bisturi	Fabbrica di strumenti chirurgici oDispositivi medici di Shanghai? Gruppo?Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Isolare gli arti posteriori e il busto del topo e rimuovere i tessuti estranei dall'osso
Cappuccio sterile	Thermo Fisher Technology (Cina) Co., Ltd.	ECO0.9	Tavolo operatorio chirurgico
teli chirurgici sterili	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160900	Fornire un'area chirurgica sterile
Provetta (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotecnologia Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Conservare la soluzione cellulare filtrata
tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	digerire le cellule aderenti
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G5422	Differenziazione osteogenica delle BMSC