Il presente protocollo descrive un metodo economico per purificare, espandere e caratterizzare cellule staminali mesenchimali (BMSC) altamente omogenee del midollo osseo dai topi. Questo approccio facilita l'acquisizione di grandi quantità di BMSC con un elevato potenziale di proliferazione e differenziazione, supportando i modelli murini e facendo progredire la ricerca preclinica.
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Articolo metodologico
Fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una popolazione di cellule staminali che possono autorinnovarsi e differenziarsi in più linee cellulari. Tra queste, le MSC presenti nel midollo osseo, note come cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC), svolgono un ruolo cruciale nell'osteogenesi, nel supporto ematopoietico, nell'homing/migrazione e nell'immunosoppressione. Le BMSC sono ampiamente utilizzate nella biologia cellulare e nella ricerca sull'ingegneria tissutale grazie al loro potenziale per le strategie terapeutiche cellulari, nonché alla loro facile disponibilità, stabilità genetica e bassa immunogenicità. Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) e le BMSC coesistono nel midollo osseo ma hanno cellule progenitrici distinte. Quando si estraggono cellule dal midollo osseo, in genere si ottengono più tipi di cellule, il che può portare a eterogeneità nella popolazione cellulare, causando potenzialmente distorsioni e non soddisfacendo elevati standard sperimentali. Pertanto, è fondamentale sviluppare tecniche efficaci per migliorare l'omogeneità e la resa delle BMSC in vitro. Questo studio presenta un protocollo dettagliato per la purificazione, l'espansione e la fenotipizzazione basata sulla citometria a flusso di BMSC ottenute da topi BALB/c. L'omogeneità e il fenotipo delle cellule staminali delle BMSC di terzo passaggio sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso, dimostrando positività per CD29, CD44 e Sca-1, negatività per CD45 e CD31 e confermando la loro capacità di differenziazione osteogenica e adipogenica. Questo protocollo economico fornisce un metodo semplice ed efficiente per ottenere un numero sufficiente di BMSC omogenei con un elevato potenziale di proliferazione e differenziazione, essenziale per far progredire la ricerca su modelli murini e studi preclinici approfonditi.
Introduzione
Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono note per le loro caratteristiche multipotenti e sono ampiamente utilizzate nel trattamento di varie malattie grazie alle loro proprietà autorinnovabili, differenzianti e immunomodulanti 1,2. Le BMSC sono facilmente ottenibili, sono in grado di espandersi ampiamente, presentano proprietà immunosoppressive e non innescano reazioni immunitarie immediate3, il che le rende interessanti per applicazioni di ingegneria tissutale e vettori efficaci per la terapia cellulare.
Nel midollo osseo, due principali popolazioni di cellule staminali e le loro progenie, le cellule staminali ematopoietiche e le BMSC, sono i residenti primari4. Tradizionalmente, le BMSC sono ottenute attraverso l'aspirazione mirata del midollo osseo e identificate come cellule plastico-aderenti in vitro. Tuttavia, questo metodo non è sufficiente per differenziare le BMSC da altre sottopopolazioni del midollo osseo, tra cui cellule endoteliali, periciti, leucociti e cellule staminali ematopoietiche5. Pertanto, è necessario un protocollo semplice ed efficace per l'isolamento delle BMSC.
Il lavoro attuale descrive in dettaglio la separazione e la purificazione delle BMSC attraverso la loro aderenza fisica alle piastre di coltura cellulare in plastica. Gli esperimenti di citometria a flusso sono stati condotti su BMSC di terzo passaggio utilizzando i marcatori di superficie CD29, CD44 e Sca-1, come delineato dal comitato 6 della Società Internazionale per la Terapia Cellulare e Genica (ISCT) delle Cellule Stromali Mesenchimali(MSC). Secondo i criteri ISCT, le MSC di topo sono caratterizzate da positività per CD29, CD44 e antigene delle cellule staminali 1 (Sca-1) e negatività per il marcatore delle cellule ematopoietiche CD45 e il marcatore delle cellule endoteliali CD31. Inoltre, le BMSC dovrebbero essere multipotenti, dimostrando la differenziazione trilineare in osteoblasti, condrociti e adipociti. In questo esperimento, l'osteogenesi è stata indotta nelle BMSC estratte, con la colorazione ALP eseguita il giorno 7 e un test S rosso alizarina il giorno 21 per valutare la differenziazione. È stata anche indotta la differenziazione adipogenica di BMSC isolate e purificate, con colorazione Oil Red O eseguita il giorno 21 per valutare l'adipogenesi.
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Protocollo
La manipolazione degli animali è stata approvata in conformità con le linee guida per l'etica degli animali da laboratorio (approvazione etica n.: PZSHUTCM2211070009) dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina BALB/c di otto settimane (grado SPF, 20 ± 1 g di peso corporeo). Questo protocollo delinea la purificazione, il passaggio, la fenotipizzazione basata sulla citometria a flusso e la differenziazione osteogenica e adipogenica delle BMSC derivate dal topo. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Manipolazione degli animali
- Topi domestici in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) in gabbie ventilate individualmente, con cinque topi per gabbia. Fornire mangime di qualità SPF e acqua sterile. Mantenere un ciclo luce/buio di 12 ore.
NOTA: Questo metodo è stato testato ed è risultato fattibile sia nei ceppi di topi BALB/c che C57BL/6. Questo articolo utilizza principalmente BALB/c come esempio.
2. Prelievo di femori e tibie dagli arti posteriori del topo
- Eutanasia degli animali tramite asfissia da CO2 seguita da lussazione cervicale7 seguendo le linee guida etiche.
- Immergere i topi in etanolo al 75% per 5 minuti (Figura 1A).
NOTA: Le cellule staminali sono state raccolte entro 30 minuti2 dopo l'eutanasia e l'intero processo, compreso il lavaggio del midollo, la filtrazione e la semina nelle piastre di coltura, è stato completato entro 2 ore per garantire una vitalità cellulare ottimale.
NOTA: Utilizzare topi adulti (≥8 settimane) per una resa BMSC ottimale; I topi di 8-12 settimane sono ideali8. - Praticare un'incisione di circa 1 cm all'arto posteriore del tendine d'Achille con forbici sterili da dissezione (Figura 1B).
- Praticare un'incisione circolare attorno all'arto posteriore del tendine d'Achille con forbici sterili per esporre la tibia distale (Figura 1C).
- Staccare la pelle dall'incisione verso l'anca per rimuoverla da entrambi gli arti posteriori (Figura 1D).
- Tagliare lungo l'osso iliaco per separare la testa del femore dall'osso dell'anca (Figura 2A).
NOTA: Evitare di danneggiare le articolazioni bilaterali del femore durante la dissezione per prevenire la perdita di midollo osseo. - Posizionare i femori e le tibie raccolti in un piatto da 60 mm contenente PBS sterile pre-freddo contenente il 2% di penicillina/streptomicina (Figura 2B).
- Tagliare il più possibile i tendini e i muscoli dalla tibia e dal perone utilizzando un bisturi sterile per facilitare il successivo lavaggio (Figura 2C).
- Riportare le ossa lavorate in PBS contenente il 2% di penicillina/streptomicina e trasferirle nella cappa sterile per le successive fasi di isolamento.
3. Purificazione e coltura di BMSC murini
- Preparare un terreno completo di modificazione alfa MEM (αMEM) per la coltura BMSC integrando αMEM con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina.
NOTA: Scegliere il terreno αMEM poiché contiene 1000 mg/L di glucosio, che è una concentrazione relativamente bassa. Questo aiuta a prevenire l'inibizione della proliferazione cellulare che può verificarsi in ambienti ad alto contenuto di glucosio9 - Prendi una siringa da 50 ml e inserisci l'ago fornito con la siringa.
- Aspirare 20 mL di terreno αMEM nella siringa da 50 mL, quindi sostituire l'ago con quello fornito con la siringa da 1 mL.
NOTA: Utilizzare un ago per siringa da 1 ml per adattarsi alle dimensioni dell'osso e ridurre al minimo il danno cellulare. Una siringa da 50 ml consente un lavaggio efficiente del midollo osseo con un rischio ridotto di contaminazione cellulare dovuta a inserimenti ripetuti. - Usa le forbici per tagliare entrambe le estremità del femore o della tibia separati in un cappuccio sterile.
- Inserire l'ago nell'osso lungo il bordo tagliato e lavare il midollo osseo in una piastra di coltura da 100 mm contenente un terreno αMEM completo (Figura 2D).
- Sciacquare ripetutamente le cavità ossee fino a quando i pezzi ossei appaiono pallidi per assicurarsi che la maggior parte del midollo osseo sia stata estratta (Figura 2E).
- Pipettare delicatamente su e giù 40 volte con un puntale per pipetta per disperdere il più possibile le cellule aggregate.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da centrifuga da 50 ml per rimuovere detriti, frammenti di tessuto e grumi non dispersi.
- Trasferire la sospensione cellulare filtrata in una piastra per coltura cellulare da 100 mm e aggiungere un terreno αMEM completo fino a un volume finale di 15 mL per piastra.
NOTA: Colture di tutte le cellule del midollo osseo raccolte dai femori e dalle tibie di ciascun topo in un piatto di coltura da 100 mm per facilitare la crescita cellulare. Sulla base di esperimenti precedenti, circa 1 × 107 BMC può essere isolato da un topo di 8 settimane (da due femori e due tibie). Queste cellule vengono seminate in una piastra di coltura da 100 mm a una densità di 1,8 × 105 cellule/cm2 per la coltura primaria. - Tenere il piatto con entrambe le mani e farlo roteare delicatamente con un movimento a forma di otto 15 volte per garantire una distribuzione uniforme delle cellule sul piatto.
- Porre la piastra di coltura a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 e fermentare per 5 giorni (Figura 3A).
NOTA: Evitare di spostare la piastra di coltura durante questo periodo per garantire una crescita cellulare uniforme.
4. Sostituzione del terreno αMEM per la coltura BMSC
- Osservare le cellule al microscopio per determinare se hanno raggiunto l'80% di confluenza. In caso contrario, procedere con la sostituzione del mezzo il 5° giorno.
- Prelevare 3 mL di PBS con una pipetta Pasteur sterile ed erogarla da un'altezza di 1 cm sopra la piastra di coltura in diverse posizioni.
NOTA: Evitare di erogare liquido su un lato del piatto, poiché ciò potrebbe rimuovere le cellule aderenti a causa di un'eccessiva forza d'impatto e impedire l'efficace rimozione delle cellule indesiderate. - Dopo aver aggiunto 3 mL di PBS, agitare delicatamente la piastra di coltura per lavare accuratamente le cellule e rimuovere la PBS dalla piastra con una pipetta. Ripetere ancora una volta il processo di lavaggio per assicurarsi che le celle siano lavate accuratamente.
- Prelevare 15 mL di terreno αMEM completo con una pipetta Pasteur sterile ed erogarlo da 1 cm sopra la piastra di coltura in diverse posizioni.
- Rimettere la piastra di coltura nell'incubatore e monitorare fino a quando le cellule non raggiungono l'80% di confluenza prima di subcolturare (Figura 3B).
5. Passaggio delle BMSC
- Lavare due volte l'80% delle cellule confluenti con PBS (Figura 3C).
NOTA: Il lavaggio delle cellule con PBS prima della digestione aiuta a rimuovere il terreno residuo e le secrezioni cellulari e riduce l'adesione delle MSC al piatto di coltura. - Digerire le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% incubandole a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 2-3 minuti.
- Neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di terreno αMEM completo alla sospensione cellulare.
- Aspirare la sospensione cellulare dalla piastra di coltura utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml e sciacquare delicatamente il fondo della piastra per staccare tutte le cellule aderenti.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzare una pipetta per scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno αMEM completo.
NOTA: Per la subcoltura, una densità di semina di circa 4 × 104 cellule/cm2 è risultata ottimale per la crescita e la proliferazione continue. - Dividere le cellule in un rapporto 1:1-1:2 in nuove piastre di coltura cellulare da 100 mm (questo costituisce il 1° passaggio, P1) (Figura 3D).
- Dividere le celle circa ogni tre giorni con un rapporto 1:1,5 quando raggiungono l'80% di confluenza per generare il secondo passaggio (P2) (Figura 3E) e il terzo passaggio (P3) (Figura 3F) delle BMSC.
6. Preparazione di BMSC P3 per l'identificazione fenotipica e il differenziamento osteogenico
- Scartare il terreno di coltura cellulare.
- Lavare due volte le BMSC P3 con 3 ml di PBS.
- Digerire le BMSC P3 con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% incubando a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 2-3 minuti quando raggiungono l'80% di confluenza.
- Neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di terreno αMEM completo alla sospensione cellulare.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL, centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
NOTA: I pellet P3 BMSC qui preparati saranno utilizzati per l'identificazione fenotipica tramite citometria a flusso e per valutare la differenziazione osteogenica o adipogenica.
7. Identificazione fenotipica di BMSC mediante citometro a flusso
- Risospendere i pellet cellulari di BMSC P3 con 1,5 mL di soluzione PBS contenente il 2% di FBS e regolare la concentrazione a 5 × 106 cellule/mL.
- Aliquotare 100 μl della sospensione cellulare in ciascuna delle 11 provette per ottenere 5 × 105 cellule per provetta. Preparare i seguenti gruppi: etichetta in bianco, controllo dell'isotipo CD29, CD29, controllo dell'isotipo CD44, CD44, controllo dell'isotipo Sca-1, Sca-1, controllo dell'isotipo Sca-1, controllo dell'isotipo CD31, CD31, controllo dell'isotipo CD45 e CD45.
NOTA: Nel presente studio sono stati utilizzati i seguenti fluorocromi: CD29-FITC, CD29 isotipo-FITC, CD44-APC, CD44 isotipo-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotipo-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotipo-PerCPcy5.5, CD31-PE e CD31 isotipo-PE (come mostrato nella tabella dei materiali). Questi fluorocromi possono essere modificati in base alle configurazioni di diversi citometri a flusso. - Per ciascun gruppo, aggiungere i seguenti reagenti: 2 μl di PBS al gruppo bianco dell'etichetta, 2 μl dell'isotipo CD29 al gruppo di controllo dell'isotipo CD29 (diluizione 1:50), 2 μl di CD29 al gruppo CD29 (diluizione 1:50), 0,5 μl dell'isotipo CD44 al gruppo di controllo dell'isotipo CD44 (diluizione 1:200), 0,5 μl di CD44 al gruppo CD44 (diluizione 1:200), 0,5 μl di isotipo Sca-1 al gruppo di controllo dell'isotipo Sca-1 (diluizione 1:200), 0,5 μl di Sca-1 al gruppo Sca-1 (diluizione 1:200), 2 μl di isotipo CD31 al gruppo di controllo dell'isotipo CD31 (diluizione 1:50), 2 μl di CD31 al gruppo CD31 (diluizione 1:50), 2 μl di isotipo CD45 al gruppo di controllo dell'isotipo CD45 (diluizione 1:50), e 2 μL di CD45 al gruppo CD45 (diluizione 1:50).
NOTA: Gli anticorpi sono stati utilizzati secondo le raccomandazioni ottimizzate del produttore per la citometria a flusso. Gli esperimenti preliminari hanno confermato la colorazione e la specificità ottimali per le cellule bersaglio. Fare riferimento alle linee guida sul dosaggio del produttore ed eseguire i test preliminari del titolo, se necessario. - Mescolare delicatamente, centrifugare con una centrifuga di palma e incubare al buio per 30 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 900 μl di PBS a ciascuna provetta, mescolare capovolgendo e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante per rimuovere gli anticorpi in eccesso.
- Risospendere il pellet cellulare in ciascuna provetta con 300 μL di PBS e analizzare utilizzando un citometro a flusso.
NOTA: Non è necessario fissare le cellule con formaldeide neutra al 2,5% se il test del citometro a flusso può essere completato entro 1-2 ore. Se l'analisi non può essere eseguita entro 1-2 ore, fissare le cellule con formalina tamponata neutra al 2,5% (preparata miscelando formalina tamponata neutra al 10% con PBS in rapporto 1:3) e conservarle a 4 °C al buio per una notte per il successivo test del citometro a flusso. - Regolare la tensione del citometro a flusso utilizzando il gruppo vuoto dell'etichetta per assicurarsi che l'autofluorescenza cellulare sia compresa tra circa 1/4-1/3 dell'asse delle coordinate. Caricare in sequenza le cellule dei gruppi CD29, CD29, CD44, CD44, Sca-1, Sca-1, Sca-1, CD31, CD31, CD45 e CD45. Impostare il gate P1 (come definito nel grafico FSC/SSC) per acquisire 10.000 celle, in esecuzione a velocità media.
NOTA: Assicurarsi che il citometro a flusso sia dotato dei canali appropriati, come quelli comunemente usati negli esperimenti: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 e APC o altri canali che corrispondono alle fluoresceine accoppiate ad anticorpi.
8. Differenziamento osteogenico delle BMSC
- Risospendere i pellet P3 BMSC in un terreno αMEM completo, regolando la concentrazione a 1 × 105 cellule/mL.
- Seminare le BMSC P3 in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti aggiungendo 1 mL di terreno αMEM completo contenente 1 × 105 cellule a ciascun pozzetto.
- Coltivare le BMSC P3 a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 3-5 giorni fino a raggiungere una confluenza superiore al 90%. Sostituire l'intero terreno αMEM con un terreno fresco ogni 2 giorni.
- Dividere equamente i diversi pozzetti in due gruppi: il gruppo di controllo negativo (senza induzione della differenziazione osteogenica) e il gruppo di differenziazione osteogenica
- Preparare il terreno di induzione della differenziazione osteogenica integrando il terreno αMEM completo con 10 mmol/L di β-glicerofosfato, 50 mg/L di acido L-ascorbico e 10-8 mol/L di desametasone.
- Eliminare il terreno di coltura cellulare e lavare le BMSC P3 con 1 mL di PBS.
- Aggiungere il terreno di induzione della differenziazione osteogenica ai pozzetti del gruppo di differenziazione osteogenica per l'induzione della differenziazione osteogenica (1 mL/pozzetto).
- Aggiungere il terreno αMEM completo ai pozzetti del gruppo di controllo (1 mL/pozzetto).
- Coltura delle BMSC P3 a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 7 o 21 giorni, sostituendo il terreno di induzione della differenziazione osteogenica o il terreno αMEM completo con lo stesso terreno fresco ogni 3 giorni.
NOTA: Le cellule con induzione di 7 giorni vengono utilizzate per la colorazione con fosfatasi alcalina (ALP). Le cellule con un'induzione di 21 giorni vengono utilizzate per il saggio del rosso S di alizarina.
9. Identificazione di cellule osteogeniche differenziate con colorazione ALP
- Lavare una volta le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 1 mL di PBS.
- Fissare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di formalina tamponata al 10% e incubando per 20 minuti.
- Lavare nuovamente le cellule in ogni pozzetto con 1 mL di PBS una volta.
- Aggiungere 0,5 mL di reagente colorante con fosfatasi alcalina 1-Step NBT/BCIP a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 30 minuti con un foglio di alluminio per proteggere il medicinale dalla luce.
- Scartare la soluzione, lavare una volta le cellule in ogni pozzetto con 1 ml di acqua distillata e lasciare asciugare la piastra.
- Osservare e acquisire immagini di colonie colorate utilizzando una fotocamera per identificare le cellule ALP-positive con precipitato nero-violaceo.
NOTA: Il reagente di colorazione con fosfatasi alcalina (ALP) 1-Step NBT/BCIP produce un precipitato nero-viola forte e insolubile dopo la reazione con l'ALP, che può essere facilmente visualizzato.
10. Identificazione di cellule osteogeniche differenziate mediante saggio del rosso S di alizarina
- Lavare una volta le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 1 mL di PBS.
- Fissare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di formalina tamponata al 10% e incubando per 20 minuti.
- Lavare una volta le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 1 mL di PBS.
- Aggiungere 0,5 mL di rosso alizarina allo 0,1% S in Tris-HCl 0,1 mol/L (pH 8,3) in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 30-60 minuti.
- Scartare la soluzione, lavare una volta le cellule in ogni pozzetto con 1 ml di acqua distillata e lasciare asciugare la piastra.
- Osservare e acquisire immagini di colonie colorate utilizzando una fotocamera per identificare le cellule S-positive rosse di alizarina.
NOTA: Il test S rosso alizarina per la differenziazione delle MSC in cellule ossee mineralizzate mature provoca la formazione di un complesso S-calcio rosso alizarina, che produce una colorazione rosso vivo che può essere osservata visivamente.
11. Preparazione del terreno di differenziazione adipogenico per induzione adipogenica A per BMSC
NOTA: Per la differenziazione adipocitaria delle BMSC, viene spesso utilizzato un kit di differenziazione adipogenica con cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di topo (vedi Tabella dei materiali) secondo le linee guida.
- Mettere il siero fetale bovino (un componente del kit, denominato siero) in frigorifero a 4 °C per almeno 6 ore prima di scongelarlo completamente.
- Riporre l'Integratore A-I (componente del Kit) in frigorifero a 4°C almeno 30 minuti prima della preparazione; posizionare l'integratore A-II (componente del kit) a temperatura ambiente fino a completo scongelamento.
- Capovolgere o picchiettare delicatamente la provetta del reagente per miscelare il contenuto.
- Centrifugare la provetta del reagente Supplement A-II a 300 × g per 30 s a temperatura ambiente per assicurarsi che il reagente si raccolga sul fondo per un facile recupero.
- Pulire accuratamente l'imballaggio esterno di tutti i componenti con alcol medico al 75% e aprirli in una cabina di biosicurezza.
- Aggiungi il siero, l'integratore A-I e l'integratore A-II nel mezzo.
NOTA: Per garantire una corretta dissoluzione, preriscaldare il terreno basale (un componente del kit) a 37 °C, altrimenti l'integratore A-II potrebbe precipitare a causa dell'esposizione al freddo. - Utilizzare una piccola quantità di Basal Medium per sciacquare ogni bottiglia e tubo, assicurandosi di trasferire tutti i componenti nel Basal Medium.
- Chiudere il tappo del flacone Basal Medium e agitare delicatamente per mescolare accuratamente.
- Sigillare la bottiglia con pellicola di paraffina, avvolgerla in un foglio di alluminio ed etichettarla con il nome, la data di preparazione e altri dettagli.
12. Preparazione del terreno di differenziazione ad induzione adipogenica B per BMSC
- Mettere il siero fetale bovino in frigorifero a 4 °C per almeno 6 ore prima di scongelarlo completamente.
- Porre l'Integratore B (componente del Kit) in frigorifero a 4 °C fino al completo scongelamento per almeno 30 minuti prima della preparazione.
- Capovolgere o picchiettare delicatamente la provetta del reagente per miscelare il contenuto.
- Centrifugare la provetta dell'integratore B per concentrare il reagente sul fondo per una raccolta più facile.
- Pulire accuratamente l'imballaggio esterno di tutti i componenti con alcol medico al 75% e aprirli in una cabina di biosicurezza.
- Aggiungere il siero e l'integratore B nel terreno basale.
- Utilizzare una piccola porzione di Basal Medium per lavare ogni bottiglia e tubo, assicurandosi che tutti i componenti siano completamente trasferiti al terreno.
- Chiudere il tappo del flacone Basal Medium e agitare delicatamente per mescolare accuratamente.
- Sigilla la bottiglia con parafilm, avvolgila in un foglio di alluminio ed etichettala con il nome, la data di preparazione e altri dettagli.
13. Differenziamento adipocitario delle BMSC
- Aggiungere 1 ml di gelatina allo 0,1% in una piastra a sei pozzetti, agitandola per ricoprire uniformemente il fondo di ogni pozzetto.
- Posizionare la piastra a sei pozzetti rivestita con gelatina allo 0,1% in una cappa sterile o in un incubatore di CO2 per almeno 30 minuti.
- Aspirare la gelatina e la piastra è pronta per la semina cellulare, oppure attendere che i pozzetti si asciughino prima di seminare dopo 30 minuti.
- Seminare le BMSC P3 a una densità di 4 × 104 cellule/cm2 in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti, aggiungendo 2 mL di terreno completo a ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore a CO2 con il 5% di CO2 e umidità satura.
- Aspirare con attenzione il terreno e aggiungere 2 mL di terreno di induzione della differenziazione adipogenica A a ciascun pozzetto quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza.
- Aspirare il terreno A dai pozzetti dopo 3 giorni dall'induzione e aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione adipogenico B.
- Aspirare il terreno B dopo 1 giorno e tornare al mezzo A per un'ulteriore induzione.
- Alternare tra il terreno A e B e osservare le cellule ogni giorno. Se la contrazione o la morte cellulare si verifica durante l'induzione con il terreno A, passare prontamente al mezzo B.
- Ripetere il processo di induzione e mantenimento fino a quando non appare un numero sufficiente di goccioline lipidiche di dimensioni adeguate, quindi prepararsi per la colorazione.
14. Colorazione Olio Rosso O (ORO)
NOTA: Eseguire tutte le procedure il più delicatamente possibile per evitare il distacco delle goccioline lipidiche.
- Aspirare il mezzo di differenziazione per induzione adipogenica dalla piastra a 6 pozzetti dopo aver completato la differenziazione per induzione adipogenica e lavare delicatamente con 1×PBS 2-3 volte.
- Aggiungere 2 mL di formalina tamponata neutra al 10% per pozzetto e fissare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di lavoro di Oil Red O mescolando il brodo Oil Red O con acqua distillata in un rapporto 3:2. Dopo la miscelazione, centrifugare a 250 × g per 4 minuti e utilizzare il surnatante.
- Aspirare il fissativo e lavare delicatamente con PBS 2-3 volte, assicurandosi di rimuovere completamente il fissativo.
- Aggiungere 0,8 ml di soluzione di colorante rosso O in ogni pozzetto, lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Aspirare la soluzione colorante, lavare due volte con 1 mL di etanolo al 75%.
- Aggiungere 1 mL di colorante di ematossilina in ciascun pozzetto per 2 minuti, quindi aspirare.
- Aggiungere 2 mL di PBS a ciascun pozzetto e osservare i risultati della colorazione adipogenica al microscopio.
- Sigillare la piastra a sei pozzetti colorata con parafilm e conservare a 4 °C.
NOTA: Non conservare per più di 1 settimana. Le goccioline lipidiche possono fondersi, perdendo lo stato di colorazione.
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Risultati
Le BMSC derivate dal topo sono state isolate e coltivate per circa 2 settimane per generare le BMSC del terzo passaggio (P3) (Figura 3). Come mostrato nella Figura 3A, le cellule appena estratte dal midollo osseo sono rimaste mononucleate con goccioline di grasso visibili. Le cellule a forma di fuso sono apparse nel piatto di coltura, raggiungendo una confluenza del 60%-80% il 5° giorno di coltura (
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Discussione
La terapia con cellule staminali ha suscitato un notevole interesse grazie al suo potenziale di rivoluzionare la medicina rigenerativa. Gli studi preclinici hanno fornito prove sostanziali a sostegno dell'applicazione clinica delle cellule staminali, in particolare delle BMSC13. Tuttavia, sfide come la bassa resa cellulare, la contaminazione e la crescita lenta hanno ostacolato la loro applicazione clinica. Pertanto, vi è un urgente bisogno di ricerca incentrata s...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione a questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2020YFE0201600) e della National Natural Science Foundation of China (82174408 e 82374477).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 1 ml (ago per siringa da 22 G) | GRUPPO GENTILE (KDL) | 60017031 | |
| NBT/BCIP in 1 passaggio | Pierce Biotecnologia, Inc. | 34042 | Colorazione con fosfatasi alcalina |
| 10% formalina tamponata neutra | Wexis | 5200250 | Fissazione cellulare |
| Piastra a 6 pozzetti | Selezione del laboratorio | 11110 | Coltura cellulare |
| Piastra a 24 pozzetti | Selezione del laboratorio | 11310 | Coltura cellulare |
| 40 μ m Filtro cellulare | Cornig | 352340 | Filtrazione per la rimozione degli agglomerati |
| Siringa da 50 ml | GRUPPO GENTILE (KDL) | 60017040 | |
| 75% di etanolo | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 31009001 | Disinfettare la pelle dei topi |
| Alizarina Rosso S | Sigma-Aldrich | Codice: A5533 | Rilevamento di depositi di calcio e noduli calcificati |
| Anticorpo monoclonale APC CD44 (clone:IM7) | eBioscience | 17-0441-82 | Citometria a flusso |
| Controllo dell'isotipo APC Rat IgG2b kappa (clone:eB149/10H5) | eBioscience | 17-4031-82 | Citometria a flusso |
| Autoclave | Giappone Hiryama Azienda | HVE-50 | Strumenti chirurgici per sterilizzazione |
| Incubatore CO2 | Thermo Fisher Technology (Cina) Co., Ltd. | 300583057 | Coltura cellulare |
| Flussimetria Cytoflex | Beckman Coulter | A00-1-1102 | Citometria a flusso |
| desametasone | Sigma-Aldrich | D4902 | Differenziazione osteogenica delle BMSC |
| Piatto (100mm) | Corning | 430167 | Coltura cellulare |
| Piatto (60mm) | Corning | 430166 | Posizionamento del campione durante il trapianto |
| Batuffoli di cotone disinfettanti | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Disinfettare la pelle dei topi |
| Guanti sterili monouso | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd | YT21131 | Funzionamento sterile |
| Dieta per roditori irradiati a doppio leone | Suzhou Shuangshi Sperimentale Tecnologia per l'Alimentazione Animale Co., Ltd. | GB 14924.3 | Mangimi |
| Siero fetale bovino | Shanghai Biosun Sci& Fornitore verificato - Tech Co., Ltd. | BS-0002-500 | Coltura cellulare |
| FITC Criceto Anti-Rat CD29 (clone:Ha2/5) | BD Bioscienze | 555003 | Citometria a flusso |
| FITC Criceto IgM, λ 1 Controllo isotipo (clone: G235-1) | BD Bioscienze | 553960 | Citometria a flusso |
| gelatina (0,1%) | OriCell | GLT-11301 | migliorare la capacità di adesione delle cellule |
| IVC gabbia per topi | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | Barriera per animali |
| Acido L-ascorbico | Sigma-Aldrich | Codice: A8960 | Differenziazione osteogenica delle BMSC |
| Segna penna | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | Contrassegnare le informazioni cellulari sulla capsula di Petri |
| Modifica MEM Alpha (1X) | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | SH30265 | Coltura cellulare |
| Kit di differenziazione adipogenica delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di topo | Ciageno | MUXMX-90031 | Differenziazione adipogenica delle BMSC |
| Nikon Eclipse Ti2 Microscopio invertito Synstem | Giappone Nikon Corporatin | Ti2-U | Osserva le celle e scatta foto |
| Forbici oftalmiche | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | Taglia la pelle |
| Pinzette oftalmiche | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Procurarsi del tessuto osseo di topo. |
| PIPETTA PASTEUR | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-XG-03M | Aspirare il terreno di coltura |
| PE Rat Anti-Mouse CD31 (clone: Ha2/5) | BD Bioscienze | 553373 | Citometria a flusso |
| PE Ratto IgG2a, κ Controllo isotipo (clone:R35-95) | BD Bioscienze | 553930 | Citometria a flusso |
| Anticorpo monoclonale PE-Cianina7 Ly-6A/E (Sca-1) (clone:D7) | eBioscience | 25-5981-82 | Citometria a flusso |
| PE-Cianina7 Rat IgG2a kappa Controllo dell'isotipo (clone: eBR2a) | eBioscience | 25-4321-82 | Citometria a flusso |
| Penicillina-Streptomicina | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 2585636 | Coltura cellulare |
| PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 (clone: Ha2/5) | BD Bioscienze | 561869 | Citometria a flusso |
| PerCP-Cy5.5 IgG2b di ratto, κ Controllo isotipo (clone:A95-1) | BD Bioscienze | 550764 | Citometria a flusso |
| Bisturi | Fabbrica di strumenti chirurgici oDispositivi medici di Shanghai? Gruppo?Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Isolare gli arti posteriori e il busto del topo e rimuovere i tessuti estranei dall'osso |
| Cappuccio sterile | Thermo Fisher Technology (Cina) Co., Ltd. | ECO0.9 | Tavolo operatorio chirurgico |
| teli chirurgici sterili | Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160900 | Fornire un'area chirurgica sterile |
| Provetta (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotecnologia Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Conservare la soluzione cellulare filtrata |
| tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | digerire le cellule aderenti |
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G5422 | Differenziazione osteogenica delle BMSC |
Riferimenti
- Chu, D. -T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
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- Li, M., et al. Extracellular vesicles from apoptotic BMSCs ameliorate osteoporosis via transporting regenerative signals. Theranostics. 14 (9), 3583-3602 (2024).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. J Vis Exp. (131), e56750(2018).
- Chu, D. -T., et al. Adipose tissue stem cells for therapy: An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application. J Clin Med. 8 (7), 917(2019).
- Qin, L., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic diseases—the two sides of the same coin. Acta Pharmacol Sin. 44 (2), 268-287 (2023).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
- Grossner, T., Haberkorn, U., Hofmann, J., Gotterbarm, T. Effects of different basal cell culture media upon the osteogenic response of hMSCs evaluated by 99mTc-HDP labeling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6288(2022).
- Janda, C. Y., et al. Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt and β-catenin signalling. Nature. 545 (7653), 234-237 (2017).
- Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the Alizarin Red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. Int J Mol Sci. 24 (1), 723(2022).
- Wang, C., et al. Restoration of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in mice inhibited by cyclophosphamide with psoralen. Chin J Tissue Eng Res. 29 (1), 16-23 (2025).
- Papaccio, F., et al. Concise review: Cancer cells, cancer stem cells, and mesenchymal stem cells: Influence in cancer development. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2115-2125 (2017).
- Kolf, C. M., Cho, E., Tuan, R. S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: Regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 9 (1), 204(2007).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Abdallah, B. M., et al. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biol Proced Online. 21 (1), 3(2019).
- Liu, S., et al. Single cell sequencing reveals gene expression signatures associated with bone marrow stromal cell subpopulations and time in culture. J Transl Med. 17 (1), 23(2019).
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