Questo protocollo delinea un metodo per innestare una perlina magnetica nel cuore di zebrafish in via di sviluppo attraverso la microchirurgia, consentendo la manipolazione delle forze meccaniche in vivo e innescando l'afflusso di calcio dipendente dallo stimolo meccanico nelle cellule endocardiche.
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Articolo metodologico
Manipolazione delle forze meccaniche nel cuore del pesce zebra in via di sviluppo utilizzando perle magnetiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le forze meccaniche forniscono continuamente un feedback ai programmi morfogenetici delle valvole cardiache. Nel pesce zebra, lo sviluppo della valvola cardiaca si basa sulla contrazione del cuore e sugli stimoli fisici generati dal cuore pulsante. L'emodinamica intracardiaca, guidata dal flusso sanguigno, emerge come informazione fondamentale che modella lo sviluppo del cuore embrionale. Qui, descriviamo un metodo efficace per manipolare le forze meccaniche in vivo innestando una perlina magnetica di diametro compreso tra 30 μm e 60 μm nel lume cardiaco. L'inserimento della perlina viene condotto mediante microchirurgia in larve anestetizzate senza perturbare la funzione cardiaca e consente l'alterazione artificiale delle condizioni al contorno, modificando così le forze di flusso nel sistema. Di conseguenza, la presenza della perlina amplifica le forze meccaniche subite dalle cellule endocardiche e può innescare direttamente l'afflusso di calcio dipendente dallo stimolo meccanico. Questo approccio facilita lo studio delle vie di meccanotrasduzione che governano lo sviluppo del cuore e può fornire informazioni sul ruolo delle forze meccaniche nella morfogenesi delle valvole cardiache.
Introduzione
Dalla sua introduzione alla fine degli anni '701, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente sistema modello per studiare le complessità dello sviluppo cardiaco e dei disturbi cardiaci congeniti. A differenza della maggior parte dei vertebrati, compresi gli embrioni di topo e pulcino, che si basano su un sistema cardiovascolare funzionale e non possono sopravvivere ai difetti cardiaci precoci, il pesce zebra offre un vantaggio unico consentendo lo studio di fenotipi cardiaci gravi. Ciò è dovuto alle loro piccole dimensioni, che facilitano un sufficiente apporto di ossigeno attraverso la diff....
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Protocollo
Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo aderiscono alla direttiva europea 2010/63/UE e alle linee guida del Ministero dell'Interno nell'ambito della licenza del progetto PP6020928.
1. Ottenere embrioni di pesce zebra per l'innesto di perline
- Attraversa la linea del pesce zebra pertinente e fai crescere gli embrioni nel terreno di Danieau a 28,5 °C. Per istruzioni più dettagliate sull'attraversamento delle linee del pesce zebra, fare riferimento al database JoVE Science Education27.
- Trattare gli embrioni ....
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Risultati
Esempi di innesto di perline di successo sono mostrati nella Figura 3, nel Video 3 e nel Video 4. La perlina magnetica è stata posizionata correttamente all'interno dell'atrio del cuore del pesce zebra, consentendo un flusso sanguigno senza ostacoli e nessuna emorragia osservata. Inoltre, le pareti cardiache hanno mantenuto la loro integrità strutturale senza collassare (Figura 3 e Video 3). Dopo 24 ore, l'embri.......
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Discussione
Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi
Montaggio di embrioni di zebrafish
La quantità di agarosio utilizzata per montare gli embrioni è importante. La cupola formata non deve essere eccessivamente grande, in quanto ciò può ostacolare la manipolazione della perlina dalla superficie agli embrioni. Al contrario, non dovrebbe essere troppo piccolo; Avere più perle sopra l'ag.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del laboratorio Vermot per le discussioni e i commenti sul protocollo. Siamo grati a tutti i membri dello staff dell'Imperial College di Londra. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio Europeo della Ricerca (ERC) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea: GA N°682939, Additional Ventures (numero di premio 1019496), MRC (MR/X019837/1) e BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P è stato supportato da una borsa di studio dipartimentale di Bioingegneria (Imperial College London). HF è stato supportato da JSPS KAKENHI (23H04726 e 24K02207), dal programma JST FOREST (23719210),....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali | |||
| Attrezzatura essenziale per l'allevamento, l'allevamento e la raccolta | |||
| Piatto con fondo in vetro (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Blocco termico | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Pinze per gioiellieri | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Provette per |
| microcentrifuga in lega inox 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| Pasteur pipetta | |||
| Piastra | di Petri | ||
| Stereomicroscopio | |||
| Reagenti | |||
| 4 mg/mL soluzione madre | |||
| di tricaina Terreno di Danieau (soluzione madre 60x) | |||
| PureCube Glutatione MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-fenil-2-tiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure agarosio a basso punto di fusione | Invitrogen | 16520-050 | |
| Danieau's medium (60x soluzione madre) | |||
| 34,8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1,6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5,8 g CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9,78 g MgCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Sciogliere gli ingredienti in H2O fino a un volume finale di 2 L. Regolare il pH a 7,2 utilizzando NaOH, quindi sterilizzare in autoclave. | |||
| 4 mg/mL di tricaina soluzione madre | |||
| 400 mg di tricaina in polvere (sale di etile 3-amminobenzoato metanosolfonato) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97,9 mL di H2O | |||
| 2,1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
| Regolare il pH a 7, quindi aliquotare e conservare a -20 °C. |
Riferimenti
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.....
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Ristampe e permessi
