Articolo metodologico

Valutazione della segnalazione della morte cellulare mediante immunofluorescenza in un modello di ictus ischemico di ratto

1.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67606

⸱

3 gennaio 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I modelli in vivo di ratto sono strumenti indispensabili per studiare i meccanismi patologici e i bersagli terapeutici per l'ictus ischemico. Questo lavoro descriverà l'esecuzione della colorazione in immunofluorescenza in fette di cervello infartuate dopo occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei ratti.

Abstract

L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo. La maggior parte dei casi di ictus sono ischemici e derivano dall'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA). Gli attuali approcci farmacologici per il trattamento dell'ictus ischemico sono limitati; Pertanto, sono urgentemente necessarie nuove terapie che forniscano un'efficace neuroprotezione contro il danno ischemico a seguito di ictus. Nel tessuto cerebrale a seguito di ictus ischemico, l'area della penombra ischemica è recuperabile ma a rischio di progredire verso un danno irreversibile. L'area penombrale che circonda il nucleo infartuato è un bersaglio concettuale per la neuroprotezione. Poiché il flusso sanguigno è parzialmente mantenuto nell'area penombrale, le cellule neuronali e non neuronali in quest'area sopravvivono transitoriamente dopo l'ictus e queste cellule che sono ancora vitali possono essere salvate da appropriati interventi medici. Comprendere la fisiopatologia della penombra è importante nello sviluppo di terapie neuroprotettive perché le vie di morte cellulare attivate nella penombra ischemica possono indicare bersagli terapeutici, come RUNX1 e catepsine. Questi bersagli proteici che funzionano come mediatori della morte cellulare programmata possono essere ulteriormente sfruttati nella ricerca traslazionale. Con dimensioni moderate e somiglianza con il cervello umano, il modello di occlusione MCA ( MCAO) in vivo di ratto imita l'ictus ischemico umano e offre uno strumento applicabile per indagare la patologia penombrale, esaminare la segnalazione della morte cellulare e valutare gli effetti di potenziali bersagli nel contesto di MCAO. Qui, descriviamo come indurre MCAO nei ratti e come eseguire la colorazione in immunofluorescenza per il rilevamento della segnalazione della morte cellulare nel cervello di ratto dopo MCAO.

Introduzione

L'ictus cerebrale è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo1. L'elevata mortalità e morbilità dell'ictus comporta un immenso onere per la sanità pubblica e gravi conseguenze socio-economiche. Sebbene il tasso di incidenza e mortalità dell'ictus rimanga stabile, il numero di pazienti con ictus e di decessi correlati all'ictus sta aumentando nel corso dei decenni 2,3. Gli ictus possono essere classificati come ischemici o emorragici. La maggior parte dei casi di ictus sono ictus ischemici causati dall'occlusione di un'arteria cerebrale principale4. Ad oggi, l'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) è l'unico farmaco approvato dalla FDA per l'ictus ischemico, ma la sua applicazione è altamente limitata dalla finestra terapeutica ristretta, dalle complicanze e dalle controindicazioni 5,6,7. Pertanto, è urgente sviluppare nuove opzioni di trattamento con una finestra terapeutica più ampia per mitigare gli effetti dell'ictus.

I modelli animali sperimentali sono strumenti utili per studiare la fisiopatologia dell'ictus ischemico. Nella maggior parte dei pazienti umani, l'ictus ischemico è causato dall'ostruzione dell'arteria cerebrale media (MCA)8. Pertanto, sono stati sviluppati modelli di roditori di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) per assomigliare all'infarto cerebrale umano. Sebbene esistano diversi approcci MCAO utilizzati negli studi sui piccoli animali, il metodo più utilizzato è il modello di sutura intraluminale, che prevede l'inserimento di un filamento di nylon nell'arteria cerebrale media dalle arterie carotidi esterne o interne, con conseguente occlusione transitoria o permanente del flusso sanguigno 4,9. Questo modello porta a un grande volume di infarto cerebrale e consente l'esame della segnalazione della morte cellulare nel tessuto cerebrale infartuato con tecniche di immunofluorescenza.

L'area che circonda il nucleo infartuato, denominata penombra, è l'obiettivo di potenziali terapie per l'ictus10,11. Poiché il flusso sanguigno nella penombra è parzialmente mantenuto, i neuroni danneggiati e le cellule non neuronali in quest'area possono essere recuperati inibendo l'attivazione della segnalazione della morte cellulare. Prendere di mira le vie di morte cellulare può essere una strategia promettente per la neuroprotezione dopo l'ictus12. Pertanto, la valutazione della segnalazione della morte cellulare è fondamentale per la ricerca sperimentale sull'ictus. Recentemente, la catepsina-B, una proteasi lisosomiale, ha dimostrato di svolgere un ruolo nel mediare la morte cellulare programmata dopo l'ictus e ha guadagnato una notevole attenzione in campo neurologico13. La catepsina-B rappresenta un potenziale bersaglio per la neuroprotezione che merita ulteriori indagini.

Questo articolo dimostra come indurre la MCAO utilizzando l'approccio della sutura intraluminale nei ratti. Mostriamo anche come eseguire la colorazione con 2,3,5-trifeniltetrazalium chloride (TTC) per determinare le dimensioni dell'infarto e rilevare le cellule apoptotiche utilizzando la colorazione TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase dUTP nick-end labeling).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Questo protocollo e gli esperimenti qui riportati sono stati approvati dal Comitato Etico Medico dell'Università del Sichuan. La cura e l'uso degli animali sono stati conformi a criteri etici locali e internazionali.

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschi adulti del peso di 250-280 g. I ratti sono stati alloggiati in una condizione ambientale standard (temperatura di 20-22 °C, ciclo luce/buio di 12 ore), alimentati con una dieta standard a base di latte artificiale per ratti e acqua ad alta purezza. La procedura chirurgica è stata eseguita in condizioni sterili.

1. Modello di ratto di MCAO

  1. Indurre l'anestesia iniziale utilizzando isoflurano al 4% con ossigeno a 1 L/min. Monitorare la profondità dell'anestesia pizzicando il piede. Durante l'anestesia, somministrare un unguento oculare per prevenire la secchezza. Iniettare nel ratto 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea come rifornimento di volume e con 5 mg/kg di carprofene e 0,1 mg/kg di buprenorfina per l'analgesia preoperatoria. Ridurre l'isoflurano inizialmente al 3,5% e poi al 2% gradualmente durante l'intervento chirurgico.
  2. Posizionare il ratto in posizione supina e mantenere la temperatura corporea a 36,5 ± 0,1 °C su un tappetino termico regolato con una sonda per il monitoraggio della temperatura rettale. Radere e disinfettare la pelle del collo con una soluzione disinfettante iodophor.
  3. Praticare un'incisione di 2 cm sulla linea mediana del collo e ritrarre i tessuti molli per esporre i vasi carotidee. Usa il forcipe per isolare l'arteria carotide comune destra (CCA), l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide interna (ICA).
  4. Usa le suture per legare il CCA destro prossimale e bloccare l'ICA e l'ECA destro con una micro-clip alla loro origine.
  5. Inserire un monofilamento di nylon rivestito con una punta rotonda in silicone nel lume del CCA attraverso una piccola incisione e fare un nodo nel CCA per evitare il sanguinamento e lo spostamento del monofilamento di nylon.
  6. Aprire la micro-clip ICA destra e inserire il monofilamento di nylon nell'arteria cerebrale media destra (MCA) attraverso il moncone ICA fino a quando la punta in silicone non occlude l'origine dell'MCA (~18-20 mm).
  7. Tagliare la parte esposta del monofilamento di nylon e chiudere l'incisione della linea mediana del collo.
  8. Dopo 2 ore di occlusione dell'MCA, aprire l'incisione del collo e sciogliere il nodo nel CCA. Quindi estrarre il monofilamento di nylon per riperfondere l'MCA. Legare il CCA destro distale e chiudere l'incisione del collo con suture continue o interrotte.
  9. Dopo l'intervento, somministrare buprenorfina per iniezione sottocutanea ogni 8 ore, alla dose di 0,03 mg/kg. Osservare i ratti durante il recupero dall'anestesia in una gabbia riscaldata con un tappetino riscaldante a temperatura regolata. Per incoraggiare il consumo, metti nella gabbia una capsula di Petri con purè di cibo. Ospita un ratto per gabbia dopo l'intervento chirurgico.
  10. Sottoporre i ratti finti alla stessa procedura senza l'inserimento del monofilamento.
    NOTA: In ogni gruppo vengono utilizzati un totale di 9 animali per la misurazione delle dimensioni dell'infarto (n = 3), l'analisi dell'immunofluorescenza (n = 3) e la rilevazione dell'apoptosi (n = 3).
  11. Valutare la funzione neurologica a 2 ore dopo MCAO e 22 ore dopo la riperfusione utilizzando la scala di valutazione comportamentale Zea-Longa con una scala da 0 a 5 punti14. Escludi le tariffe con un punteggio di 0 o 4.

2. Misurazione delle dimensioni dell'infarto (Figura 1)

  1. Sacrificare i ratti in anestesia profonda (isoflurano al 4%) mediante ghigliottina e isolare accuratamente l'intero cervello dal cranio.
  2. Congelare il cervello a -20 °C per 20 minuti e tagliare il cervello congelato in sei fette coronali con una distanza di 2 mm tra le fette. Colorare le fette di cervello con il 2% di TTC per 15 minuti a 37 °C al buio.
  3. Fissare le fette di cervello con paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente (RT). Fotografa le fette macchiate con una fotocamera digitale, con l'impostazione della modalità automatica per gli oggetti ravvicinati.
  4. Trasferisci le immagini su un computer e misura la dimensione dell'infarto utilizzando ImageJ. Presenta la dimensione dell'infarto come il rapporto tra la somma dell'area dell'infarto in 6 fette e la somma dell'intera area cerebrale nelle stesse fette. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM).

3. Analisi di immunofluorescenza su criosezione cerebrale (Figura 2)

  1. Indurre l'anestesia con isoflurano al 4% e 1 L/min di ossigeno. Incidere la pelle e il tessuto sottocutaneo per esporre il cuore.
  2. Togliete il pericardio e praticate un piccolo taglio nell'atrio destro. Perfondere 200 mL di soluzione fisiologica attraverso il ventricolo sinistro, seguiti da 200 mL di paraformaldeide al 4%.
  3. Apri il cranio e rimuovi il cervello intatto.
  4. Fissare il cervello in paraformaldeide al 4% a RT per oltre 24 ore. Quindi, disidratarlo in una serie di gradienti di soluzione di saccarosio del 10%, 15% e 30% fino a quando il tessuto non affonda, circa 6-8 ore per ogni concentrazione.
  5. Incorporare il cervello nel composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) e rimuovere le bolle d'aria, se presenti. Quindi, congelare il cervello in azoto liquido e conservarlo nel congelatore a -80 °C.
  6. Sezionare il cervello utilizzando un criostato a uno spessore di 5 μm. Durante il sezionamento, assicurarsi che la temperatura dell'armadio rimanga compresa tra -18 °C e -20 °C. Etichettare la posizione di sezionamento in base al sito del modello e alle condizioni sperimentali. Conservare le sezioni in congelatore.
  7. Lasciare che le sezioni congelate si equilibrino a RT per ~30 minuti per eseguire la colorazione in immunofluorescenza. Quindi, immergere le sezioni con PBS sterile 3 volte per 5 minuti ciascuna.
  8. Delineare il tessuto con una penna immunoistochimica. Incubare con 20 μg/mL di proteinasi K (senza RNasi) e 0,3% di Triton X-100 a RT per 10 minuti.
  9. Immergere le sezioni con PBS sterile 3 volte per 5 minuti ciascuna. Applicare il 3% di BSA sul tessuto delineato e incubare a RT per 1 ora per il blocco.
  10. Dopo il blocco, rimuovere la soluzione, aggiungere l'anticorpo primario appropriato (Rabbit recombinant monoclonal cathepsin-B antibody, 1:200) e incubare le sezioni per una notte al buio a 4 °C.
  11. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare le sezioni con PBS sterile contenente lo 0,1% di Tween-20 3 volte per 5 minuti ciascuna.
  12. Aggiungere l'anticorpo secondario appropriato (IgG di capra anti-ratto [H+L] [FITC coniugato], 1:200) con il fluoroforo richiesto e incubare le sezioni in una camera umidificata a RT per 1 ora, proteggendole dalla luce.
  13. Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi, lavare le sezioni con PBS sterile contenente lo 0,1% di Tween-20 3 volte per 5 minuti ciascuna. Colorare le sezioni con un supporto di montaggio contenente DAPI e coprirle con un vetrino coprioggetti.
  14. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza con le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm, lunghezza d'onda di emissione di 520 nm e tempo di esposizione di 500 ms. Conservare le sezioni al buio a 4 °C per una conservazione a lungo termine.

4. Rilevamento dell'apoptosi mediante colorazione TUNEL (Figura 3)

NOTA: Per la colorazione TUNEL viene utilizzato un kit di test TUNEL commerciale. Questo kit TUNEL include una soluzione di lavoro tampone DNasi I, un tampone di equilibrazione deossinucleotidiltransferasi (TdT), una soluzione di lavoro per la marcatura e una soluzione di lavoro DAPI.

  1. Perfondere e isolare il cervello utilizzando la stessa procedura di cui sopra (passaggi 3.2-3.3). Immergere il cervello in paraformaldeide al 4% per 3-4 ore per il fissaggio.
  2. Tagliare il cervello in fette coronali di circa 2 mm di spessore, partendo dall'estremità rostrale fino all'estremità caudale, e immergere in paraformaldeide al 4% per ulteriori 12 ore. Dopo la fissazione, lavare le fette di cervello in acqua corrente per 1 ora.
  3. Immergere le fette di cervello in soluzioni di etanolo con concentrazioni del 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% in sequenza per 35-50 minuti ciascuna per la disidratazione.
  4. Trattare le fette di cervello con l'agente biologico trasparente I di tipo TO per 35-50 minuti, seguito dall'agente schiarente II per 35-50 minuti, fino a quando il tessuto non è completamente trasparente.
  5. Immergere le fette di cervello in sequenza nel terreno di inclusione I per 60 minuti, nel terreno di inclusione II per 60 minuti, nel terreno di inclusione III per 60 minuti e nel terreno di inclusione IV per 60 minuti.
  6. Metti le fette di cervello in una cassetta da inclusione. Sigillare la cassetta, etichettarla chiaramente e metterla in una cella frigorifera per la solidificazione.
  7. Impostare il microtomo su uno spessore iniziale di 10 μm per tagliare il blocco di tessuto. Quindi, regolare lo spessore a 5 μm per l'affettatura.
  8. Riscaldare il bagnomaria a 45 °C, far galleggiare le sezioni di tessuto sulla superficie dell'acqua e raccoglierle su scivoli. Dopo circa 30 s, rimuovere i vetrini, asciugarli a RT e conservarli in una scatola di asciugatura.
  9. Deparaffinare le sezioni cerebrali immagazzinate immergendole in un agente di pulizia per 2 cicli, 10 minuti ciascuno.
  10. Per reidratare le sezioni, immergerle in etanolo anidro per 5 minuti, ripetendo 3 volte. Trasferire le sezioni in etanolo al 90% per 3 minuti. Inoltre, immergere le sezioni in etanolo all'80% per 3 minuti. Infine, immergere le sezioni in etanolo al 70% per 3 minuti.
  11. Sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Rimuovere delicatamente l'umidità in eccesso utilizzando carta da filtro.
  12. Somministrare 100 μL di soluzione di lavoro 1x proteinasi K a ciascun campione e incubare a 37 °C per 20 minuti. Dopo la permeabilizzazione, sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  13. Preparare i campioni per il controllo positivo.
    1. Aggiungere 100 μl di 1x DNase I Buffer working solution (TUNEL assay kit) al campione permeabilizzato e lasciarlo equilibrare a RT per 5 minuti. Rimuovere con cautela il liquido in eccesso dal campione utilizzando carta assorbente.
    2. Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro diluita di DNasi I (200 U/mL) al campione e incubare a 37 °C per 10-30 min. Sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  14. Preparare i campioni per il controllo negativo.
    1. Applicare 100 μl di soluzione di lavoro tampone DNasi I 1x sul campione permeabilizzato ed equilibrare a RT per 5 minuti. Incubare il campione di controllo negativo con DNase I Buffer a 37 °C per 10-30 minuti, assicurandosi che non venga aggiunto l'enzima DNasi I. Sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  15. Applicare 100 μL di tampone di equilibrio deossinucleotidiltransferasi terminale (TdT) (kit del saggio TUNEL) su ciascun campione e incubare in una camera umidificata a 37 °C per 10-30 minuti. Quindi, rimuovere il tampone di equilibratura TdT con carta assorbente.
  16. Aggiungere 50 μl di soluzione di lavoro per la marcatura (kit del saggio TUNEL) a ciascun campione, quindi incubarli a 37 °C in una camera buia umidificata per 60 minuti. Se l'intensità del segnale è bassa, prendere in considerazione l'estensione del tempo di reazione di marcatura del DNA. Quindi, sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  17. Dopo aver tamponato l'umidità in eccesso, applicare la soluzione di lavoro DAPI (kit del saggio TUNEL) e incubare a RT al buio per 5 minuti per controcolorare i nuclei. Quindi, sciacquare i campioni in PBS 4 volte per 5 minuti ciascuno. Rimuovere il liquido in eccesso con carta assorbente e sigillare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio anti-sbiadimento.
  18. Scansiona i vetrini colorati utilizzando il sistema di imaging multispettrale Vectra Polaris e analizza i dati con il software di sistema.

5. Analisi statistica

  1. Presentare i risultati sperimentali come mezzi ± SEM e analizzare i dati con un t-test di Student per due confronti di gruppo utilizzando il software GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, San Diego, CA).
  2. Impostare un valore p inferiore a 0,05 come differenza statistica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

I ratti sono sottoposti a ischemia di 120 minuti durante MCAO seguita da riperfusione di 22 ore. Il tasso di mortalità è stato minimo durante l'intervento chirurgico MCAO ed è stato di circa il 25% durante il periodo di riperfusione. Un danno cerebrale significativo è stato osservato nel gruppo MCAO, mentre nessun infarto è stato osservato nel cervello del gruppo Sham (24,87 ± 1,21% vs. 0% somma dell'area dell'infarto all'intera area cerebrale; MCAO [n = 3] contro Sham [n = 3], P < 0,001;

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

L'occlusione di un'arteria cerebrale porta alla privazione di ossigeno e nutrizione, seguita dall'attivazione di specie reattive dell'ossigeno, dal sovraccarico intracellulare di calcio, dal rilascio di glutammato e dall'induzione di risposte infiammatorie15. Questa serie di eventi provoca la morte cellulare e il danno irreversibile dei tessuti nel cervello infartuato. La penombra è potenzialmente recuperabile attraverso l'intervento medico all'interno di un'appro...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Simiao Wu è stato supportato dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2024YFHZ0330) e dal West China Hospital dell'Università del Sichuan. Weihong He è stato supportato dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2023YFS0297) e dall'Università del Sichuan. Ringraziamo Yi Zhang e Yue Li presso la Research Core Facility, West China Hospital dell'Università del Sichuan, per il loro supporto tecnico sull'imaging e l'analisi TUNEL.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/ASistema di imaging multispettrale Vectra Polaris 
Etanolo anidroChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.N/A
BuprenorfinaWest China HospitalN/A
CarprofenWest China HospitalN/A
Anticorpo Catepsina-BAbcamAbcam Ab214428
CriostatoLEICA LEICA CM 1950
Fotocamera digitaleOLYMPUSTG-7
Capra Anti-ratto IgG (H+L) (coniugato FITC)Elabscience  E-AB-1021
Siero di capraSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 softwareN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
Penna per immunoistochimicaBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
Software InForm: software di sistema Akoya Biosciencesversione 2.6.0per il sistema di imaging multispettrale.
Soluzione disinfettante in iodoforoHuatian Technology Industry Co.N/A
IsofluranoRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Mezzo di montaggio contenente DAPISolarbioS2110
Nylon monofilamentoRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Composto a temperatura di taglio ottimale (OCT)EprediaN/A
ParaformaldeideBiosharpN/A
Soluzione tampone fosfato (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Versione 10
proteinasi KTiangenRT403-02
soluzione salinaKelun Co.N/A
Sprague-Dawley rattiHuafukang Co.N/A
SaccarosioBioFroxx1245GR500
Strumenti chirurgiciRWD Life Science Co.N/A
Agente biologico trasparente di tipo TO   Pechino Solarbio Scienza & Fornitore verificato - Tecnology Co., Ltd.http://www.solarbio.net/ Soluzione di
cloruro di trifeniltetrazolio (TTC)SolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitElabscience  E-CK-A321

Riferimenti

  1. Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2023 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  3. Hankey, G. J. Stroke. Lancet. 389 (10069), 641-654 (2017).
  4. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  5. Barthels, D., Das, H. Current advances in ischemic stroke research and therapies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (4), 165260(2020).
  6. Frank, D., Zlotnik, A., Boyko, M., Gruenbaum, B. F. The development of novel drug treatments for stroke patients: A review. Int J Mol Sci. 23 (10), 5796(2022).
  7. Wang, S. -N., et al. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (3), 513-523 (2023).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol Biochem Behav. 87 (1), 179-197 (2007).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Donnan, G. A., Baron, J. C., Ma, H., Davis, S. M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy. Lancet Neurol. 8 (3), 261-269 (2009).
  11. Lo, E. H. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nat Med. 14 (5), 497-500 (2008).
  12. Datta, A., et al. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy. Transl Stroke Res. 11 (6), 1185-1202 (2020).
  13. Gaire, B. P., Subedi, L., Teramoto, H., Hu, B. Cerebral Ischemia. , Exon Publications. Brisbane, Australia. (2021).
  14. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  15. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  16. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 1-6 (2004).
  17. Adams, H. P. Jr, et al. Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Circulation. 115 (20), e478-e534 (2007).
  18. Fonarow, G. C., et al. Timeliness of tissue-type plasminogen activator therapy in acute ischemic stroke: patient characteristics, hospital factors, and outcomes associated with door-to-needle times within 60 minutes. Circulation. 123 (7), 750-758 (2011).
  19. Yamori, Y., Horie, R., Handa, H., Sato, M., Fukase, M. Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  20. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne stroke registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  21. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  22. Garcia, J. H., Liu, K. F., Ho, K. L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. Stroke. 26 (4), discussion 643 636-642 (1995).
  23. Türeyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), discussion 196-200 196-200 (2005).
  24. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  25. Naqvi, S. A. R., et al. Biochemistry of Drug Metabolizing Enzymes. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  26. Yadati, T., Houben, T., Bitorina, A., Shiri-Sverdlov, R. The ins and outs of cathepsins: Physiological function and role in disease management. Cells. 9 (7), 1679(2020).
  27. Liu, C. L., et al. Cysteine protease cathepsins in cardiovascular disease: from basic research to clinical trials. Nat Rev Cardiol. 15 (6), 351-370 (2018).
  28. O'Toole, D., et al. Signalling pathways linking cysteine cathepsins to adverse cardiac remodelling. Cell Signal. 76, 109770(2020).
  29. Luke, C. J., et al. Lysoptosis is an evolutionarily conserved cell death pathway moderated by intracellular serpins. Commun Biol. 5 (1), 47(2022).
  30. Xie, Z., et al. Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways. Cell Death Dis. 14 (4), 255(2023).
  31. Nagakannan, P., Islam, M. I., Conrad, M., Eftekharpour, E. Cathepsin B is an executioner of ferroptosis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (3), 118928(2021).
  32. Conus, S., Simon, H. U. Cathepsins: key modulators of cell death and inflammatory responses. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1374-1382 (2008).
  33. Bhoopathi, P., et al. Cathepsin B facilitates autophagy-mediated apoptosis in SPARC overexpressed primitive neuroectodermal tumor cells. Cell Death Differ. 17 (10), 1529-1539 (2010).
  34. Ding, X., Zhang, C., Chen, H., Ren, M., Liu, X. Cathepsins trigger cell death and regulate radioresistance in glioblastoma. Cells. 11 (24), 4108(2022).
  35. He, W., et al. Inhibition of myocardial cathepsin-L release during reperfusion following myocardial infarction improves cardiac function and reduces infarct size. Cardiovasc Res. 118 (6), 1535-1547 (2022).
  36. McCarroll, C. S., et al. Runx1 deficiency protects against adverse cardiac remodeling after myocardial infarction. Circulation. 137 (1), 57-70 (2018).
  37. Song, J., et al. Age-related promoter-switch regulates Runx1 expression in adult rat hearts. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 541(2023).
  38. Riddell, A., et al. RUNX1: an emerging therapeutic target for cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 116 (8), 1410-1423 (2020).
  39. Chen, H., et al. Pharmacological inhibition of RUNX1 reduces infarct size after acute myocardial infarction in rats and underlying mechanism revealed by proteomics implicates repressed cathepsin levels. Funct Integr Genomics. 24 (3), 113(2024).
  40. Petanceska, S., Burke, S., Watson, S. J., Devi, L. Differential distribution of messenger RNAs for cathepsins B, L and S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 59 (3), 729-738 (1994).
  41. Chaitanya, G. V., Babu, P. P. Activation of calpain, cathepsin-b and caspase-3 during transient focal cerebral ischemia in rat model. Neurochem Res. 33 (11), 2178-2186 (2008).
  42. Yuan, D., Liu, C., Wu, J., Hu, B. Inactivation of NSF ATPase leads to cathepsin b release after transient cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 9 (3), 201-213 (2018).
  43. Hill, I. E., Preston, E., Monette, R., MacManus, J. P. A comparison of cathepsin B processing and distribution during neuronal death in rats following global ischemia or decapitation necrosis. Brain Res. 751 (2), 206-216 (1997).
  44. Kilinc, M., et al. Lysosomal rupture, necroapoptotic interactions and potential crosstalk between cysteine proteases in neurons shortly after focal ischemia. Neurobiol Dis. 40 (1), 293-302 (2010).
  45. Seyfried, D., et al. Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat. J Neurosurg. 87 (5), 716-723 (1997).
  46. Saido, T. C., Yokota, M. Neurodegenerative diseases as proteolytic disorders: brain ischemia and Alzheimer's disease. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 42 (14 Suppl), 2408-2417 (1997).
  47. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsins b induces neuroprotection against secondary degeneration in ipsilateral substantia nigra after focal cortical infarction in adult male rats. Front Aging Neurosci. 10, 125(2018).
  48. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsin b alleviates secondary degeneration in ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in adult rats. J Neuropathol Exp Neurol. 75 (9), 816-826 (2016).
  49. Pluta, R., Salínska, E., Puka, M., Stafiej, A., Lazarewicz, J. W. Early changes in extracellular amino acids and calcium concentrations in rabbit hippocampus following complete 15-min cerebral ischemia. Resuscitation. 16 (3), 193-210 (1988).
  50. Hatsuta, H., et al. Tau and TDP-43 accumulation of the basal nucleus of Meynert in individuals with cerebral lobar infarcts or hemorrhage. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 49(2019).
  51. van Groen, T., Puurunen, K., Mäki, H. M., Sivenius, J., Jolkkonen, J. Transformation of diffuse beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid deposits to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats. Stroke. 36 (7), 1551-1556 (2005).
  52. Gómez-Sintes, R., Ledesma, M. D., Boya, P. Lysosomal cell death mechanisms in aging. Ageing Res Rev. 32, 150-168 (2016).
  53. Heimer, S., Knoll, G., Schulze-Osthoff, K., Ehrenschwender, M. Raptinal bypasses BAX, BAK, and BOK for mitochondrial outer membrane permeabilization and intrinsic apoptosis. Cell Death Dis. 10 (8), 556(2019).
  54. Elena-Real, C. A., et al. Cytochrome c speeds up caspase cascade activation by blocking 14-3-3ε-dependent Apaf-1 inhibition. Cell Death Dis. 9 (3), 365(2018).
  55. Linfante, I., et al. Clinical and vascular outcome in internal carotid artery versus middle cerebral artery occlusions after intravenous tissue plasminogen activator. Stroke. 33 (8), 2066-2071 (2002).
  56. Farges, M. C., et al. Increased muscle proteolysis after local trauma mainly reflects macrophage-associated lysosomal proteolysis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282 (2), E326-E335 (2002).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Colorazione immunofluorescenteModello di ictus nel rattoOcclusione dell arteria cerebrale mediaNeuroprotezione della penombraEspressione della catepsina BColorazione TUNELRilevazione dell apoptosiAnalisi del tessuto cerebrale

Articoli correlati