Quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale all'interno e all'interno di biomateriali granulari in idrogel

Summary

Qui viene presentato un protocollo per la valutazione quantitativa della migrazione cellulare 3D all'interno e all'interno dell'interfaccia di idrogel granulari.

Abstract

Gli scaffold granulari in idrogel hanno un potenziale significativo nella medicina rigenerativa, funzionando sia come vettori per la consegna cellulare che come interfacce per l'integrazione tissutale. Questo articolo introduce due nuovi approcci per quantificare la migrazione cellulare all'interno e all'interno di idrogel granulari, evidenziando le diverse applicazioni di questi scaffold. In primo luogo, viene presentato un saggio di interfaccia monostrato cellulare che simula la crescita dei tessuti in idrogel granulari a scopo di integrazione. In secondo luogo, viene descritto un saggio basato su sferoidi, progettato per tracciare il movimento cellulare all'interno della matrice di idrogel, specificamente adatto per applicazioni che coinvolgono la consegna cellulare. Entrambi i metodi consentono misurazioni precise e controllate della migrazione cellulare, fornendo un kit di strumenti completo per i ricercatori che utilizzano scaffold granulari in idrogel. La motivazione di questi metodi deriva dalla necessità di un controllo personalizzato sulla migrazione cellulare all'interno dell'impalcatura per allinearsi con applicazioni specifiche. Ottimizzando e standardizzando queste tecniche di quantificazione, i ricercatori possono affinare iterativamente le proprietà granulari dell'idrogel, garantendone l'efficacia in diversi contesti di medicina rigenerativa. Questo robusto set di strumenti quantitativi offre nuove opportunità per migliorare gli scaffold granulari in idrogel, promuovendone l'uso sia nella somministrazione cellulare che nelle applicazioni di integrazione tissutale.

Introduction

I biomateriali per applicazioni terapeutiche si stanno evolvendo sempre più verso modelli più complessi e rilevanti di ambienti cellulari per studiare l'integrazione tissutale. Gli scaffold di biomateriali forniscono una struttura tridimensionale (3D) per la crescita cellulare e mirano a imitare un tessuto desiderato ^1,2. I modelli tridimensionali di coltura cellulare includono matrici naturali e scaffold sintetici che forniscono alle cellule un'ulteriore complessità tramite segnali aptotattici o chemiotattici ^3,4. Gli scaffold tradizionali in idrogel sono reticolati in massa, producendo una rete nanoporosa che consente la diffusione di piccole molecole ^5,6, ma richiede la degradazione per la migrazione su scala cellulare in un'area tissutale che necessita di riparazione⁷. Gli idrogel granulari sono un sottoinsieme di biomateriali che hanno un alto potenziale per la traduzione clinica grazie alla loro biocompatibilità, capacità di conformarsi a forme irregolari e, in molti casi, alla loro iniettabilità ^8,9. La loro natura costitutiva offre il vantaggio della porosità su scala cellulare per migliorare l'infiltrazione tissutale e l'angiogenesi, nonché la modularità, che consente l'aggiunta di segnali eterogenei per il comportamento cellulare 10,11,12. Comprendere la risposta e il movimento delle cellule all'interno di un'impalcatura 3D è fondamentale per la rilevanza fisiologica in tutte le applicazioni che utilizzano biomateriali per l'integrazione dei tessuti.

Lo studio della crescita tissutale in tre dimensioni, tuttavia, si è dimostrato difficile da realizzare con precisione quantitativa. La complessità estesa di un ambiente 3D richiede modelli in vitro di migrazione cellulare in grado non solo di fornire informazioni sul comportamento delle cellule, ma anche di ottimizzare le condizioni dei materiali. Rapporti precedentemente pubblicati sulla migrazione cellulare di scaffold granulare 3D hanno utilizzato la semina topica per esplorare il comportamento cellulare, riportando l'infiltrazione nella struttura porosa e nella morfologia cellulare¹³ e altri germogli sferoidi^14,15, misurando la lunghezza della crescita e il numero di germogli. Le lunghezze di migrazione topica della semina possono essere influenzate in modo non uniforme dalle forze di gravità e, a causa delle limitazioni della microscopia, i risultati non possono essere longitudinali. Il metodo di germinazione degli sferoidi è stato limitato alla quantificazione 2D tramite proiezione massimale, che non è in grado di catturare il meccanismo dell'invasione controllata. Entrambi i metodi sono misurati in un piano xy, che manca della sfumatura necessaria per ricapitolare completamente il movimento cellulare 3D e l'infiltrazione dell'impalcatura.

Questo protocollo descrive due approcci per quantificare la migrazione cellulare, come l'infiltrazione in vitro negli scaffold porosi di idrogel granulare 3D, in particolare utilizzando scaffold MAP (Microporous Annealed Particell) 16,17,18,19. Lo scopo dei seguenti metodi è quello di studiare il comportamento cellulare in gel granulari controllando la direzionalità della loro migrazione per l'analisi tridimensionale. Il primo approccio, MAMA (Ascending Migration Assay) basato su monostrato, è un modello semplificato di integrazione cellulare endogena che illustra le interazioni uniformi cellula-materiale e funge da piattaforma per rappresentare l'ambiente iniziale in cui le cellule si interfacciano con gli idrogel granulari e per isolare il comportamento individuale prima dell'infiltrazione dello scaffold. Il secondo, chiamato metodo PLOSMA (Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay), è un saggio 3D di migrazione degli sferoidi cellulari, che esplora il movimento cellulare quando è completamente circondato da un ambiente di scaffold complesso e modella il movimento cellulare dopo la consegna, nonché il movimento dopo che le cellule sono completamente entrate in un gel granulare.

Entrambi i metodi sono quantificabili mediante analisi di immagini 3D e possono essere applicati allo studio e all'ottimizzazione delle interazioni materiale-cellula utilizzando punti temporali longitudinali per applicazioni di medicina rigenerativa e ingegneria tissutale, in cui la promozione o la limitazione del movimento cellulare rientra nei criteri di progettazione. Inoltre, questi metodi sfruttano la centrifugazione su piastra per una preparazione uniforme di saggi multi-pozzetto.

Protocol

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione di idrogel granulare

NOTA: Le particelle MAP utilizzate in questo protocollo sono gel al 3,2% in peso p/v con 45,88 mg/mL PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/mL RGD, 8,06 mg/mL MethMal¹⁹ e 5,62 mg/mL MMP-2 reticolante degradabile. La rigidità meccanica del gel è di 15-20 kPa per corrispondere alla rigidità cutanea¹⁷.

1. Generare particelle granulari di idrogel e prepararsi normalmente per la coltura cellulare.
   NOTA: Questo protocollo descrive la preparazione sterile di gel di particelle ricotte microporose, la cui produzione è descritta in dettaglio da Roosa et ^al.18.
2. Preparare le particelle di idrogel granulare per l'uso in vitro sterilizzandole con tre lavaggi di alcol isopropilico al 70% seguiti da tre lavaggi di 1x PBS sterile.
3. Preparare un 0,2 mM sterile di litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) in soluzione di terreno sciogliendo la polvere di LAP in acqua ultrapura e facendo passare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,22 μm. Aggiungere questa soluzione 1:1 v/v con la quantità di gel necessaria per condurre l'esperimento.
4. Incubare la soluzione di LAP 0,2 mM, gel e terreno di coltura a 37 °C su un rotatore per provette a 20 giri/min per almeno 30 minuti prima di procedere per consentire la diffusione del LAP in tutte le microparticelle.
5. Trascorsi 30 minuti, centrifugare la sospensione di particelle a 18.000 x g per 5 minuti a 25 °C. Aspirare il surnatante.
   NOTA: La secchezza complessiva delle particelle di MAP può variare a causa di differenze nella chimica, nell'idrofilia e nella dimensione delle particelle. Per garantire l'uniformità, è consigliabile centrifugare la sospensione di particelle come descritto, mescolare le particelle nella provetta utilizzando una pipetta a spostamento positivo e quindi ripetere la fase di centrifugazione.

2. Metodo MAMA (Ascending Migration Assay) basato su monostrato: coltura cellulare e imaging

NOTA: Le cellule sono state visualizzate utilizzando il canale FITC (488 nm). Il colorante utilizzato per le celle aveva un'eccitazione a 492 nm e un'emissione a 517 nm. L'ingrandimento 10x fornisce maggiori dettagli rispetto all'ingrandimento 4x, ma entrambi possono essere utilizzati.

1. Scongelare i fibroblasti dermici umani (HDF) secondo il protocollo del produttore. Passaggio secondo necessità fino al raggiungimento del passaggio desiderato; generalmente, le cellule primarie mantengono la composizione genetica e fenotipica attraverso P5.
2. Piastra 120.000 cellule/cm² per almeno n = 6 in una piastra da 96 pozzetti o in una piastra della dimensione desiderata utilizzando il volume di terreno consigliato per pozzetto per la sospensione, aspirando delicatamente prima di ogni aggiunta. Lasciare che le cellule si attacchino durante la notte, come mostrato nella Figura 1A, il risultato sarà una confluenza di circa l'80% il giorno successivo.
   NOTA: In generale, i pozzetti della colonna centrale e della fila sono i migliori per una diffusione ottimale del gel. Gli autori utilizzano fino a 24 pozzetti per una piastra a 96 pozzetti (righe B-G e colonne 5-8).
3. Preparare le condizioni del gel come indicato sopra e, durante l'incubazione in LAP, rimuovere il terreno con un aspiratore o una pipetta dalla piastra a pozzetti delle cellule. Fare attenzione a non disturbare il fondo della piastra.
4. Aggiungere il colorante di tracciamento cellulare ai pozzetti secondo le istruzioni del produttore, rappresentate nella Figura 1B. Assicurarsi che il gel sia completamente preparato come descritto al punto 1 prima di aspirare il colorante di tracciamento cellulare dai pozzetti.
5. Aggiungere 20 μl di ciascuna condizione di gel ai pozzetti con una pipetta a spostamento positivo senza toccare il fondo della piastra.
   NOTA: Le migliori condizioni di analisi si verificano quando il gel viene pipettato direttamente al centro del pozzetto.
6. Utilizzando un centrifugo a rotore rotante a piastre a 25 °C, centrifugare a 100 x g per 15 s con accelerazione e decelerazione di 8 per appiattire il gel. Capovolgere la piastra di 180° e ruotare di nuovo a 100 x g per 15 s per garantire una distribuzione uniforme del gel sul fondo del pozzetto, come mostrato nella Figura 1C.
7. Fotoreticolare in modo asettico il gel dall'alto (Figura 1D) applicando una luce focalizzata (365 nm, 34,4 mW/cm²) al campione per 30 s per ricuocere lo scaffold, aggiungendo 200 μL di terreno a ciascun pozzetto di cellule dopo che tutti gli scaffold si sono formati. Lasciare incubare le cellule a 37 °C per 30 minuti per consentire loro di attaccarsi all'impalcatura granulare prima dell'imaging.
8. Per catturare il comportamento di migrazione riassunto nella Figura 1E, visualizzare le cellule utilizzando un microscopio confocale. Trova il punto di messa a fuoco più basso per un'area della lastra in cui le celle sono confluenti almeno all'80% e impostalo come bordo inferiore dello z-stack.
   1. Trova il punto più alto del segnale fluorescente della cella e impostalo come bordo superiore dello z-stack. Utilizzare un passo di 5 μm o inferiore per ottenere la migliore risoluzione.
9. Immagine di almeno tre pozzetti per rappresentare il monostrato cellulare e le altezze delle cellule non migratorie. Il punto temporale t = 0 è mostrato sia dalla vista dall'alto che dalla vista laterale nella Figura 2A. Incubare per una notte dopo il completamento dell'imaging.
   NOTA: Queste cellule sono state acquisite con un obiettivo 4x e l'esposizione è stata mantenuta costante per tutti i pozzetti.
10. A t = 24 h, le cellule inizieranno a risalire attraverso l'impalcatura granulare, come si vede nella Figura 2B dalle viste dall'alto e lateralmente. Ripetere i passaggi di imaging eseguiti per t = 0 h utilizzando gli stessi parametri. Utilizza l'altezza precedente dello stage come riferimento o trova le celle che non sono ancora migrate e impostala come bordo inferiore dello z-stack.
11. Ripetere i passaggi per tutti i pozzetti, assicurandosi che ogni pozzetto venga salvato come immagine separata per facilitare l'analisi.
    NOTA: I punti temporali possono essere ripresi per punti temporali più lunghi a seconda dei vincoli sperimentali e del metodo di fluorescenza a tracciamento cellulare.
12. Gli scaffold possono essere fissati e colorati per ulteriori metriche. Al momento della fine desiderato, aspirare il terreno dai pozzetti con una pipetta e gettarlo. Lavare delicatamente ogni pozzetto con 200 μL di PBS sterile due volte per 5 minuti ciascuno. Aggiungere 200 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti, quindi aspirare e gettare. I pozzetti possono essere colorati immediatamente o conservati a 4 °C in 1x PBS per un massimo di una settimana.

3. Metodo MAMA (Ascending Migration Assay) basato su monostrato: analisi di immagini 3D

1. Per le conversioni batch, aprire il software di conversione immagini IMARIS. Trascina e rilascia le immagini al microscopio nel software di conversione e scegli una cartella all'interno del software Arena da importare. Premi Avvia tutto. Le immagini convertite appariranno nell'Arena come file .ims.
   NOTA: Se la dimensione del voxel non è inclusa nei metadati dell'immagine, fare riferimento alle specifiche dell'imaging confocale individuale per trovare il valore. In alternativa, la dimensione del voxel può essere approssimata come la dimensione del passo utilizzato durante l'imaging.
2. Aprire il software facendo doppio clic sull'icona IMARIS Arena sul desktop e selezionando un'immagine dall'Arena.
3. L'immagine viene caricata automaticamente nella scheda di analisi "Vista 3D" visualizzata nel pannello delle icone della barra degli strumenti in alto. Fare clic sulla scheda Attivazione immagine nella barra degli strumenti principale.
4. In alto a sinistra del pannello laterale, fai clic sul menu a discesa per il canale 1 e seleziona Sottrazione sfondo. Premere Ok nella parte inferiore del pannello per tornare a 'Vista 3D'. Le immagini rappresentative per t = 0 h e t = 24 h si trovano rispettivamente nella Figura 2A, B.
5. Nella piccola barra degli strumenti appena sopra il menu del pannello laterale, fai clic sull'icona con forme blu arrotondate, Aggiungi nuove superfici, per creare una scheda di oggetti modificabile denominata "Superfici 1".
6. Si aprirà un'interfaccia per la creazione dei parametri, le impostazioni dell'algoritmo verso la parte inferiore del pannello del menu. Generare manualmente i parametri da utilizzare per tutte le repliche facendo clic sul pulsante freccia blu nella parte inferiore dell'interfaccia. Assicurati che sia selezionato il canale sorgente corretto e seleziona la casella "Smooth".
   1. Impostate il dettaglio della superficie su 0,7 μm e selezionate Sottrazione sfondo (contrasto locale). Digita la lunghezza media della cella nella casella 'Diametro della sfera più grande che entra nell'oggetto'. Premi la stessa freccia blu in basso al termine.
      NOTA: Questo valore può essere stimato utilizzando la scheda 'Sezione' nella barra degli strumenti e misurando la larghezza media delle celle.
7. Per la soglia determinare, determinare l'istogramma dell'intensità in cui vengono segmentate solo le celle più luminose. Usando l'affettatrice, spostati su e giù nella pila di immagini per assicurarti che sia il più accurata possibile.
   1. Selezionare Abilita per 'Dividi oggetti a contatto (crescita della regione)' e impostare il diametro dei punti di partenza sullo stesso diametro utilizzato in precedenza. Assicurati che la soglia "Basata sull'intensità" sia selezionata e fai clic sul pulsante freccia destra blu.
8. I due passaggi successivi, Filtra i punti di partenza e le superfici filtranti, possono essere regolati da diverse misurazioni per garantire che le superfici generate siano accurate; Tuttavia, l'analisi di base non richiede ulteriori filtri. Quando non sono necessarie modifiche, fare clic sul pulsante freccia blu .
   NOTA: Il passaggio finale consente un'ulteriore classificazione della superficie a seconda dell'output desiderato. Dopo aver apportato le modifiche, fare clic sul pulsante freccia verde per completare la creazione delle superfici.
9. Per salvare i parametri di creazione per l'analisi batch, fare clic sull'icona della bacchetta Creazione. Fare clic su Memorizza parametri per batch e assegnargli un nome, quindi fare clic su Ok. Le immagini elaborate rappresentative per t = 0 e t = 24 h sono mostrate rispettivamente nelle Figure 2C,D.
   NOTA: Tutti gli oggetti all'interno di una "Superficie" selezionata possono essere classificati in set in base a varie proprietà fornite dal software di conversione delle immagini, come l'area della superficie, il volume, l'intensità e la distanza da altre superfici create.
10. Le proprietà della superficie si trovano selezionando la scheda Statistiche . Per raccogliere tutte le altezze delle celle, fare clic sulla scheda Dettagli e selezionare Valori specifici e Posizione Z dai menu a discesa successivi. Fare clic sulla singola icona Salva per salvare tutte le posizioni z e le eventuali classificazioni effettuate in un file .xls. Ripetere l'operazione per tutte le immagini.
11. Trova la posizione z mediana delle cellule non migranti dall'immagine rappresentativa e sottrai bene tutte le posizioni z al di sotto di quel numero da ciascuna condizione di test.
    NOTA: I valori di migrazione sono riportati come medie delle mediane per ogni condizione di replica tecnica al di sopra dell'altezza della cella non migrante. Possono essere riportati come altezza mediana, vista nella Figura 3A, o come variazione di piega nell'altezza di migrazione per il punto temporale desiderato rispetto a t = 0, visto nella Figura 3B.

4. Metodo PLOSMA (Parallel Layered Outward Sferoid Migration Assay): coltura cellulare e coltura di goccioline sospese per sferoidi 3D

NOTA: Questo protocollo descrive la coltura cellulare e la coltura a goccia sospesa adattata dal protocollo scritto da Nandi et ^al.14.

1. Scongelare gli HDF secondo il protocollo del produttore. Passaggio secondo necessità fino al raggiungimento del passaggio desiderato.
2. In una cappa per colture cellulari asettiche, preparare una capsula di Petri aggiungendo 10 ml di PBS sul fondo e capovolgendo il coperchio in modo che l'esterno poggi sopra la cappa per colture cellulari.
3. Aggiungere il volume appropriato di cellule (determinato dalla conta cellulare) in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere il colorante di tracciamento cellulare diluito nel terreno. Portare il volume totale a 1 ml con terreno riscaldato.
   NOTA: Gli sferoidi dovrebbero essere circa 8000 cellule per sferoide, ma possono cambiare in base al tipo di cellula.
4. Incubare la soluzione cellulare per 45 minuti a 37 °C. Far girare le celle verso il basso secondo la velocità consigliata dal produttore e aspirare il surnatante.
5. Risospendere le cellule in metilcellulosa 1:100 in terreno.
6. Pipettare 20 μL di goccioline della soluzione cellulare/media sul coperchio della capsula di Petri.
7. Capovolgere il coperchio con sicurezza, rapidamente e con attenzione e posizionarlo sopra la metà inferiore della capsula di Petri contenente PBS.
8. Incubare le goccioline per almeno 24 ore.
   NOTA: La formazione di sferoidi può essere monitorata mediante microscopia a campo chiaro.

5. Metodo del saggio di migrazione degli sferoidi verso l'esterno a strati paralleli (PLOSMA): semina di sferoidi cellulari su idrogel granulare

NOTA: Il seguente processo è riassunto nella Figura 4A.

1. Per impostare il metodo PLOSMA descritto nella Figura 4A, aggiungere asetticamente 15 μl di gel utilizzando una pipetta a spostamento positivo ai pozzetti in una piastra trasparente a 96 pozzetti.
2. Utilizzando un accessorio per centrifuga a rotore rotante a piastre, centrifugare a 1000 x g per 10 s per appiattire il gel. Capovolgere la piastra di 180° e girare di nuovo a 1000 x g per 10 s per garantire una distribuzione uniforme del gel sul fondo del pozzetto.
3. Una volta raggiunta la planarità uniforme, fotoreticolare asetticamente il gel dall'alto applicando una luce focalizzata (365 nm, 33,4 mW/cm²) al campione per 30 s per ricuocere l'impalcatura.
4. Spostare asetticamente la capsula di Petri di goccioline sospese nella cappa di coltura tissutale asettica e capovolgere il coperchio.
5. Utilizzando una pipetta da 20 μl, aspirare lentamente una gocciolina fino a quando lo sferoide non entra nel puntale della pipetta. Espellere la gocciolina sull'impalcatura al centro del pozzo.
6. Ripetere i passaggi precedenti per tutti i pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzetto abbia uno sferoide confermando con la microscopia in campo chiaro o a fluorescenza.
7. Incubare la piastra a pozzetti a 37 °C per 2 ore per consentire agli sferoidi di attaccarsi all'impalcatura.
8. Pipettare altri 15 μl di gel sopra ogni sferoide. Per garantire una distribuzione uniforme del gel, centrifugare la piastra a 300 x g per 15 s in ciascuna direzione.
9. Ricuocere lo strato superiore di gel per 30 s utilizzando la luce UV (365 nm) a 33,4 mW/cm². Pipettare il terreno sulla parte superiore di ogni impalcatura per portare il volume totale del pozzetto a 200 μl.
   NOTA: A questo punto gli scaffold saranno molto asciutti, quindi aggiungere il terreno goccia a goccia lungo il lato del pozzetto per evitare di staccare lo sferoide.

6. Metodo del saggio di migrazione degli sferoidi verso l'esterno a strati paralleli (PLOSMA): imaging confocale di sferoidi

NOTA: La facilità di imaging dipende dal sistema di imaging. Localizzare lo sferoide all'interno del pozzo con un tempo di esposizione basso. Le cellule sono state visualizzate utilizzando il canale FITC (488 nm). Il colorante utilizzato per le celle aveva un'eccitazione a 492 nm e un'emissione a 517 nm. L'ingrandimento 10x offre maggiori dettagli rispetto all'ingrandimento 4x.

1. Trova il livello di fase più basso (altezza z) in cui le celle sono ancora a fuoco. Impostalo come limite inferiore dello z-stack.
2. Trova il livello di fase più alto (altezza z) in cui le celle sono ancora a fuoco. Impostalo come limite superiore dello z-stack.
   NOTA: I migliori risultati di imaging includono una dimensione del passo inferiore o uguale a 5 μm per mantenere la risoluzione su scala cellulare. A seconda del sistema di microscopio confocale, possono esserci dei compromessi tra velocità di imaging e risoluzione.
3. Immagine di tutti gli sferoidi come descritto a t = 0 e 24 h. Un punto temporale di 48 ore può anche essere ripreso a seconda dei vincoli sperimentali. Nella Figura 4B si vedono immagini rappresentative di proiezione massimale di t = 0 e t = 24.

7. Metodo del saggio di migrazione degli sferoidi verso l'esterno a strati paralleli (PLOSMA): analisi di immagini 3D

1. Importare le immagini nel software di analisi come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.4. Nell'angolo in alto a destra del pannello di sinistra, fai clic sul menu a discesa per il canale 1 e seleziona Sottrazione sfondo. Premere Ok nella parte inferiore del pannello.
2. Una volta tornati alla vista 3D, premere Regolazione automatica di tutti i canali nella finestra popup Regolazione schermo e correggere se necessario.
3. Nella barra degli strumenti più piccola appena sopra il menu laterale, fare clic sull'icona Aggiungi nuovo piano di riferimento mostrata nella Figura 5A con tre frecce ortogonali per aggiungere una nuova scheda chiamata "Piano di riferimento 1".
4. Spostare l'origine al centro dello sferoide in tutti e tre i piani, come visualizzato nella Figura 5B.
5. Nella stessa barra degli strumenti delle tre frecce ortogonali, fai clic sull'icona con le sfere arancioni e aggiungi nuovi punti per creare una scheda chiamata "Punti 1". Premere il pulsante freccia blu.
6. In Rilevamento spot, impostare il diametro XY stimato sul diametro stimato delle celle. Premere il pulsante freccia blu.
   NOTA: Per gli HDF, questo numero è 15,0 μm.
7. Per la soglia di soglia, regolare l'istogramma dell'intensità in modo da circondare solo le parti più luminose. Usando l'affettatrice, spostati su e giù nella pila di immagini per assicurarti che sia il più accurata possibile. Premi la freccia blu successiva.
8. Premere il pulsante verde Esegui per terminare l'analisi.
9. Deseleziona Rendering su affettatrice o fai clic sull'icona quadrata gialla sul lato destro del pannello di configurazione.
10. Fare clic sulla scheda Statistiche . Nel primo menu a discesa, seleziona Valori specifici. Nel secondo menu a discesa, selezionare Distanza dal piano di riferimento di origine. Verranno visualizzati tutti i valori per le superfici selezionate, come illustrato nella Figura 5C. Fare clic sull'icona di salvataggio singolo, che consente di scaricare un file .xls.
11. Salvare le modifiche apportate all'immagine e alle analisi premendo l'icona Salva nella barra degli strumenti principale. La Figura 6A rappresenta un rendering 3D di uno sferoide ripreso a 24 ore, mentre la Figura 6B rappresenta la funzione IMARIS Spots che contrassegna le celle diffuse, codificate a colori in base alla distanza dal sistema di riferimento di origine.
12. Normalizza i dati esportati nelle immagini t = 0 e calcola la media della distanza cellulare percorsa e l'altezza z per ogni sferoide per ottenere un singolo valore per ogni campione. Le figure 7A, B illustrano grafici rappresentativi per ciascun output, rispettivamente.

Results

Questo protocollo mira a dettagliare i passaggi necessari per due nuovi saggi di migrazione granulare degli scaffold . Il metodo MAMA può essere utilizzato per valutare l'infiltrazione cellulare in un'interfaccia tissutale. Gli idrogel granulari sono un sistema più complesso rispetto agli idrogel sfusi e, pertanto, sono intrinsecamente più complessi da elaborare per la migrazione ^9,20. È importante comprendere il processo graduale descritto nella Figura 1. Ogni passaggio si basa sul successivo ed è stato ottimizzato in questo protocollo. La semina di HDF a una densità di 120.000 cellule/cm² si tradurrà in almeno l'80% di confluenza durante la notte (Figura 1A) e queste cellule non fluorescenti sono meglio etichettate con il colorante di tracciamento cellulare il giorno dell'esperimento per massimizzare il potenziale di imaging (Figura 1B). Questo protocollo corrisponde alla minore forza centrifuga utilizzata nel passaggio dell'HDF per mantenere la vitalità cellulare. A causa dell'angolo che si produce per una singola fase di centrifugazione, è necessario capovolgere la piastra di 180° per garantire che il gel si sposti per coprire completamente la superficie inferiore dei pozzetti (Figura 1C). Lasciare che le cellule si riprendano nell'incubatore per 30 minuti dopo la ricottura (Figura 1D) manterrà la vitalità cellulare e si tradurrà in una migrazione ottimale (Figura 1E). Un'ampia area di una piastra a 96 pozzetti può essere visualizzata con un obiettivo 4x e abbinata dal punto di tempo 0-24 ore (Figura 2A, B) per valutare ampiamente il comportamento cellulare. L'elaborazione delle immagini z-stack risultanti nel software di analisi fornisce analisi avanzate per più set di dati di grandi dimensioni in un'interfaccia facile da usare. Questo protocollo riassume i passaggi per creare set di dati per l'altezza della cella, o posizione Z, in ogni punto temporale visualizzato con le immagini rappresentative nella Figura 2B, C. L'analisi dei dati elaborati è illustrata nella Figura 3A, visualizzata utilizzando la media delle altezze mediane e la loro deviazione standard di ciascun punto temporale, mentre l'altezza di variazione della piega dalle celle non in migrazione a t = 0 h è mostrata nella Figura 3B. I dati sottostanti di questo metodo sono in genere distribuiti in modo non normale, quindi le mediane sono misure più robuste per il confronto e vengono quindi utilizzate per riassumere i dati.

Allo stesso modo, il metodo PLOSMA può essere utilizzato per valutare la motilità delle cellule consegnate all'interno di uno scaffold di idrogel granulare 3D. La Figura 4A delinea i passaggi del metodo PLOSMA ed è particolarmente importante seminare lo sferoide al centro del pozzetto. Si consiglia di centrare lo sferoide nel campo visivo, ma dipende dalle capacità del microscopio. La Figura 4B mostra immagini rappresentative della diffusione degli sferoidi per t = 0 h e t = 24 h scattate con un ingrandimento di 10x nel canale FITC (488 nm). Nel software, è possibile creare un piano di riferimento di origine e regolarlo per ogni z-stack (Figura 5A, B). Il software è in grado di tracciare la distanza radiale dal sistema di riferimento di origine ed esportarlo come set di dati desiderato (Figura 5C). La Figura 6A mostra un'immagine rappresentativa del rendering 3D dello sferoide t = 24 h, mentre la Figura 6B mostra la funzione Spot del software. Un esempio dei dati elaborati è mostrato nella Figura 7. La Figura 7A rappresenta la distanza media percorsa dal centro normalizzata alle distanze del Giorno 0. La Figura 7B isola le distanze percorse solo nel piano z, poiché questa è la direzione che il metodo PLOSMA mira a studiare.

Figura 1: Saggio di migrazione ascendente basato su monostrato Coltura cellulare e imaging. Schema delle fasi principali dell'elaborazione di cellule e gel per MAMA. (A) Le cellule vengono coltivate fino alla confluenza durante la notte e (B) il colorante di tracciamento cellulare viene aggiunto appena prima dell'aggiunta del gel granulare. Lo scaffold viene assemblato tramite centrifugazione a piastre (C) e stabilizzato con fotoreticolazione (D). L'imaging in più punti temporali consente (E) la visualizzazione della migrazione cellulare verso l'alto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Elaborazione delle immagini MAMA. Immagini rappresentative dell'elaborazione delle immagini. Confronto tra vista dall'alto e laterale di immagini confocali grezze a (A) t = 0 e (B) t = 24 ore nel canale FITC con ingrandimento 4x. (B) Confronto della vista dall'alto e laterale delle altezze Z della posizione della cella elaborata a (C) t = 0 e (D) t = 24 h. L'elaborazione per 24 ore include la sottrazione delle altezze z mediane non migranti. Barre di scala = 500 μm. Abbreviazioni: MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi dell'output della migrazione cellulare MAMA. (A) Posizione mediana Z e deviazione standard delle altezze cellulari in ciascuna replica (n = 6) ai punti temporali t = 0 (27,0 μm ± 1,4 μm) e t = 24 h (46,6 μm ± 10,8 μm). (B) Migrazione delle cellule a 24 h normalizzata a 0 h e riportata come fold change (1,8 ± 0,4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Coltura cellulare e imaging del saggio di migrazione degli sferoidi verso l'esterno a strato parallelo (PLOSMA). (A) Schema che descrive le fasi della stratificazione dello scaffold (B) Proiezioni di intensità massima dello sferoide prese a 0 e 24 h. Le immagini sono state scattate tramite microscopia fluorescente confocale nel canale FITC (488 nm) con ingrandimento 10x. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: PLOSMA = Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Creazione di un nuovo piano di riferimento di origine. (A) Il pulsante del nuovo piano di riferimento di origine è delineato da un riquadro rosso. (B) La nuova origine è impostata per essere al centro dello sferoide in tutte e tre le dimensioni. (C) Le metriche di output mostrate sono le distanze delle superfici delle celle dal sistema di riferimento di origine, che descrive la distanza di migrazione delle celle dal centro. Barra della scala = 120 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Rendering 3D dello sferoide incorporato a 24 h. (A) Sferoide elaborato nello spazio 3D. (B) Il centro dello stesso sferoide è stato determinato utilizzando la funzione del sistema di riferimento dell'origine in IMARIS, e la diffusione delle celle è codificata a colori in base alla distanza dall'origine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Esempi di output per PLOSMA. (A) Esempi di risultati PLOSMA che mostrano la distanza percorsa in μm. La distanza media percorsa è stata di 240,8 μm ± 36,87 μm. (B) Variazione di piega dell'altezza Z (t_f/t₀) della germinazione degli sferoidi. La variazione media delle pieghe è stata di 3,82 ± 1,495. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo descrive due modelli in vitro per la caratterizzazione della migrazione cellulare in 3D per la guarigione delle ferite e l'integrazione tissutale. Il primo modello, il saggio di migrazione basato su monostrato, si basa su cellule correttamente attaccate e confluenti. Questo protocollo è stato sviluppato con un tipo di cellula fibroblastica e ottimizzato con una densità di semina di 1,20,000 cellule/cm². Questa densità consente alle cellule di crescere durante la notte fino ad almeno l'80% di confluenza in modo uniforme sul fondo della piastra a pozzetti. Questo passaggio garantisce la migrazione nella direzione z entro almeno 24 ore; Se la confluenza è troppo bassa dopo l'aggiunta dello strato di gel, le cellule possono continuare a diffondersi attraverso la plastica di coltura tissutale e nel gel, determinando un modello di migrazione non uniforme e rallentato, che è stato osservato durante l'ottimizzazione. Altezze di migrazione irregolari possono ancora essere osservate in aree di cellule meno dense, anche all'80% di confluenza. Le repliche ridurranno bene il rumore di questi comportamenti cellulari. Cellule eccessivamente confluenti possono causare il sollevamento delle cellule durante il periodo di centrifugazione e potenzialmente la morte cellulare. Questa variabilità viene affrontata mediante il seeding a un numero costante di celle e l'acquisizione di un'area dell'immagine coerente per consentire confronti di dati appropriati. Per quanto ne sa l'autore, la centrifugazione su piastra non è stata pubblicata per l'appiattimento del gel, ma la centrifugazione è comunemente usata per il passaggio cellulare e la manipolazione della biomateria^21,22. La regolazione della velocità in modo che corrisponda alla velocità di passaggio manterrà la vitalità cellulare per un'ulteriore elaborazione ottimale delle cellule.

La sfida principale di questo metodo è massimizzare la risoluzione e la profondità dell'imaging, riducendo al minimo il tempo di imaging per garantire la migliore analisi. Il colorante di tracciamento delle celle verdi è sufficientemente luminoso per l'imaging di un pozzetto a 96 pozzetti con un passo di 5 μm o inferiore e fino a 1000 ms di tempo di esposizione. Abbassando il tempo di esposizione si riduce la quantità di tempo in cui le cellule non si trovano in condizioni di incubazione, ma si riduce anche la risoluzione. Questi parametri devono essere ottimizzati in base al singolo microscopio, ma la variabilità viene ridotta garantendo che tutte le immagini vengano acquisite con le stesse impostazioni all'interno di uno studio.

Una nota importante per l'analisi dei MAMA è che richiede l'eliminazione delle cellule all'altezza del monostrato o al di sotto di essa per garantire che solo le cellule in migrazione siano prese in considerazione per i test statistici. Di conseguenza, le mediane dei pozzetti replicati sono riportate a causa della natura di distribuzione non gaussiana delle posizioni cellulari dopo il filtraggio. Il confronto tra i gruppi può essere visualizzato con un istogramma e le mediane possono essere analizzate statisticamente con un test non parametrico.

Nonostante queste sfide, il metodo di migrazione verso l'alto basato su monostrato è, nella sua forma più semplice, un saggio riproducibile per l'infiltrazione cellulare 3D di scaffold porosi. Per studiare gli effetti meccanicistici della migrazione cellulare, assicurarsi che i parametri corrispondano al tipo di cellula da studiare. Ciò può includere l'aggiunta di componenti chemiotattici o aptotattici, all'interno del gel o nel terreno. I terreni completi di fibroblasti dermici umani includono chemochine migratorie, ma altri tipi di cellule che utilizzano segnali più specifici richiedono un adattamento del test di conseguenza. Questo test si presta a testare più tipi di variabili; Tuttavia, l'ambito di applicazione di tali misure non è contemplato dal presente protocollo. Il MAMA fornisce un ambiente fisiologicamente rilevante analogo al movimento cellulare dal tessuto di massa a un idrogel poroso iniettato in vivo.

Per il metodo PLOSMA, il posizionamento degli sferoidi al centro dell'impalcatura è fondamentale per il successo dell'imaging e per una migrazione cellulare significativa in tre dimensioni. L'esatta semina dello sferoide al centro del gel dipende dall'utente. A tal fine, stabilizzare la pipetta sul cilindro con la mano non dominante dell'utente aiuta il centraggio e l'efficacia della posizione di semina può essere confermata utilizzando la microscopia a campo chiaro o a fluorescenza. Uno sferoide decentrato può essere rimediato con un secondo tentativo con un nuovo sferoide, sia sullo stesso scaffold che su un nuovo scaffold. Per questo motivo, gli autori raccomandano di creare più sferoidi del necessario e di preparare più gel MAP del necessario.

La fase di centrifugazione del secondo strato assicura che lo sferoide sia (1) coperto uniformemente dal gel e (2) in grado di diffondersi uniformemente verso l'alto e verso il basso nel gel, il che è fondamentale per studiare le cellule consegnate. La centrifugazione può anche causare lo spostamento dello sferoide dal centro verso i bordi del pozzetto e, sebbene questo protocollo limiti questo fenomeno ottimizzando le fasi di centrifugazione e il volume del gel utilizzato per ogni strato (15 μL) per una distribuzione uniforme, non elimina completamente il suo movimento. Potrebbe essere necessario regolare l'esatta velocità di centrifugazione e i tempi necessari per ridurre il movimento degli sferoidi in base al modello della centrifuga; Tuttavia, le specifiche descritte in questo protocollo possono essere utilizzate come punto di riferimento per l'ottimizzazione individuale. Un altro approccio consiste nel lasciare agli sferoidi 2 ore di incubazione per attaccarsi all'impalcatura prima di aggiungere il secondo strato di gel. Il movimento degli sferoidi è mitigato particolarmente bene quando vengono implementate entrambe le strategie. Infine, a causa del processo di centrifugazione in più fasi, questo metodo potrebbe non essere adatto per linee cellulari meno resistenti.

A parte la logistica della placcatura degli sferoidi con il metodo PLOSMA, ci sono limitazioni durante l'acquisizione delle immagini. Lo sferoide può essere ripreso utilizzando un ingrandimento 4x o 10x, ma per ottenere i migliori risultati, utilizzare un ingrandimento di almeno 10x e ridurre la dimensione del passo degli z-stack a 2-5 μm. L'ingrandimento dovrebbe essere costante per tutto lo studio. Il tempo di imaging aumenta con una risoluzione più elevata, quindi limita il numero di campioni in ciascuna piastra a pozzetti (4-8 pozzetti per piastra) per ridurre al minimo il tempo al di fuori dell'incubatore. Una configurazione di imaging dal vivo potrebbe anche migliorare il tracciamento e fornire maggiori informazioni.

Poiché gli idrogel granulari hanno una topologia e parametri di progettazione unici che includono volume intrinseco, porosità, resistenza meccanica e, in alcuni casi, bioattività, è necessario studiare il comportamento cellulare in relazione a questi aspetti con la massima fedeltà possibile. Il metodo PLOSMA è progettato per modellare il movimento cellulare dopo il parto o dopo che le cellule sono completamente entrate in un gel granulare. Poiché le cellule sono costrette a migrare attraverso i pori inerenti alla geometria granulare dell'idrogel, il metodo PLOSMA isola efficacemente la porosità come influenza sul comportamento cellulare. Le potenziali applicazioni di questo test sono la consegna di cellule in situ e l'integrazione tissutale all'interno di un'impalcatura granulare, in particolare nello spazio di guarigione delle ferite²³.

Entrambi i protocolli sono stati sviluppati con fibroblasti dermici umani primari a causa del ruolo della migrazione dei fibroblasti nella riparazione e nel rimodellamento dei tessuti ^4,24, tuttavia, il comportamento migratorio di qualsiasi cellula aderente può essere misurato in risposta all'alterazione dell'impalcatura porosa, comprese le aggiunte di fattori di crescita e la composizione superficiale/di massa del gel. Queste modifiche possono richiedere l'adattamento di questi test per ottenere risultati apprezzabili. I parametri che richiedono un'ulteriore ottimizzazione includono la densità di semina cellulare, la durata dell'esperimento e/o la pipeline di analisi. IMARIS è un potente strumento di analisi delle immagini che viene utilizzato per l'analisi della migrazione cellulare e ha funzionalità che vanno oltre a quanto descritto qui, che includono la classificazione di tutti gli oggetti all'interno di una "Superficie" selezionata in set basati su varie proprietà come l'area della superficie, il volume, l'intensità e la distanza da altre superfici create. Ci sono molte risorse online per determinare ulteriori metodi di analisi.

I due metodi qui descritti non solo affrontano lo stato iniziale di introduzione del tessuto a un materiale granulare in modo fisiologico, ma anche la successiva risposta cellulare quando è completamente incorporata nel materiale. Come per tutti i test di migrazione, le cellule presenti sono in grado di proliferare in parallelo al movimento, tuttavia il design dei test descritti non interrompe la proliferazione e quindi garantisce che non vi sia un impatto eccessivo sull'analisi. Entrambi i metodi sono compatibili con la colorazione degli endpoint oltre all'imaging longitudinale, che utilizza la fissazione PFA per rilevare metriche come citoscheletro, deposizione di collagene, proliferazione e altro ancora. L'uso dei metodi descritti si sposta verso una rappresentazione spazio-temporale più accurata della migrazione cellulare 3D che utilizza l'infiltrazione cellulare come parametro misurabile in contrasto con i metodi precedenti 1,6,14,15,25,26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Falloidina	ThermoFisher	A22287
Albumina sierica bovina	VWR International	332
CellTracker Colorante CMFDS verde, 1 mg	ThermoFisher	C2925	20 unità da 50 ug, 492/517 nm
Centrifuga	ThermoFisher	75016085	serie ST Plus
Piastra trasparente a 96 pozzetti	MilliPore Sigma	CLS3997-50EA
Dimetil solfossido	Fisher Scientific	MT-25950CQC	250 mL
Fibroblasti Basali Medium	ATCC	PCS-201-030	480 mL, senza fenolo rosso
Kit per la crescita dei fibroblasti - Basso siero	ATCC	PCS-201-041	7,5 mM L-glut, 5 ng/mL rh FGF basico, 5 ug/mL rh Insulina, 1 ug/mL Idrocortisone, 50 ug/mL Acido ascorbico, 2% FBS
FIJI (ImageJ)	NIH		Public accesso download
Fibroblasti dermici umani	ATCC	PCS-201-012	Fibroblasti dermici umani adulti
ImageXpress Micro	Confocal Molecular Devices		Microscopio confocale a disco rotante con ingrandimenti 4x, 10x
IMARIS	Oxford Instruments		Software di visualizzazione e analisi con immagini 3/4D,
incubatore	ThermoFisher	Finnpipette F2 Pipette a volume variabile	HeraCell Vios 160i Incubatore a CO2, 165L
M-20 Micropiastra Secchio oscillante Rotore	ThermoFisher	75003624
Metilcellulosa	Fisher Scientific	9004-67-5	Grado da laboratorio, in polvere,
provetta per microcentrifuga	Fisherbrand	05-408-129	Provette per microcentrifuga da 1,5 mL
Paraformaldeide (4%)	Alfa Aesar	AAJ19943K2	Per il fissaggio
Piastra di Petri	Corning	08-757-100A	Piastre di Petri batteriologiche con coperchio 35 x 10 mm
Pipette	ThermoFisher	4642080	Finnpipette F2 Pipette a volume variabile
PBS	sterile Gibco	10010-023
Triton-X	Fisher Scientific	327371000