Articolo metodologico

Approcci di Biologia Strutturale e Chimica Analitica per la Caratterizzazione degli Enzimi Metabolici C-Glicosidici nel Microbiota Intestinale Umano

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DOI:

10.3791/67629

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23 maggio 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Studi recenti evidenziano il ruolo degli enzimi del microbiota intestinale umano nella metabolizzazione dei glicosidi C. Qui, presentiamo una metodologia completa che integra tecniche di chimica analitica (LC-MS/MS e NMR) con approcci di biologia strutturale per caratterizzare sistematicamente le catene di reazione strutturali ed enzimatiche di questi enzimi che metabolizzano il glicoside C.

Abstract

Il microbiota intestinale è emerso come un modulatore chiave della salute dell'ospite, in particolare a causa della sua capacità di metabolizzare i glicosidi alimentari. Mentre i C-glicosidi dimostrano una stabilità chimica e una resistenza alla scissione enzimatica superiori rispetto agli O-glicosidi, i batteri intestinali specializzati possono metabolizzarli selettivamente, migliorando la loro biodisponibilità. Dall'identificazione degli enzimi microbici C-glicosidasi, i meccanismi di reazione precisi rimangono incompleti e le metodologie standardizzate per lo studio di questi processi non sono ancora ben consolidate. Per colmare questa lacuna, abbiamo introdotto un approccio multidisciplinare integrato che combina biologia strutturale, enzimologia e tecniche analitiche, tra cui cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e risonanza magnetica nucleare (NMR), per caratterizzare sistematicamente queste attività enzimatiche. Questo approccio completo consente una caratterizzazione precisa del metabolismo del glicoside C a livello molecolare, enzimatico e metabolico.

Introduzione

Recentemente, il microbiota intestinale umano ha guadagnato notevole attenzione per il suo ruolo cruciale nel supportare la salute dell'ospite 1,2. Queste comunità microbiche metabolizzano i composti derivati dall'ospite, producendo metaboliti biologicamente attivi 1,2,3. Ad esempio, i flavonoidi, tra i composti naturali più abbondanti nella nostra dieta quotidiana, esistono principalmente come glicosidi O o C, che a loro volta sono scarsamente assorbiti nell'intestino umano4. Tuttavia, il microbiota intestinale può trasformare questi glicosidi in derivati più bioattivi, come glicosidi secondari o agliconi, riducendone la solubilità e migliorandone l'assorbimento, migliorando così la loro bioattività rispetto alle loro forme native 5,6.

Storicamente, i meccanismi di idrolisi degli O-glicosidi sono stati ampiamente studiati 7,8. I C-glicosidi, caratterizzati dai loro legami glicosidici C-C, mostrano una maggiore stabilità chimica e resistenza alla scissione 9,10. Nonostante ciò, alcuni batteri intestinali hanno sviluppato la capacità di deglicosilare i glicosidi C 11,12. Nel 1988, Hattori et al. hanno dimostrato per la prima volta che alcuni batteri intestinali potevano rimuovere i gruppi glicosilici dai glicosidi C 13. Studi successivi hanno isolato il primo ceppo batterico in grado di questa attività, consentendo un'ulteriore esplorazione dei meccanismi di scissione del glicoside C 14. Ad oggi, tuttavia, è stato identificato e caratterizzato solo un numero limitato di ceppi batterici intestinali ed enzimi che metabolizzano il glicoside C 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Studi recenti hanno dimostrato che la deglicosilazione degli enzimi puerarin (daidzein-8-C-glucoside) (DgpA/B/C) nel ceppo PUE sono in grado di scindere la puerarina in daidzeina e glucosio attraverso un processo a due fasi: DgpA, una famiglia di ossidoreduttasi Gfo/Idh/MocA, ossida la puerarina a 3''-osso-puerarina, che poi subisce una reazione di β-eliminazione mediata dal complesso DgpB/C per produrre l'aglicone e il glucosio10, 26. Tuttavia, le caratteristiche strutturali e funzionali degli enzimi che metabolizzano i glicosidi C, in particolare il sistema DgpA/B/C, rimangono poco comprese, e vi è la necessità di metodologie più avanzate, in particolare l'integrazione di strategie biologiche e chimiche, per far progredire la ricerca in questo campo24.

Per colmare questa lacuna, impieghiamo approcci multidisciplinari integrati per studiare la reazione metabolica del glicoside C catalizzata da DgpA/B/C nel microbiota intestinale umano. In questa reazione, DgpA catalizza l'ossidazione glicosilica dei glicosidi C, successivamente, DgpB e DgpC formano un complesso DgpB/C che scinde specificamente i prodotti ossidati del glicoside C 10,26,27. Per prima cosa abbiamo eseguito separatamente l'espressione e la purificazione ricombinante di DgpA e DgpB/C. Le proteine DgpA e DgpB/C purificate sono state quindi cristallizzate e le loro strutture tridimensionali sono state determinate mediante cristallografia a raggi X. Infine, abbiamo ricostituito la funzione di scissione del glicoside C utilizzando il sistema enzimatico completo DgpA/B/C, con un'analisi completa del prodotto metabolico condotta tramite spettroscopia accoppiata LC-MS/MS e NMR27. Sulla base di questi approcci, abbiamo studiato il metabolismo dei glicosidi C catalizzato dal sistema enzimatico DgpA/B/C.

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Protocollo

1. Produzione e purificazione delle proteine

  1. Costruzione del vettore di espressione
    NOTA: In questo studio, i geni DgpA, DgpB e DgpC del microbiota intestinale umano, ceppo PUE , fungono da sistema modello. Il primo passo prevede l'utilizzo di plasmidi di espressione per produrre le corrispondenti proteine ricombinanti.
    1. Ottenere la sequenza del cluster genico DgpA/B/C (GenBank: LC422372.1) da NCBI. Quindi, sintetizzare commercialmente il DNA DgpA/B/C e clonare individualmente i geni DgpA, DgpB e DgpC in un vettore pET-28a modificato, che produrrà la proteina bersaglio con il SUMO N-terminale e il tag 6×His (tag His-SSUMO)28.
    2. Trasformare ciascuno dei plasmidi DgpA, DgpB o DgpC in cellule competenti per E. coli BL21 (DE3). Successivamente, coltivare batteri in terreno LB con 50 μg/mL di kanamicina a 37 °C.
    3. Aggiungere 0,2 mM di IPTG al terreno quando la densità batterica (OD600) raggiunge 0,6. Coltura dei batteri a 16 °C per 16 ore.
    4. Centrifugare ciascuna delle colture batteriche che esprimono DgpA, DgpB e DgpC a 4.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di tampone A (Tabella 1) per ogni 1 L di coltura batterica.
  2. Purificazione delle proteine
    NOTA: Quantità sufficienti e di elevata purezza di enzimi ricombinanti sono essenziali per la caratterizzazione funzionale e gli studi di biologia strutturale. DgpB e DgpC formano un complesso proteico stabile (formano spontaneamente il complesso DgpB/C durante la procedura di lisi) per la funzionalità10,26. Viene quindi eseguita la purificazione della proteina DgpA e del complesso DgpB/C.
    1. Aggiungere 1 mM di PMSF alla risospensione batterica. Mescolare insieme la sospensione batterica DgpB e DgpC del passaggio 1.1.4 e quindi lisare la sospensione batterica DgpA o la miscela DgpB e DgpC (per formare il complesso DgpB/C funzionale) utilizzando un disgregatore cellulare a ultrasuoni.
    2. Centrifugare il lisato batterico a 48.000 x g per 40 minuti a 4 °C. Conservare il surnatante contenente la proteina e scartare il pellet batterico.
    3. Purificare il complesso DgpA o DgpB/C dal surnatante utilizzando una colonna per cromatografia di affinità al nichel (Ni-NTA). Eluire le proteine legate applicando un gradiente di concentrazione di imidazolo 0-50% con il tampone A e il tampone B (Tabella 1) nel purificatore ÄKTA.
    4. Prelevare 10 μL di campioni eluiti e mescolarli con 2 μL di colorante proteico a 5 ×, quindi eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE a 220 V per 45 minuti utilizzando un sistema di elettroforesi verticale, seguita dalla colorazione Coomassie Blue per visualizzare le bande proteiche. Raccogli frazioni contenenti DgpA o il complesso DgpB/C in base all'analisi SDS-PAGE per un uso futuro.
      NOTA: La DgpA (44 kDa) con un tag His-SUMO (17 kDa) migra a circa 61 kDa (Figura 2D), mentre la DgpC (33 kDa) con un tag His-SUMO (17 kDa) migra a circa 50 kDa, e la DgpB (15 kDa) con un tag His-SUMO (17 kDa) migra a circa 33 kDa (Figura 2J).
    5. Dializzare i campioni del complesso DgpA o DgpB/C dal passaggio 1.2.3 utilizzando una membrana di dialisi con cutoff del peso molecolare di 10 kDa contro il tampone C per rimuovere l'imidazolo e con la proteasi 1 simile all'ubiquitina (ULP1; Tabella dei materiali) enzima per rimuovere l'etichetta His-SUMO29.
    6. Caricare il campione di proteina dializzata nel tampone C (Tabella 1) attraverso la colonna per cromatografia a scambio ionico (colonna Q). Quindi, eluire la proteina legata dalla colonna utilizzando un gradiente di concentrazione di cloruro di sodio compreso tra 100 mM e 600 mM, preparato con il tampone C e il tampone D (Tabella 1) nel purificatore ÄKTA.
    7. Eseguire l'analisi SDS-PAGE del complesso DgpA e DgpB/C eluito dalla colonna Q come al punto 1.2.3, annotando i pesi molecolari: tag His-SUMO (17 kDa), DgpA (44 kDa), bande oligomeriche di DgpA (superiori a 95 kDa) (Figura 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), bande oligomeriche di DgpB e DgpC (tra 53 kDa e 95 kDa) (Figura 2K).
    8. Purificare la proteina utilizzando una colonna di esclusione dimensionale (SEC) con tampone E (Tabella 1). Eseguire l'analisi SDS-PAGE utilizzando le proteine della frazione di eluizione, seguita dalla colorazione Coomassie Blue per visualizzare le bande proteiche. Raccogliere le frazioni contenenti la proteina bersaglio DgpA o il complesso DgpB/C dopo l'analisi mediante SDS-PAGE.
      NOTA: La banda DgpA è osservata a circa 44 kDa con banda DgpA oligomerizzata superiore a 95 kDa (Figura 2F), mentre DgpC è a circa 33 kDa e DgpB è a circa 15 kDa con DgpB e DgpC oligomerizzati (tra 53 kDa e 95 kDa) (Figura 2L).
    9. Misurare la concentrazione proteica del complesso DgpA o DgpB/C utilizzando una nanogoccia a 280 nm. Quindi, concentrare il complesso DgpA o DgpB/C a circa 20 mg/mL con provette per ultrafiltrazione, aliquotarle e congelarle con azoto liquido. Conservare il complesso DgpA o DgpB/C a -80 °C per un uso futuro.
  3. Raccolta dati dello spettro del dicroismo circolare (CD)
    NOTA: Poiché l'ossidazione glicosile catalizzata da DgpA funge da fase di inizio cruciale nella via metabolica, la spettroscopia CD è stata specificamente impiegata per verificare sia il corretto stato di ripiegamento che l'integrità strutturale secondaria di DgpA. Questi parametri strutturali sono di fondamentale importanza sia per l'attività enzimatica che per il successo della cristallizzazione delle proteine.
    1. Diluire la proteina DgpA a 0,2 mg/mL con 1 tampone PBS (pH 7,4) (Tabella 1).
    2. Caricare 1x tampone PBS (pH 7,4) in una cuvetta di quarzo e registrare lo spettro CD basale su 200 - 260 nm utilizzando uno spettrometro CD per rilevare in modo sensibile la struttura secondaria e le differenze di stato di ripiegamento27.
    3. Sostituire la cuvetta tampone con i campioni proteici della versione 1.3.1, registrare lo spettro CD su 200 - 260 nm e sottrarre la linea di base del tampone per ottenere lo spettro CD per il campione proteico.
    4. Raccogli tre scansioni per verificarne l'accuratezza e analizza i dati per le caratteristiche della struttura secondaria e lo stato di ripiegamento delle proteine (Figura 3G, 3H).

2. Cristallografia delle proteine e determinazione della struttura

NOTA: Dopo aver confermato che la DgpA ha mantenuto una corretta piegatura e integrità strutturale, sono stati impiegati approcci di biologia strutturale per determinare le strutture tridimensionali di entrambe le DgpA. Dato che la competenza catalitica del complesso DgpB/C era stata confermata biochimicamente attraverso precedenti saggi funzionali 10,26,27, la fase di verifica spettrale CD è stata omessa.

  1. Crescita e ottimizzazione dei cristalli proteici
    1. Miscelare 0,5 μL di DgpA purificato (20 mg/mL) o complesso DgpB/C (20 mg/mL) con un volume uguale (0,5 μL) di soluzione serbatoio da kit di cristallizzazione su piastre cristalline a 48 pozzetti in un metodo a goccia seduta30. Trasferire le piastre di cristallo a 16 °C per la crescita dei cristalli.
      NOTA: Osservare queste gocce di seduta con un microscopio per identificare le condizioni (compresa la concentrazione di proteine e precipitanti, come PEG 3350, formiato di magnesio, ecc.) per la crescita dei cristalli del complesso DgpA o DgpB/C.
    2. Eseguire l'ottimizzazione della cristallizzazione sia per DgpA che per il complesso DgpB/C utilizzando il metodo di diffusione del vapore a goccia sospesa30.
    3. Per la DgpA, iniziare con la condizione identificata al passaggio 2.1.1 (20 mM di formiato di magnesio, 20% di PEG3350) e applicare un approccio di ottimizzazione ortogonale testando sei gradienti di concentrazione PEG3350 (17%, 18%, 19%, 20%, 21% e 22%) rispetto a quattro gradienti di concentrazione di formiato di magnesio (16 mM, 18 mM, 20 mM e 22 mM)30.
    4. Preparare le gocce di cristallizzazione mescolando 0,8 μL di soluzione proteica DgpA (10 o 20 mg/mL) con 0,8 μL di soluzione serbatoio su vetrini di vetro silanizzati. Quindi capovolgere i vetrini coprioggetti su piastre di cristallizzazione a 24 pozzetti e incubare a 16 °C per la crescita dei cristalli.
    5. Per l'ottimizzazione del complesso DgpB/C, seguire lo stesso approccio: miscelare 0,8 μL di complesso proteico (10 o 20 mg/mL) con 0,8 μL di soluzione serbatoio contenente acetato di magnesio (16, 18, 20 o 22 mM) e PEG 8000 (8%, 9%, 10%, 11%, 12% o 13%). Allo stesso modo, posizionare le gocce sospese su vetrini coprioggetti silanizzati su piastre a 24 pozzetti e incubare a 16°C.
    6. Lasciare che i cristalli proteici del complesso DgpA e DgpB/C crescano fino a quando non cessano di crescere, quindi trasferire i cristalli in una soluzione di ammollo contenente il tampone serbatoio e 5 mM dei composti del substrato (glucosio e puerarina) del complesso DgpA e DgpB/C a 16 °C per 30 minuti.
    7. Trasferire i cristalli, tra cui DgpA (con glucosio o senza substrato) e il complesso DgpB/C (senza substrato), in una soluzione crioprotettiva contenente la condizione di tampone di ammollo integrata con glicerolo al 25% e conservarli immediatamente in azoto liquido per la raccolta dei dati.
      NOTA: Sebbene sia i cristalli di DgpA che quelli del complesso DgpB/C siano stati imbevuti di substrati (glucosio e puerarina), solo il glucosio è stato incorporato con successo nel centro catalitico di DgpA. Di conseguenza, sono state ottenute tre forme cristalline distinte per l'analisi strutturale: DgpA con glucosio (Figura 3E); DgpA senza substrato (Figura 3B-C); e complesso DgpB/C privo di substrato (Figura 3D). La soluzione crioprotettiva salvaguarda i cristalli proteici prevenendo la formazione di ghiaccio durante il raffreddamento flash in azoto liquido, preservandone così l'integrità strutturale e riducendo al minimo i danni indotti dalle radiazioni. Tipicamente formulata utilizzando l'acqua madre come base, la soluzione è integrata con concentrazioni ottimizzate di crioprotettori (ad esempio, glicerolo o glicole etilenico).
  2. Raccolta dati e determinazione della struttura
    1. Raccogliere i dati di diffrazione dei raggi X del cristallo per DgpA con glucosio o in forme prive di substrato e complesso DgpB/C in forma priva di substrato presso la Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) della Shanghai National Protein Science Facility (NFPS) con una lunghezza d'onda incidente di 0,978 Å.
    2. Elaborare i tre set di dati di diffrazione dei raggi X, inclusi i complessi DgpA e DgpB/C, utilizzando un software di elaborazione dei dati cristallografici31. Innanzitutto, caricare i dati grezzi, quindi eseguire in sequenza le funzioni di indicizzazione, integrazione e scala facendo clic sui pulsanti corrispondenti nel software. Genera un file di output elaborato (output.sca) adatto per la successiva determinazione della struttura.
    3. Determinare le strutture di DgpA con glucosio o in forme prive di substrato (Figura 3B-C, 3E) e del complesso DgpB/C in assenza di substrato (Figura 3D) utilizzando il metodo di sostituzione molecolare (Tabella dei materiali). E poi perfezionare le strutture e le mappe elettroniche incorporando i leganti rilevanti (come glucosio, Mn2+, H2O, ecc.)31.

3. Monitoraggio dell'attività di reazione e determinazione dei parametri cinetici

NOTA: Il sistema DgpA/B/C media le trasformazioni del glicoside C attraverso una cascata definita a due stadi: DgpA avvia la catalisi ossidando la porzione zuccherina, generando un intermedio che il complesso DgpB/C successivamente scinde o isomerizza 10,26,27. In questo studio, DgpA/B/C si riferisce agli enzimi responsabili di questa cascata di reazioni, mentre va notato che non si verifica alcuna interazione diretta tra DgpA e il complesso DgpB/C. Questa attività accoppiata può essere rigorosamente quantificata utilizzando tre approcci complementari: analisi del prodotto HPLC, saggi spettrofotometrici accoppiati a DCPIP che monitorano il trasferimento di elettroni o caratterizzazione cinetica dettagliata dei parametri di reazione27,32. In particolare, i prodotti di scissione del C-glicoside (daidzeina) generati dalla catalisi DgpA/B/C sono stati analizzati mediante HPLC (rivelazione UV a 265 nm). La formazione del prodotto è stata quantificata utilizzando una curva di calibrazione standard (il metodo per stabilire la curva standard è descritto in dettaglio nella nota al passaggio 3.3.2.) e i parametri cinetici sono stati determinati adattando i tassi di formazione del prodotto al modello di Michaelis-Menten attraverso l'analisi di regressione non lineare27,32. Il test di inibizione che misura l'effetto del glucosio sulla scissione del legame C-glicosidico della puerarina ha fornito prove corroboranti che i saccaridi possono fungere da substrati per la DgpA. Successivamente, il saggio DCPIP monitora le reazioni di ossidazione degli zuccheri misurando la riduzione del 2,6-diclorofenolindofenolo di colore blu (DCPIP) a leuco-DCPIP incolore poiché accetta elettroni da zuccheri ossidati33, riflettendo così l'attività catalitica di DgpA.

  1. Monitoraggio dell'attività di DgpA/B/C mediante HPLC
    1. Condurre la reazione di scissione o isomerizzazione del glicoside C catalizzata da DgpA/B/C in 500 μL di tampone F (Tabella 1) contenente 20 μM di DgpA e DgpB/C complex (dal passaggio 1.2.7) e 0,1 mM di: puerarin o genisteina-8-C-glucoside per reazioni di scissione, o daidzina o genistina per reazioni di isomerizzazione27. Eseguire le reazioni a 37 °C per 8 ore e terminarle aggiungendo 1,5 mL di metanolo alla miscela di reazione.
    2. Centrifugare la soluzione di reazione a 16.000 × g per 15 minuti per rimuovere il precipitato proteico formatosi a causa della denaturazione enzimatica indotta dal metanolo. Filtrare il surnatante utilizzando una membrana filtrante da 0,22 μm.
    3. Esecuzione di analisi HPLC con eluizione a gradiente, a una velocità di flusso di 1 mL/min con un volume di iniezione di 10 μL e una lunghezza d'onda di rilevamento di UV 265 nm.
      NOTA: Le fasi mobili erano acetonitrile (Fase Mobile A) e acido acetico acquoso allo 0,1% (Fase Mobile B), con eluizione a gradiente. Il gradiente dell'eluizione in fase mobile è il seguente: 5%-20% A a 0-5 min, 20%-45% A a 5-15 min, 45%-52% A a 15-18 min, 52%-55% A a 18-19 min, 55%-5% A a 19-21 min e 5% A a 21-23 min. Il sistema enzimatico DgpA/B/C mostra efficienze catalitiche marcatamente diverse nei confronti di substrati come la daidzina e la genistina, con conseguenti variazioni sostanziali nei rispettivi tassi di formazione del prodotto. Per valutare quantitativamente la cinetica di conversione del substrato e la dinamica di accumulo del prodotto, è stata eseguita un'analisi completa dell'andamento temporale utilizzando HPLC a intervalli di 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 e 48 ore.
  2. Monitoraggio dell'attività della DgpA con il dosaggio del 2,6-diclorofenolo indofenolo (DCPIP)
    NOTA: Il test DCPIP monitora l'ossidazione dello zucchero misurando la riduzione del blu DCPIP a leuco-DCPIP incolore poiché accetta elettroni da zuccheri ossidati33. Qui, il saggio reporter DCIPIP è stato utilizzato per registrare l'attività di ossidazione di DgpA verso diversi composti glicosilati, monosaccaridi, disaccaridi o polisaccaridi. Sono stati utilizzati DgpA wildtype e i suoi mutanti difettosi che legano lo zucchero, tra cui D182A, Δ(308-316) e Δ(311-316)27.
    1. Incubare 0,8 mM di DCPIP, proteina 50 μM tra cui DgpA wildtype e i suoi tre mutanti difettosi leganti lo zucchero (DgpA D182A, DgpA Δ (308-316) o DgpA Δ (311-316)), con substrati 10 mM tra cui puerarina, vitexina, genistina, amido solubile, maltotriosio, lattosio, saccarosio, glucosio o maltosio in 1 tampone PBS (pH 7,4).
    2. Dopo 20 ore di reazione, registrare la variazione di assorbanza di DCPIP a 600 nm utilizzando un lettore di micropiastre33.
  3. Determinazione del tasso di inibizione del glucosio sulla reazione di scissione del legame C-glicosidico della puerarina
    NOTA: DgpA appartiene alla famiglia degli enzimi ossidoreduttasi dello zucchero, in grado di ossidare la porzione zuccherina dei glicosidi C. La Figura 3E dimostra che il glucosio è legato al centro catalitico DgpA e il protocollo per determinare la struttura DgpA è descritto in dettaglio nel passaggio 2.2.3. Per esaminare il legame competitivo di DgpA tra glucosio e il C-glicoside puerarina, sono stati condotti i seguenti esperimenti.
    1. Eseguire la reazione in 1 × tampone PBS (pH 7,4). Aggiungere diverse concentrazioni di glucosio (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM e 100 mM) al sistema di reazione di scissione del glicoside C (puerarina) come descritto al punto 3.1. Eseguire la reazione a 37 °C per 12 h.
    2. Eseguire l'analisi quantitativa del prodotto (daidzeina) utilizzando la curva di calibrazione HPLC per il composto di riferimento (daidzeina standard). Calcolare il tasso di inibizione determinando prima la differenza nella resa del prodotto tra le reazioni contenenti concentrazioni variabili di glucosio e le reazioni di scissione del glicoside C non inibite (senza glucosio), quindi dividendo questa differenza per la resa del prodotto dalla reazione non inibita.
      NOTA: Per generare una curva di calibrazione per l'analisi HPLC quantitativa, preparare una diluizione seriale di uno standard di riferimento (ad es. puerarin o daidzeina) in un intervallo di concentrazione (ad es. 0,1-1 mM, con incrementi di 0,1 mM). Analizza ogni concentrazione mediante HPLC, registra le aree di picco e confrontale con le concentrazioni standard corrispondenti. Eseguire l'analisi di regressione lineare (y = mx + b, dove y = area di picco, x = concentrazione) per stabilire la curva standard. L'equazione di regressione può quindi essere utilizzata per interpolare concentrazioni di campioni sconosciute dalle aree di picco misurate.
  4. Determinazione dei parametri cinetici
    NOTA: I parametri cinetici sono ampiamente riconosciuti come standard di riferimento critici per la valutazione quantitativa dell'efficienza catalitica enzimatica. Per valutare quantitativamente le reazioni catalizzate da DgpA/B/C, sono stati determinati i parametri cinetici per le reazioni di scissione della puerarina del glicoside C catalizzate da DgpA/B/C.
    1. Preparare i gradienti di concentrazione del C-glicoside (puerarina) del substrato (che vanno da 0,01 a 4 mM con incrementi di 2 volte) per la reazione di scissione del glicoside C catalizzata da DgpA/B/C.
    2. Effettuare la reazione a 37 °C per 8 ore secondo il metodo descritto al punto 3.1. Eseguire l'analisi quantitativa del prodotto (daidzeina) utilizzando la curva di calibrazione HPLC della daidzeina standard. Quindi calcolare la velocità di reazione (velocità di formazione del prodotto) dividendo la quantità quantificata per il tempo di reazione.
    3. Determinare i parametri cinetici del gatto K, m e k adattando la velocità di reazione calcolata e la concentrazione del substrato al modello di Michaelis-Menten utilizzando un software statistico (Tabella dei materiali).

4. Preparazione e rilevamento del prodotto intermedio di reazione

NOTA: Oltre all'attività di scissione del glicoside C, DgpA/B/C catalizza anche l'isomerizzazione dei glicosidi O a glicosidi C. Pertanto, quando gli O-glicosidi vengono utilizzati come substrati per DgpA/B/C, i prodotti intermedi saranno prodotti come C-glicosidi isomerizzati. Per caratterizzare il prodotto intermedio (puerarina), il composto intermedio è stato purificato e successivamente analizzato utilizzando strumenti di chimica analitica, tra cui la spettroscopia LC-MS/MS e NMR.

  1. Preparazione del prodotto intermedio di reazione nella reazione di isomerizzazione del C-glicoside catalizzata da DgpA/B/C 27
    1. Preparare la reazione di isomerizzazione da O- a C-glicoside catalizzata da DgpA/B/C utilizzando 0,2 mM di O-glicoside (daidzin) come substrati e 20 μM di complesso DgpA e DgpB/C in un volume di reazione di 90 mL, seguendo il protocollo descritto nel passaggio 3.1 precedente.
    2. Purificare il prodotto intermedio C-glicoside (puerarina) utilizzando un'HPLC preparativa con la strategia di eluizione in gradiente (NOTA).
      NOTA: Le fasi mobili erano acetonitrile (Fase Mobile A) e acido acetico acquoso allo 0,1% (Fase Mobile B), con eluizione a gradiente. Il gradiente dell'eluizione in fase mobile è il seguente: 5%-20% A a 0-5 min, 20%-45% A a 5-15 min, 45%-52% A a 15-18 min, 52%-55% A a 18-19 min, 55%-5% A a 19-21 min e 5% A a 21-23 min.
    3. Calcolare la concentrazione del prodotto intermedio purificato utilizzando la curva HPLC di calibrazione standard al passaggio 3.3.2, ottenere circa 6 mg di puerarin nel sistema di reazione da 90 mL al passaggio 4.1.1, quindi essiccare i prodotti intermedi purificati con un concentratore centrifugo sottovuoto per un uso futuro.
  2. Caratterizzazione del prodotto intermedio di reazione con LC-MS/MS
    1. Raccogliere i prodotti intermedi essiccati dal passaggio 4.1.3. Pesare 100 μg di intermedi derivati dalla daidzina, quindi scioglierli in 2 mL di metanolo per ottenere una concentrazione finale di 50 μg/mL. Centrifugare a 13.500 x g per 10 minuti e raccogliere il surnatante per l'analisi LC-MS/MS.
    2. Utilizzare lo stesso programma di eluizione a gradiente HPLC al passaggio 4.1.2 per l'analisi LC-MS/MS con un volume di iniezione di 5 μL.
  3. Caratterizzazione del prodotto intermedio di reazione con NMR
    1. Sciogliere 4 mg dei prodotti intermedi purificati dalla reazione daidzina in 340 μL di dimetilsolfossido-d 6 per spettroscopiaNMR 1 H e 13C. Impostare i parametri dello strumento come segue: temperatura a 298 K, spessore 3 volte, larghezza dell'impulso 18 μs, ritardo di rilassamento 1,5 s, 48 scansioni, con altri parametri alle impostazioni predefinite27.
    2. Raccogli gli spettri NMR 1H e 13C utilizzando uno strumento NMR a 600 MHz.

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Risultati

Seguendo le procedure descritte in Figura 1, abbiamo prima espresso i geni DgpA, DgpB e DgpC in E. coli Celle BL21(DE3). Poiché DgpB e DgpC formano un complesso enzimatico stabile (complesso DgpB/C)10,26,27,34, le cellule che esprimono queste due proteine sono state combinate per la co-purificazione. Dopo la lisi cellulare,...

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Discussione

Attualmente, le caratteristiche strutturali e funzionali degli enzimi del metabolismo dei glicosidi C nel campo rimangono poco chiare e mancano metodi di ricerca appropriati 10,24,26. Sfruttando i vantaggi significativi della chimica combinata e della biotecnologia 40,41,42,43,44,45, lo studio propone una metodologia di ricerca che utilizza la biologia strutturale, l'enzimolog...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è finanziato con il programma di fondi per startup presso l'Università di Medicina Cinese di Pechino (BUCM) (90011451310011) a W.M., il programma di emergenza contro il COVID-19 presso BUCM (1000061223476) a W.M., il team di innovazione e il programma di coltivazione dei talenti dell'amministrazione nazionale di medicina tradizionale cinese (ZYYCXTD-C-202006) a W.M. e il progetto di ricerca indipendente per studenti laureati presso BUCM(ZJKT2023012) a H.P. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Wenfu Ma per l'utile discussione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,6-dicloroindofenolo (DCPIP)Solarbio Scienza e TecnologiaD6350
2-Mercaptoetanolo (β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 &volte; Carico di proteine coloranteSangon BiotechC508320
acido aceticoShanghai MACKLINA111247
acetonitrileThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz NMR SpettrometroBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Centrifuga 5424REppendorf022620601
Chirascan più spettrometro CDFotofisica applicataChirascan  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol(DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) cellule competentiThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
GenisteinaShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlucosioSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad SoftwareVersione? Prism 9Calcola i parametri cinetici Km e kcat
Colonne SEC preparative HiLoad Superdex 200 pgCytiva28989335
HisTrap HP His tag colonne per purificazione delle proteineCytiva17524802
HiTrap Q FF colonna per cromatografia a scambio anionicoCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  versione 723
Colonna HPLC TC-C18(2), 170Å, 5 µ m, 4,6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside? IPTG)Sigma-Aldrich PHG0010
lattosioSigma-Aldrich17814
LC-20AT, cromatografia liquida ad alte prestazioniShimadzuLC20AT
MaltosioSigma-Aldrich47288
MaltotriosioSigma-Aldrich443713
Cloruro di manganeseShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MetanoloThermo Fisher Scientific™? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Scienza e TecnologiaN8110
Olympus SZX12 StereomicroscopioOLYMPUS SZX7
fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixIl team di sviluppo di Phenix1.21.2Phenix è una suite software completa per la determinazione della struttura cristallina delle proteine, che incorpora i metodi SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion) e MR (Molecular Replacement) con il software Phaser.
Cromatografo liquido preparativo ad alte prestazioniWaters2545/2998
Kit di screening dei cristalli proteiciHampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
Incubatore a scuotimentoShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
Pelle di serpente&commercio; Membrana per dialisi, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Amido solubileSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Superspeed CentrifugaThermo Fisher Scientific™
Lettore di micropiastre multimodale 75006590 SpectraMax i3xDISPOSITIVI MOLECOLARISpectraMax i3x 
Specifiche dello spettrofotometro per microvolumi SpectraMax QuickDrop DISPOSITIVIMOLECOLARIQuickDrop
SucrosioSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Colonna di preparazioneAcque186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific&? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Ubiquitina-proteasi simile 1Thermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
Congelatore a bassissima temperaturaThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Concentratore centrifugo sottovuotoBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513

Riferimenti

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