Articolo metodologico

Preparazione di piastrine umane lavate per studi quantitativi sul flusso metabolico

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DOI:

10.3791/67639

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10 gennaio 2025

 ,  ,  , 
1Depeartment of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 3Department of Pediatrics, Section of Hematology, Oncology, and Bone Marrow Transplant, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 4Quantitative Biosciences and Engineering, Colorado School of Mines

In questo articolo

Sommario

Il metabolismo piastrinico è di interesse, in particolare per quanto riguarda il ruolo dell'iper- e dell'ipoattività piastrinica nel sanguinamento e nei disturbi trombotici. L'isolamento delle piastrine dal plasma è necessario per alcuni saggi metabolici; Qui viene presentato un metodo per isolare i metaboliti intracellulari dalle piastrine lavate.

Abstract

Le piastrine sono cellule del sangue che svolgono un ruolo fondamentale nell'emostasi e nella risposta immunitaria innata. L'iperattività e l'ipoattività piastrinica sono state implicate nei disturbi metabolici, aumentando il rischio sia di trombosi che di sanguinamento. L'attivazione piastrinica e il metabolismo sono strettamente collegati, con i numerosi metodi per misurare la prima ma relativamente pochi per il secondo. Per studiare il metabolismo piastrinico senza l'interferenza di altre cellule del sangue e componenti del plasma, le piastrine devono essere isolate, un processo che non è banale a causa della sensibilità al taglio piastrinico e della capacità di attivarsi irreversibilmente. Qui viene presentato un protocollo per l'isolamento piastrinico (lavaggio) che produce piastrine quiescenti sensibili alla stimolazione da parte degli agonisti piastrinici. Le fasi successive della centrifugazione vengono utilizzate con l'aggiunta di inibitori piastrinici per isolare le piastrine dal sangue intero e risospenderle in un tampone isosmotico controllato. Questo metodo produce in modo riproducibile un recupero del 30%-40% delle piastrine dal sangue intero con bassa attivazione, misurata dai marcatori di secrezione dei granuli e attività delle integrine. La conta piastrinica e la concentrazione del carburante possono essere controllate con precisione per consentire all'utente di sondare una varietà di situazioni metaboliche.

Introduzione

Le piastrine sono cellule anucleate di piccole dimensioni (2-4 μm di diametro) che svolgono un ruolo importante nell'emostasi, il processo strettamente regolato di formazione del coagulo1. Sebbene vitali per l'integrità vascolare, le piastrine sono anche implicate in eventi avversi per la salute. Le piastrine sono coinvolte nella trombosi venosa profonda (TVP) e nella trombosi arteriosa (AT), che sono coaguli che occludono i vasi sanguigni, portando a una diminuzione dell'afflusso di sangue a livello locale, oppure, se pezzi del coagulo si rompono (embolizzano), possono bloccare l'afflusso di sangue ai polmoni, al cuore o al cervello 2,3,4,5,6,7 . L'iperreattività piastrinica è una comorbilità di ipertensione, diabete e cancro, che porta ad un aumento dell'incidenza di TVP e AT 8,9,10. L'attivazione piastrinica e il metabolismo sono strettamente correlati11,12, portando a un aumento dell'interesse nel mirare al metabolismo piastrinico come strategia terapeutica13,14. C'è un dibattito sull'esatto ricablaggio metabolico che si verifica dopo l'attivazione, e questo è un campo di studio attivo15. Questo crescente interesse per la disfunzione piastrinica nella malattia e i suoi legami con il metabolismo sottolinea la necessità di un metodo ripetibile per isolare le piastrine e studiarne il metabolismo.

Le piastrine umane sono tipicamente ottenute mediante venipuntura e quindi isolate dal sangue intero.  Le piastrine lavate vengono separate dal sangue intero attraverso le successive fasi di lavaggio e centrifugazione16. Questo è stato originariamente fatto dal gruppo17 di Mustard, e leggermente modificato dal gruppo18 di Cazenave. Un'altra alternativa sono le piastrine filtrate su gel, che possono essere ottenute dal plasma ricco di piastrine (PRP) mediante cromatografia ad esclusione dimensionale utilizzando una colonna impaccata di perle di gel di agarosio19. Esistono molti protocolli di lavaggio sia per il sangue umano che per quello dei roditori e sono ottimizzati per vari test 20,21,22,23, ma non per misurare il metabolismo piastrinico.

Le tecniche per studiare il metabolismo piastrinico includono misurazioni bioenergetiche tramite l'analizzatore Seahorse XF 11,24,25,26,27, misurazioni del flusso extracellulare 11,13,24, metabolomica 14,28 e analisi del flusso metabolico assistita da isotopi (13C-MFA)29. Negli studi metabolomici, l'obiettivo è tipicamente quello di determinare percorsi alterati tra due diverse condizioni (ad esempio, piastrine a riposo vs piastrine attivate14). Gli studi metabolomici prevedono l'uso della cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). Questi studi possono essere condotti per metaboliti intra- o extracellulari e sono spesso associati all'analisi del percorso o all'analisi delle componenti principali (PCA)14,28. L'analisi del flusso metabolico isotopico assistito (13C-MFA) prevede l'alimentazione delle cellule di un substrato marcato noto come tracciante e la misurazione del modo in cui questo tracciante si propaga attraverso una rete di reazione con LC-MS. Questa tecnica consente il calcolo dei flussi attraverso le vie metaboliche con risoluzione del livello di reazione29,30. Nel sangue intero e nel plasma ricco di piastrine (PRP), la concentrazione di carburante (glucosio, glutammina, acetato, ecc.) è soggetta alla variabilità da donatore a donatore e l'albumina e la globulina legante gli ormoni sessuali presenti nel plasma possono alterare la concentrazione attiva di ormoni, farmaci e altre molecole biologicamente rilevanti31. Le piastrine lavate offrono un metodo per sospendere le piastrine in un mezzo definito dall'utente, comprese le concentrazioni di carburante note, compatibile con 13C-MFA32.

Qui descritto è un metodo per il lavaggio delle piastrine per produrre piastrine che possono essere utilizzate nei saggi metabolici. Il protocollo produce piastrine quiescenti con bassa contaminazione da globuli rossi e globuli bianchi.  Lo stato di attivazione piastrinica è stato monitorato tramite citometria a flusso dei marcatori di attivazione piastrinica. Questo protocollo raggiunge in modo riproducibile almeno il 30%-40% di recupero piastrinico rispetto alla conta piastrinica nel sangue intero. Le piastrine lavate ottenute con questa tecnica sono adatte per le tecniche di analisi metabolica e il metodo di estrazione dei metaboliti intracellulari può essere adattato all'analisi a scelta dell'utente (LC-MS, GC-MS, saggio fotometrico, ecc.).

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Protocollo

Lo studio ha ricevuto l'approvazione dell'Institutional Review Board dall'Università del Colorado Anschutz Medical Campus. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti allo studio. I partecipanti hanno riferito di non aver consumato alcol nelle precedenti 48 ore o farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) nei dieci giorni precedenti. Questo progetto è supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health con il numero di premio R61HL141794.

1. Raccolta del sangue

  1. Predisposizione per il prelievo di sangue. Si raccomanda che la raccolta del sangue venga effettuata da un flebotomo qualificato.
  2. Eseguire la venipuntura sull'interno del braccio utilizzando un ago da 19 G.
  3. Raccogliere i primi ~2 mL in un vacutainer privo di additivi e smaltire. Questo serve a rimuovere le molecole di segnalazione chimica dalle cellule endoteliali danneggiate che possono attivare le piastrine. Dopo aver raccolto i 2 ml iniziali, rimuovere il laccio emostatico per ridurre lo sforzo di taglio sulle piastrine.
  4. Raccogliere il resto del sangue nei vacutainer antiocoagulanti citrato destrosio (ACD-A) in un rapporto di 14:3 (sangue:ACD-A). Capovolgere delicatamente ogni vacutainer dopo il prelievo di sangue per mescolare sangue e anticoagulante.

2. Lavaggio delle piastrine

figure-protocol-1
Figura 1: Fasi successive di centrifugazione e risospensione coinvolte nel lavaggio piastrinico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: Evitare la generazione di bolle d'aria. Utilizzare pipette di trasferimento per rimuovere le bolle quando si formano, soprattutto prima della centrifugazione. Ogni volta che le provette di sangue/piastrine vengono aperte/chiuse, si consiglia di respirare nella provetta prima di chiudere il tappo per aumentare il livello di CO2 .

  1. Preriscaldare la centrifuga a 37 °C per ridurre gli effetti della temperatura. Tra una fase di centrifugazione e l'altra del protocollo, mantenere la centrifuga a 37 °C.
  2. Preriscaldare il bagnomaria a 37 °C. Mettere il tampone di Tyrode modificato con il glucosio nel bagnomaria.
    NOTA: la ricetta del buffer modificata di Tyrode può essere trovata nel File supplementare 1.
  3. Combinare il sangue intero raccolto da tutti i vacutainer in provette coniche in polipropilene da 50 mL. Utilizzando una punta di pipetta con taglio smussato, tagliata con un angolo di 45°, prelevare il volume del campione appropriato per eseguire una conta delle cellule (vedere Conteggio delle cellule).
  4. Rimuovere eventuali bolle generate dall'aspirazione accurata con una pipetta di trasferimento a foro stretto.
  5. Lasciare riposare il sangue a bagnomaria per 25 minuti a 37 °C Ciò consente alle piastrine in uno stato attivato in modo reversibile (dall'essere rimosse dal corpo, trasferite da un tubo all'altro, ecc.) di tornare a uno stato di riposo.
  6. Per prevenire l'attivazione durante la centrifugazione, aggiungere 500 nM di prostaglandina I2 (PGI2) e 0,02 U/mL di apirasi al sangue intero e mescolare delicatamente capovolgendo una volta.  Rimuovere eventuali bolle generate utilizzando una pipetta di trasferimento a foro stretto.
    NOTA: Le istruzioni per la corretta ricetta di PGI2 e apirasi possono essere trovate nel File supplementare 1.
  7. Centrifugare il sangue intero per ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) (15 minuti a 250 x g per 42 ml di sangue intero) senza freni (37 °C).
  8. Raccogliere delicatamente il PRP (strato giallo superiore sopra il buffy coat e lo strato di sangue rosso) in una nuova provetta conica da 50 mL utilizzando una pipetta di trasferimento a foro largo.
  9. Durante il trasferimento, inclinare un tubo conico pulito e far scorrere delicatamente il PRP lungo il lato del tubo. Evitare le bolle d'aria.
  10. Lasciare circa 3 mm di PRP per evitare di disturbare il buffy coat (lo strato di globuli bianchi tra il PRP e il sangue rosso). Se disturbato, questo apparirà come un improvviso vortice di bianco nella pipetta di trasferimento.
  11. Effettuare il conteggio delle cellule (vedere Conteggio delle piastrine) per determinare il volume di risospensione per la fase di lavaggio successiva.
  12. Lasciare riposare per 10 minuti a 37 °C.
  13. Utilizzando una punta di pipetta con taglio smussato, prelevare il campione per la citometria a flusso (vedere Citometria a flusso).
  14. Aggiungere 500 nM di PGI2 e 0,02 U/mL di apirasi al PRP e mescolare capovolgendo delicatamente una volta.
  15. Centrifugare per 10 minuti a 1000 x g a 37 °C (accelerazione:0 freno: 0). Non utilizzare il freno. Il pellet non è compatto e una frenata improvvisa può causare il rimescolamento.
  16. Durante la centrifugazione, determinare il volume di risospensione. Supponiamo un recupero del 75%. Rendere la densità cellulare di circa 3x105 cellule/μL.
  17. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica a foro largo per il volume di massa e una pipetta da 1 ml (punta non tagliata) per il resto del liquido vicino al pellet. Evitare di toccare il pellet sul fondo del tubo.
  18. Aggiungere 500 nM di PGI2 e 0,02 U/mL di apirasi al tampone di Tyrode modificato. Aggiungere lentamente la quantità calcolata di tampone dal passaggio 16 facendo scorrere lungo il lato del tubo conico.
  19. Utilizzando un puntale con taglio smussato e un puntale per pipetta da 1 mL, risospendere delicatamente il pellet pipettandolo delicatamente su e giù più volte.
    1. Impostare il volume su 300 μl, premere completamente lo stantuffo mentre si trova sopra la linea del liquido, quindi posizionare la pipetta sotto il liquido e fermarsi per primo. Ciò consentirà allo scienziato di risospendere il pellet senza creare accidentalmente bolle d'aria che potrebbero attivare le piastrine.
    2. Occasionalmente, c'è un anello di globuli rossi visibili sul fondo del pellet. Evitare di risospendere questa operazione.
  20. Una volta che il pellet è stato risospeso, utilizzare una pipetta di trasferimento a foro largo per trasferire il pellet risospeso in un nuovo tubo conico, lasciando dietro di sé eventuali globuli rossi o cellule visibilmente raggruppate.
  21. Ripetere i passaggi da 11 a 20. Assicurarsi di aggiungere 500 nM di PGI2 e 0,02 U/mL da un'aliquota fresca al tampone di Tyrode modificato (non riutilizzare il tampone di Tyrode modificato dal passaggio 18, PGI2 è troppo instabile).
  22. Prelevare un campione per la conta delle cellule. Regolare la concentrazione piastrinica secondo necessità con il tampone di Tyrode modificato.
  23. Utilizzare una punta di pipetta con taglio smussato per prelevare un campione per la citometria a flusso.
  24. Lasciare riposare le piastrine per 1 ora a 37 °C per consentire agli inibitori di svanire e consentire alle piastrine attivate in modo reversibile di tornare a riposo.
  25. Mescolare delicatamente con una pipetta a foro largo. Prelevare campioni per la citometria a flusso.
  26. Le piastrine lavate e a riposo sono ora pronte per essere utilizzate per l'analisi metabolica.

3. Conteggio delle piastrine

  1. Le piastrine possono essere contate utilizzando un contatore automatico di cellule del sangue (seguire le istruzioni del produttore) o un emocitometro33.

4. Citometria a flusso

  1. Preparazione
    1. Protocolli dettagliati e revisioni delle migliori pratiche per l'impostazione di miscele di anticorpi e la preparazione del citometro a flusso per misurare l'attivazione piastrinica sono disponibili altrove34,35.
  2. Campionamento
    1. Quando si preleva un campione per la citometria a flusso, raccogliere la sospensione piastrinica utilizzando una punta di pipetta tagliata a smusso. Aggiungerlo lentamente alla provetta da microcentrifuga con gli anticorpi, quindi agitare delicatamente per mescolare. Lasciare incubare per 30 s.
    2. Utilizzando la punta della pipetta con taglio smussato, trasferire la sospensione piastrinica/la miscela di anticorpi in un pozzetto appropriato sulla piastra a 96 pozzetti.
    3. Aggiungere immediatamente il fissante al pozzetto per fissare le cellule.
    4. Eseguire il citometro a flusso entro 8 ore dalla fissazione.
  3. Test di sensibilità agli agonisti
    1. Dopo il lavaggio, mettere da parte 2 provette coniche da 15 mL, una per il controllo a riposo e una per il controllo attivato dalla trombina.
    2. Pipettare delicatamente 100 μl di sospensione piastrinica in ciascuna provetta conica utilizzando un puntale per pipetta tagliato a taglio smussato. Lasciare riposare a 37 °C per 1 ora.
    3. Dopo l'ora di riposo, aggiungere 0,1 U/mL di trombina in una provetta (le istruzioni per la preparazione della trombina sono disponibili nel File supplementare 1) e il veicolo nell'altra. Incubare a 37 °C per 15 min.
    4. Prelevare un campione di citometria a flusso di ciascuna provetta per determinare la sensibilità piastrinica all'agonista.

5. Campionamento per l'analisi quantitativa del flusso metabolico

  1. Tempra
    NOTA: L'estinzione del metabolismo è un passaggio necessario per misurare con precisione i flussi metabolici. Il raffreddamento rapido delle cellule e il mantenimento della loro temperatura pari o inferiore a 4 °C rallenta il metabolismo in modo tale da poter presumere che sia sostanzialmente interrotto, in modo che le cellule campionate riflettano accuratamente il metabolismo delle cellule provenienti dalla massa. Esistono diversi metodi che possono essere utilizzati, ma per bilanciare la necessità di un raffreddamento rapido e ridurre al minimo le perdite, utilizzare soluzione fisiologica fredda (-4 °C)36. Se il sale interferisce con l'analisi successiva, è possibile utilizzare un altro fluido (metanolo/acqua, etanolo, ecc.)37.
    1. Preparare e congelare aliquote di soluzione fisiologica. Effettuare ogni aliquota salina a 6 volte il volume del campione desiderato.
      NOTA: la ricetta della soluzione salina normale si trova nel File supplementare 1.
    2. Pre-raffreddare la microcentrifuga a 0 °C.
    3. Raccogliere la sospensione piastrinica in soluzione fisiologica normale parzialmente congelata (< -4 °C) in un rapporto 1:6 (p.es., raccogliere 150 μL di sospensione piastrinica in 750 μL di soluzione fisiologica in provette da microcentrifuga).
      NOTA: Non lasciare la soluzione piastrinica/salina sul ghiaccio per più di 15 minuti.
    4. Centrifugare a 16.000 x g, 0 °C per 10 min.
    5. Conservare il surnatante per l'analisi dei metaboliti esterni e il pellet per l'estrazione e la misurazione dei metaboliti intracellulari. Conservare entrambi a -20 °C fino al momento dell'analisi.
    6. Ripetere questo processo sull'intervallo di tempo desiderato e sul numero di punti temporali del campione.
  2. Estrazione intracellulare di metaboliti
    1. Aggiungere 0,5 mL di acqua metanolo 7:3 pre-raffreddata a -20 °C al pellet temprato. Agitare energicamente per 1 min.
    2. Congelare in azoto liquido, scongelare a 0 °C, quindi ripetere per altri 2 cicli.
    3. Centrifugare le sospensioni a 16.000 x g per 10 minuti a -4 °C.
    4. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga.
    5. Utilizzare il pellet del passaggio 3 e ripetere il protocollo di estrazione (passaggi 1-3) con metanolo 50:50:acqua. Aggiungi il secondo estratto raccolto al primo. Asciugare per una notte.
    6. Risospendere l'estratto secco in 150 μl di acqua di grado LC-MS (o altro solvente appropriato per l'analisi prevista). Mescolare per 15 minuti a 4 °C. Agitare brevemente e trasferire in provette da microcentrifuga da 0,22 μm per rimuovere i detriti cellulari. Centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g e 4 °C.
    7. Togliere dalla centrifuga, pipettare altri 50 μL di acqua optima sul filtro e centrifugare nuovamente (5 min, 16.000 x g e 4 °C) per risciacquare il filtro. Raccogli per l'analisi.

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Risultati

I risultati rappresentativi nella Figura 2 rappresentano 6 diversi donatori di sangue, tra cui 3 maschi e 3 femmine. La resa piastrinica rispetto al sangue intero è mostrata nella Figura 2A. Il recupero piastrinico finale è stato in media del 52% ± del 3% (deviazione standard, n=6). La conta piastrinica finale rispetto alla contaminazione dei globuli bianchi è stata misurata utilizzando un analizzatore ematologico automatizzato. La conta dei globuli bianchi era ...

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Discussione

Le piastrine sono molto sensibili al loro ambiente, compreso lo stress da taglio e la presenza di agonisti38,39. Ciò rende le piastrine difficili da maneggiare e isolare, rendendo fondamentale l'uso di inibitori e pipette a foro largo40. La corretta conservazione e preparazione dell'IGP2 è fondamentale, poiché la mancata preparazione dell'IGP2 nel PBS di base comporterà una rapida deg...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da segnalare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la dottoressa Emily Janus-Bell e Clarisse Mouriaux del laboratorio del dottor Pierre Mangin e Katrina Bark del laboratorio del dottor Jorge DiPaola per la loro guida e i loro consigli.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ Filtro M Provette Spin-XMillapore-SigmaCLS8160Preparazione dei reagenti
Ago da 19 G x 3/4"McKesson Corporation448406Flebotomia
21 G Ago da 1,5 pollici con luer lockAmazonB0C39PJD23Preparazione dei reagenti Piastra
96 pozzetti, mezza areaGreiner Bio-One675101Citometria a flusso
ACD-A vaccutainer Fisher Scientific 364606flebotomia
McKesson Corporation609Flebotomia
Tampone alcolicoVWR15648-916Flebotomia
Apirasi da patateSigmaA6410-100UNPreparazione del reagente
CD42a Anticorpo monoclonaleThermo Fisher Scientific48-0428-42Citometria
a flusso Refrigerato microcentrifuga ThermoFisher Scientific75002441Quenching
D-GlucoseSigmaG7021Preparazione dei reagenti
FITC Anticorpo anti-fibrinogenoAbcam4217Citometria a flusso
Citometroa flusso Beckman Coulter82922828Citometria a flusso
GarzaVWR76049-110Flebotomia
GliceroloSigma AldrichG5516Preparazione dei reagenti
HEPESSigma AldrichH4034Preparazione dei reagenti
Alfa-trombina umanaProlytixHCT-0020Citometria a flusso
KClSigmaAldrich P9333Preparazione dei reagenti
KH2PO4Sigma AldrichP5655Preparazione dei reagenti
MgCl2SigmaM8266Preparazione dei reagenti
Provette per microcentrifugaVWR87003-292Generale
Na2HPO4SigmaS3264Preparazione dei reagenti
NaClSigma AldrichS7653Preparazione dei reagenti
NaHCO3SigmaAldrich S5761Preparazione dei reagenti
Pipetta di trasferimento a foro strettoVWR16001-176Lavaggio piastrinico
Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692Citometria a flusso
PECy5 Topo Anti-Umano CD62PBD Pharmingen551142Citometria a flusso
Coperchio della piastraThermo Fisher ScientificAB0626Citometria a flusso
Polipropilene 15 mL provette conicheVWR89039-658Preparazione dei reagenti
Polipropilene 50 mL provette conicheVWR352070Lavaggio delle piastrine
Prostaglandina I2 (sale sodico)Cayman Chemical18220Preparazione dei reagenti
SKC Inc. Emocitometri monouso C-ChipScientific22-600-100Siringa per conteggio cellulare
BD Pharmingen14-823-41Preparazione
dei reagentiLaccio emostaticoVWR76235-371Flebotomia
Porta ago vacutainerBD364815Vortex per flebotomia
VWR102091-234Preparazione dei reagenti
BagnomariaThermo Fisher ScientificTSGP02Lavaggio piastrinico
Pipetta di trasferimento a foro largoVWR76285-362Lavaggio piastrine
a Adattatore per Fisher

Riferimenti

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