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Articolo metodologico

Valutazione della fagocitosi microgliale dei detriti mielinici in vitro sotto stimolazione magnetica ripetuta

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DOI:

10.3791/67642

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17 giugno 2025

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1Department of Rehabilitation Medicine, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, 2Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Children's Rehabilitation, Linyi People's Hospital, 4Department of Endocrinology, People's Hospital of Dongxihu District, 5Department of Rehabilitation, Hengyang Medical School, The First Affiliated Hospital, University of South China

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo è stato ideato per valutare l'effetto della stimolazione magnetica ripetitiva sulla capacità della microglia di fagocitare i detriti di mielina. A tal fine è stato istituito un sistema di co-coltura in vitro di microglia e detriti di mielina.

Abstract

Le microglia, i fagociti residenti del sistema nervoso centrale (SNC), svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità e dell'omeostasi del SNC rimuovendo le cellule danneggiate, i detriti cellulari e i residui di mielina. L'accumulo di detriti mielinici è implicato in una serie di disturbi del SNC, tra cui la sclerosi multipla, il morbo di Alzheimer, le lesioni cerebrali traumatiche e le lesioni del midollo spinale. La presenza di detriti di mielina non solo esacerba la neuroinfiammazione, ma ostacola anche il potenziale rigenerativo della mielina. Pertanto, migliorare la capacità delle microglia di eliminare i detriti mielinici attraverso la fagocitosi rappresenta una strategia terapeutica promettente. La stimolazione magnetica è emersa come una modalità di trattamento innovativa per le malattie del SNC, con prove crescenti che suggeriscono il suo potenziale nel promuovere la fagocitosi microgliale e supportare il recupero del SNC. Per chiarire ulteriormente gli effetti della stimolazione magnetica sulla clearance microgliale dei detriti mielinali, abbiamo progettato un esperimento in vitro che coinvolge la co-coltura di microglia e detriti di mielina. La co-coltura è stata sottoposta a stimolazione magnetica ripetitiva per valutarne l'impatto sull'attività fagocitaria microgliale nel contesto della patologia del SNC.

Introduzione

La mielina è una struttura stabile della membrana tubulare che circonda gli assoni prodotta dagli oligodendrociti nel sistema nervoso centrale (SNC). Questa guaina mielinica svolge un ruolo fondamentale nel facilitare la propagazione rapida ed efficiente dei potenziali d'azione1. Tuttavia, vari disturbi neurologici, come la sclerosi multipla (SM), l'ictus e le lesioni traumatiche, tra cui la lesione del midollo spinale (SCI) e la lesione cerebrale traumatica (TBI), possono portare alla perdita dell'integrità della mielina. Ciò si traduce nella generazione di detriti mielinici a causa della rottura della guaina mielinica e del danno diretto alle strutture mieliniche 2,3,4. L'accumulo di detriti di mielina non solo impedisce la rimielinizzazione e il recupero funzionale, ma esacerba anche la neuroinfiammazione 5,6. Pertanto, un'efficace rimozione dei detriti mielinici è essenziale per risolvere la neuroinfiammazione, promuovere la rigenerazione assonale e ripristinare l'omeostasi nel sistema nervoso a seguito di malattie neurologiche.

I detriti di mielina vengono eliminati principalmente dai fagociti, come i macrofagi e le microglia nel sistema nervoso centrale (SNC). Le microglia, le cellule immunitarie residenti nel SNC, monitorano costantemente il loro ambiente alla ricerca di potenziali minacce e proteggono il SNC rimuovendo la mielina danneggiata e i detriti di mielina. Inoltre, la fagocitosi microgliale svolge un ruolo cruciale nel promuovere la neurogenesi attraverso la rimozione dei detriti 7,8. Prove crescenti suggeriscono che il miglioramento della fagocitosi microgliale dei detriti mielinici può mitigare gli effetti dannosi dell'infiammazione, ridurre il danno al SNC e promuovere la rigenerazione assonale dopo lesioni nervose. 4,9,10.

La terapia di stimolazione magnetica, una tecnica di neuromodulazione non invasiva, ha guadagnato un uso diffuso nel trattamento di vari disturbi neurologici11. In particolare, la stimolazione magnetica transcranica ripetuta (rTMS) si è dimostrata promettente come approccio terapeutico per la malattia di Alzheimer (AD), le lesioni cerebrali e l'ictus 12,13,14. Uno studio recente ha dimostrato che la rTMS può migliorare la fagocitosi microgliale dell'amiloide-beta (Aβ) e dell'apolipoproteina E (ApoE), inibendo così la progressione patologica dell'AD nei modelli animali15. Allo stesso modo, il nostro recente lavoro ha scoperto che la stimolazione magnetica transspinale ripetuta (rTSMS) promuove la fagocitosi microgliale dei detriti mielinici a seguito di lesioni del midollo spinale nei ratti16.

Tuttavia, l'impatto della stimolazione magnetica ripetitiva sulla microglia è stato prevalentemente dimostrato attraverso modelli sperimentali negli animali 17,18,19. Infatti, è stato dimostrato che la stimolazione magnetica modula l'eccitabilità neuronale attraverso l'induzione di correnti20. Di conseguenza, non si può ignorare che l'interazione tra neuroni e microglia può influenzare la funzione della microglia. Di conseguenza, la sperimentazione in vitro è necessaria per accertare se l'impatto della stimolazione magnetica sulla microglia sia indipendente dall'alterazione dell'eccitabilità neuronale. Studi recenti hanno identificato un effetto modulatorio della stimolazione magnetica ripetitiva sulla microglia in modelli sperimentali. Alcuni studi hanno dimostrato che la stimolazione magnetica ripetitiva potrebbe promuovere la polarizzazione della microglia verso M219,21. Tuttavia, ulteriori esplorazioni sulla sua funzione microgliale rimangono da chiarire. In particolare, Amelie Eichler et al. sono intervenuti in fette di tessuto cerebrale in vitro utilizzando la stimolazione magnetica a 10 Hz e hanno scoperto che la stimolazione magnetica a 10 Hz era in grado di promuovere il rilascio di citochine dalla microglia per influenzare l'eccitabilità e la plasticità neurale22. Sebbene questo studio abbia ampliato la comprensione degli effetti della stimolazione magnetica sulla microglia, sono necessarie ulteriori indagini a livello cellulare per chiarire completamente i suoi meccanismi.

Pertanto, abbiamo stabilito un protocollo per verificare se la stimolazione magnetica può promuovere la fagocitosi dei detriti di mielina in vitro. A differenza dei detriti di mielina dopo una malattia o un danno tissutale, che è un prodotto di una lesione, i detriti di mielina utilizzati in questo esperimento hanno la forma della guaina mielinica dopo che si è rotta. Inoltre, il concetto di detriti di mielina è un prodotto della disintegrazione della mielina. In quanto cellule fagocitiche primarie del cervello, le microglia svolgono un ruolo fondamentale nell'eliminazione delle cellule danneggiate e dei detriti mielinici23, che è associato a malattie come la sclerosi multipla e l'Alzheimer24,25. È stato dimostrato che l'accumulo di detriti mielinici esacerba la neuroinfiammazione e ostacola la rigenerazione26. L'obiettivo dello studio è quello di indagare il potenziale della stimolazione magnetica per migliorare la fagocitosi microgliale dei detriti di mielina, riducendo così la neuroinfiammazione e supportando il recupero del SNC in condizioni neurodegenerative e traumatiche. In sintesi, lo studio impiega un approccio di co-coltura, in base al quale le microglia vengono co-coltivate con detriti di mielina e viene eseguita una stimolazione magnetica ripetuta al fine di verificare l'effetto della stimolazione magnetica ripetitiva sulla capacità fagocitaria della microglia.

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Protocollo

Qui, tre ratti femmina SD (di età compresa tra 2 e 3 settimane) sono stati utilizzati per estrarre detriti di mielina mediante centrifugazione a gradiente di saccarosio. Tutti i ratti sono stati acquistati presso l'Animal Core Facility della Nanjing Medical University, Nanjing, Cina (Licenza animale: SYXK (Su) 2021-0023). Tutti i ratti sono stati allevati in condizioni di controllo (temperatura 22 ± 2 °C, un periodo di luce/buio di 12 ore/12 ore, 55% ± 5% di umidità relativa). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina di Nanchino (n. IACUC-1903031 e n. IACUC-2005001) e miravano a ridurre al minimo la sofferenza e il numero di animali utilizzati.

1. Isolamento della mielina

NOTA: I detriti di mielina sono stati estratti come descritto in precedenza e sono state apportate alcune modifiche27. Assicurarsi che tutti i passaggi siano stati eseguiti a 4 °C e in condizioni sterili.

  1. Isolamento della mielina grezza
    1. Estrazione del tessuto cerebrale
      1. Dopo l'anestesia con pentobarbital (50 mg/kg, iniezione intraperitoneale), valutare la profondità dell'anestesia in base alla risposta al pizzicamento delle dita. Decapita le femmine di ratto. Sezionare l'intera testa sul ghiaccio e dividere in due il cranio con le forbici per esporre completamente il cervello e facilitare la rimozione dell'intero cervello.
      2. Asportare le membrane, il cervelletto e l'ippocampo con forbici e pinze in modo meticoloso e asettico per prevenire la contaminazione della miscela di saccarosio del tessuto cerebrale. Pulisci il cervello 3 volte con PBS per rimuovere eventuali residui di sangue o tessuto.
      3. Trasferire il cervello pulito in 10 ml di soluzione sterile di saccarosio 0,32 M e tagliare il tessuto cerebrale con le forbici microchirurgiche in3 pezzi da 5 mm per ottenere una miscela di saccarosio per tessuto cerebrale.
    2. Omogeneizzazione del tessuto cerebrale
      1. Trasferire la miscela di saccarosio del tessuto cerebrale in un omogeneizzatore sterile da 50 ml e aggiungere 30 ml di soluzione sterile di saccarosio 0,32 M. Utilizzare un omogeneizzatore in vetro da 50 ml per omogeneizzare per 2 minuti per ottenere un omogeneizzato di tessuto cerebrale liscio.
      2. Diluire l'omogeneizzato di tessuto cerebrale a 90 mL con una soluzione sterile di saccarosio 0,32 M, mescolare e dosare lentamente nella parte superiore di sei provette sterili per ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile da 38,5 mL contenenti 20 mL di soluzione sterile di saccarosio 0,83 M. Aggiungere 15 mL di omogeneizzato a ciascuna provetta da centrifuga e quindi livellare con una soluzione sterile di saccarosio 0,32 M.
    3. Raccolta di detriti di mielina grezza
      1. Preraffreddare il rotore di un'ultracentrifuga a 4 °C e centrifugare il campione a 75.000 x g per 45 minuti. Dopo il processo di centrifugazione, raccogliere i detriti di mielina dall'interfaccia tra le due densità di saccarosio utilizzando una provetta Pasteur sterile.
        NOTA: Durante il processo di raccolta, è indispensabile prestare attenzione ed evitare di raccogliere inavvertitamente altri componenti del campione contaminato.
  2. Prima separazione e purificazione isotonica
    1. Trasferire la soluzione di detriti di mielina raccolta in una provetta da centrifuga da 50 mL e regolare il volume a 35 mL con tampone salino sterile tamponato con fosfato (PBS) pre-raffreddato. Trasferire la soluzione in un nuovo omogeneizzatore sterile da 50 mL e omogeneizzare per 2 minuti per ottenere un omogeneizzato.
    2. Distribuire uniformemente l'omogeneizzato di detriti di mielina in sei provette sterili per ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile da 38,5 mL, aggiungendo un tampone PBS sterile. Sottoporre le provette a centrifugazione a 75.000 x g per 45 min a 4 °C.
  3. Seconda separazione e purificazione isotonica
    1. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet bianco solido in 10 mL di tampone PBS sterile pre-raffreddato per ottenere una sospensione di detriti di mielina. Distribuire uniformemente la sospensione in due provette sterili da ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile da 38,5 mL, bilanciando il volume con l'aggiunta di tampone PBS sterile.
    2. Centrifugare i campioni a 4 °C a 75.000 x g per 45 minuti.
  4. Raccolta di mielina purificata
    1. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet bianco solido in 6 mL di tampone PBS sterile. Dividere la sospensione di detriti di mielina in sei provette da centrifuga da 1,5 mL e quindi sottoporla a centrifugazione a 4 °C e 12.000 x g per 10 minuti.
    2. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet bianco solido in 100 μl di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) pre-raffreddata.
  5. Quantificazione dei detriti mielinici
    1. Prelevare 3 μl della sospensione di detriti di mielina per la quantificazione del contenuto proteico utilizzando un kit di quantificazione delle proteine BCA. Conservare la restante sospensione di detriti di mielina a -80 °C.

2. Marcatura fluorescente dei detriti di mielina

  1. Incubazione dell'estere N-succinimidil estere del diacetato di carbossifluoresceina
    1. Scongelare i detriti di mielina necessari a 4 °C o con acqua ghiacciata e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere i detriti di mielina in 200 μL di soluzione di carbossifluoresceina diacetato N-succinimidil estere (CFSE; 50 μM).
    2. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Dopo il periodo di incubazione, centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    3. Scartare il surnatante e lavare i campioni 3 volte con 500 μL di tampone PBS sterile. Dopo il processo di lavaggio, risospendere i detriti di mielina in 100 μL di tampone PBS sterile pre-raffreddato per ottenere una sospensione di detriti di mielina marcati in fluorescenza, che può essere conservata a -80 °C.

3. Coltura della microglia

  1. Coltura di cellule BV-2 in CO2 umidificata al 5% a 37 °C nel terreno di Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con FBS al 10% (v/v), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/mL). Seminare quasi il 50% di cellule Bv-2 nella piastra a 12 pozzetti e nella piastra a 24 pozzetti per ulteriori test.

4. Stimolazione magnetica ripetuta in vitro

  1. Eseguire l'intervento di stimolazione magnetica ripetuta in vitro con la seguente impostazione: frequenza di trattamento di 20 Hz, intensità di trattamento dell'1% dell'intensità massima di uscita (es. 0,035 Tesla), tempo di stimolazione di 5 s, tempo di riposo di 20 s. Somministrare 600 impulsi con un tempo di trattamento singolo di 2,5 minuti.
  2. Durante la stimolazione magnetica, posizionare il centro della bobina in allineamento con il centro della piastra di coltura e assicurarsi che la bobina aderisca perfettamente alla parte inferiore della piastra di coltura.
    1. Predeterminare i parametri della stimolazione magnetica e fissare la direzione della bobina di stimolazione magnetica in modo che sia perpendicolare al suolo e orientata verso l'alto. Sterilizzare la bobina di stimolazione magnetica con alcol per evitare la contaminazione da parte delle cellule.
    2. Successivamente, recuperare la piastra di coltura cellulare dall'incubatore e posizionarla sopra la bobina di stimolazione magnetica per la stimolazione magnetica. Sterilizzare la piastra spruzzando alcol su di essa, quindi rimetterla nell'incubatrice. Mantenere la piastra coperta durante tutto il processo.

5. Test di fagocitosi microgliale di detriti mielinici

  1. Trattamento di stimolazione magnetica ripetuta per il gruppo LPS+rMS
    1. Utilizzare CFSE (50 μM) per marcare i detriti di mielina per valutare la fagocitosi. Piastra 1 x 104 celle BV-2 in piastre a 24 pozzetti durante la notte. Cambiare il terreno in un terreno privo di siero e trattare le cellule con lipopolisaccaride (LPS; 1 μg/mL) per 12 ore. Aspirare delicatamente il vecchio terreno utilizzando una pipetta, quindi aggiungere immediatamente il nuovo terreno privo di siero utilizzando la pipetta.
    2. Dopo un periodo di 12 ore di intervento LPS, aggiungere i detriti di mielina (100 μg/mL) al terreno per la co-coltura in condizioni di oscurità. Sottoporre le cellule a ripetuti interventi di stimolazione magnetica come descritto al punto 4.2.
  2. Immunofluorescenza e imaging
    1. Lavare delicatamente i detriti di mielina non adsorbiti con PBS e fissare le cellule con PFA al 4% per 15 minuti. Bloccare le cellule con PBS contenente il 10% di albumina sierica d'asina e lo 0,3% di Triton X-100 per 1 ora a temperatura ambiente, quindi lavare con PBS e incubare con anticorpo primario (IBA-1, 1:200) a 4 °C per una notte.
    2. Incubare le cellule con anticorpi secondari (1: 300, topo) per 2 ore a temperatura ambiente. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio confocale a 40x e 20x.

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Risultati

In questo studio, abbiamo inizialmente alimentato cellule microgliali BV-2 in vitro estraendo detriti di mielina derivati dal cervello e utilizzando la stimolazione magnetica ripetitiva per migliorare la loro capacità fagocitica. Successivamente, le cellule della microglia BV-2 sono state coltivate e sottoposte all'intervento di LPS prima della stimolazione magnetica, emulando così lo stato in vivo della microglia sotto rigorosa convalida neurologica. Successivamente, l'intervento rMS è stato applicato ...

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Discussione

La stimolazione magnetica ripetitiva (rMS) è una tecnica di neurostimolazione non invasiva che è stata ampiamente applicata nel trattamento di vari disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui disturbi cognitivi, morbo di Alzheimer (AD), ictus, lesioni cerebrali e lesioni del midollo spinale (SCI). La rMS utilizza un campo magnetico pulsato per modulare il potenziale di membrana dei neuroni, influenzando selettivamente l'eccitabilità neurale all'interno del sistema nervoso

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82302877, 82172541), della Natural Science Foundation of Hunan Province (2023JJ30549).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreno di montaggio antisbiadimento con DAPIBeyotime, CinaKit BCA P0131
ThermoFisher Scientific, America23227
Celle Bv-2 ATCCCBP60922
Piastre per colture cellulari a 12 pozzettiBiofil, Cina
Piastre per colture cellulari a 24 pozzettiBiofil, Cina
Scansione laser confocale MicroscopioZeiss, Germania800
Incubatore a temperatura costanteThermoFisher Scientific, America
CFSEMedChemExpress, AmericaHY-158820
DMEM-Terreno di colturaKeyGen, CinaKGL1202-500
FBSGibco, America16250078
Iba1Abcam, Americaab48004
Apparecchio di stimolazione magneticaYiruide, CinaCCY-IA
Bobina di stimolazione magneticaYiruide, Cina
ParaformaldeideBioSharp, Cina
PBSKeyGen, CinaKGL2210-500
Penicillina-StreptomicinaGibco, America15140-122
SaccarosioMedChemExpress, AmericaHY-B1779
TripsinaKeyGen, CinaKGL2107-100
UltracentrifugaBeckman, AmericaL-100XP

Riferimenti

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Co-coltura in vitroSistema nervoso centraleMicroglia BV-2Microscopia confocaleTrattamento con lipopolisaccarideIsolamento di detriti mieliniciNeuroinfiammazione
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