Articolo metodologico

Isolamento di piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali da campioni di grande volume con conformità GMP per studi clinici

DOI:

10.3791/67644

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28 marzo 2025

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1Southwest Hospital/Southwest Eye Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 2Key Lab of Visual Damage and Regeneration & Restoration of Chongqing, 3Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 4Institute of Pathology and Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University) and Key Laboratory of Tumor Immunopathology, 5Army 953 Hospital, Shigatse Branch of Xinqiao Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 6Jinfeng Laboratory, 7Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Army Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEVs) sono state evidenziate come una modalità di trattamento priva di cellule con effetti avversi minimi. Questo studio fornisce un protocollo che combina l'emodialisi con l'ultracentrifugazione, riducendo significativamente il tempo dedicato all'intero processo e garantendo la conformità agli standard delle buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Abstract

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Le piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEVs) sono state evidenziate come una modalità di trattamento cell-free con effetti avversi minimi. Al contrario, i metodi di estrazione tradizionali come l'ultracentrifugazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale sono limitati dall'intensità del tempo, dal costo e dalla scalabilità. Per superare questi limiti, proponiamo un metodo che integra un emodializzatore e un'ultracentrifugazione. Questo approccio utilizza un dispositivo per emodialisi con una membrana di cut-off del peso molecolare (MWCO) da 100 kDa, che concentra selettivamente le sEV filtrando una pletora di proteine, migliorando così la resa e la purezza delle sEV. Questa fase iniziale di purificazione è seguita dall'ultracentrifugazione per affinare ulteriormente la preparazione della sEV. L'integrazione di queste due tecnologie non solo ha ridotto significativamente il tempo dedicato all'intero processo, ma ha anche garantito la conformità agli standard GMP (Good Manufacturing Practice). Il metodo dimostra un'elevata efficienza nell'isolamento delle sEV da un grande volume di campioni, offrendo un progresso significativo rispetto ai metodi tradizionali. Questo protocollo promette di accelerare la traduzione delle terapie basate sulle vescicole extracellulari nella pratica clinica, fornendo una soluzione scalabile, economica e conforme alle GMP.

Introduzione

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Le piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEV) sono vescicole eterogenee arricchite con molteplici componenti come mRNA, micro-RNA, citochine, lipidi e metaboliti1. Negli ultimi anni, molti studi hanno sottolineato l'immenso potenziale terapeutico delle MSC-sEV come modalità di trattamento senza cellule con effetti avversi minimi2, dimostrandosi promettenti nell'affrontare uno spettro di condizioni, tra cui l'invecchiamento, la degenerazione tissutale, il cancro e il disturbo infiammatorio 3,4,5,6. Ciononostante, persiste una sfida critica nell'estrazione su larga scala di sEV, con i metodi tradizionali che si dimostrano laboriosamente dispendiosi in termini di tempo o economicamente irrealizzabili. Inoltre, garantire la riproducibilità è fondamentale per l'applicazione clinica e la traduzione delle terapie basate su EV7. I ricercatori hanno un disperato bisogno di un metodo di purificazione che non sia solo semplice ed efficiente, ma anche conforme agli standard di buona pratica di fabbricazione (GMP)8.

I metodi di purificazione convenzionali, tra cui l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale, l'immunoaffinità e la precipitazione polimerica, sono stati ampiamente applicati in ricerche precedenti9. In generale, i metodi tradizionali per l'isolamento delle sEV presentano limitazioni come basso tasso di resa, purezza compromessa e sfide nel soddisfare rigorosi standard asettici. Inoltre, ricerche precedenti hanno riportato il potenziale di tecniche promettenti come i sistemi microfluidici10,11, l'isolamento magnetico senza marcatura12 e l'isolamento chimico covalente13 per ottenere prestazioni eccezionali. Tuttavia, la necessità di attrezzature specializzate rende queste tecniche avanzate difficili da adottare per la maggior parte dei team di ricerca. In sintesi, il metodo efficiente per isolare le sEV di grado GMP da un grande volume di campioni rimane un ostacolo critico, limitando il progresso di numerosi team sia nella ricerca che nelle applicazioni cliniche.

L'ultracentrifugazione è il metodo più adottato per l'isolamento delle sEV ed è riconosciuto come il metodo gold standard14,15. Si tratta di una tecnica che sfrutta le differenze di densità e dimensioni per isolare le sEV. Le sEV isolate vengono comunemente risciacquate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per eliminare i contaminanti residui. Quindi, un volume appropriato di PBS viene generalmente utilizzato per risospendere le sEV risciacquate e diverse concentrazioni attese di sEV possono essere raccolte controllando il volume di PBS. Inoltre, è stato riportato che la purezza delle sEV plasmatiche ottenute mediante ultracentrifugazione sembra essere migliore di quella delle sEV plasmatiche isolate mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e le sEV ottenute mediante ultracentrifugazione hanno impurità inferiori alle particelle extracellulari non vescicolari (NVEP). Questo rende anche l'ultracentrifugazione la più utilizzata e difficile da sostituire in molti trattamenti che richiedono alte concentrazioni di sEV. Tuttavia, oltre alla qualità e alla purezza, anche l'efficienza è un fattore che non può essere ignorato nell'estrazione di grandi volumi di sEV. Finora, un singolo ciclo di ultracentrifugazione può supportare un volume di campione fino a circa 600 mL, il che determina che è difficile soddisfare la domanda di estrazione su larga scala con la sola ultracentrifugazione16.

Un dispositivo per emodialisi è costituito da un modulo basato su membrana che ospita migliaia di fibre cave. Il sangue circola attraverso queste fibre all'interno di una camera cilindrica chiusa17. I costituenti del sangue possono passare selettivamente attraverso queste membrane in base alle loro dimensioni molecolari e alla concentrazione ionica. In clinica, è ampiamente utilizzato come rene artificiale per rimuovere i prodotti di scarto e i liquidi in eccesso dal sangue dei pazienti 18,19,20. In altre parole, l'emodializzatore ha anche il potenziale per concentrare campioni di grandi volumi, basandosi su un processo simile alla filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Nelle recenti linee guida emesse dall'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), i concentrati di sEV sono considerati adatti per campioni di grande volume, come i terreni di coltura cellulare. Dopo decenni di sviluppo, gli emodializzatori sono stati ampiamente adottati negli ospedali, supportati da un'abbondanza di materiali di consumo maturi e da un pool di operatori qualificati, che rende più facile mantenere sterile il campione.

Questo studio presenta un metodo di purificazione sEV basato su un emodializzatore e un'ultracentrifuga compatibile con le GMP. In questo caso, abbiamo scelto dializzatori con cut-off del peso molecolare (MWCO) di 100 kDa, che hanno dimostrato di catturare efficacemente le sEV e filtrare numerose proteine22. L'ultracentrifugazione fornisce anche una fase per un'ulteriore purificazione. Il lavoro dimostra che l'emodializzatore è ugualmente adatto per la concentrazione di sEVs. Questo protocollo consente ai ricercatori di isolare in modo efficiente le sEV da campioni di grandi volumi. Abbiamo registrato lo studio clinico nel registro cinese degli studi clinici (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), che è ancora in corso e non è stato ancora completato. Sebbene i dati clinici non siano prontamente disponibili per la pubblicazione in questo momento, un metodo affidabile, su larga scala, efficiente e conforme per la produzione di sEV come riportato in questo protocollo è un prerequisito per condurre studi preclinici e clinici.

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Protocollo

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Il protocollo è stato approvato e condotto in conformità con il Comitato Etico per la Ricerca Umana del Southwest Hospital.

1. Rimozione dei detriti cellulari dal terreno di coltura

NOTA: Le procedure seguenti devono essere eseguite in un ambiente conforme alle GMP, soprattutto quando i campioni possono essere esposti direttamente all'ambiente.

  1. Dato il requisito di assenza di microbiota, assicurarsi che il filtro e il tubo di gomma siano sterilizzati in autoclave per una sterilizzazione efficace. Assicurarsi che tutti gli altri materiali di consumo che potrebbero incontrare il terreno di coltura siano sterili e in confezioni sigillate. Eseguire il processo di rimozione dei detriti cellulari in una cappa a flusso laminare.
  2. Assemblare la membrana di filtrazione da 0,45 μm e 0,22 μm all'apparato filtrante. Collegare una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali) e l'apparato filtrante con il tubo di gomma. Posizionare la membrana da 0,45 μm sopra la membrana da 0,22 μm; in caso contrario, potrebbe diminuire l'efficienza di filtrazione (Figura 1). Prestare attenzione a distinguere tra i lati anteriore e posteriore della membrana di microfiltrazione.
  3. Avviare la pompa peristaltica per la filtrazione. Alimentato dalla pompa, il terreno basale delle cellule staminali mesenchimali (MSCBM) con un supplemento del 5% (vedi Tabella dei materiali) passa attraverso il filtro da un'estremità e il terreno di coltura filtrato può essere ottenuto all'altra estremità del filtro, come mostrato in (Figura 1). Raccogliere il terreno di coltura filtrato in una sacca di drenaggio con doppi canali. Mantenere l'integrità del sistema di filtrazione ottimizzando la velocità della pompa peristaltica e sostituendo la membrana filtrante secondo necessità.
  4. Al termine della filtrazione, chiudere la valvola di ingresso sulla sacca di drenaggio e sigillarla ulteriormente con parafilm (vedere la Tabella dei materiali). Continuare con il passaggio successivo o conservare temporaneamente il terreno di coltura cellulare filtrato a 4 °C.

2. Concentrare il terreno di coltura filtrato con un emodializzatore

NOTA: Astenersi dall'utilizzare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente rosso fenolo in coltura cellulare, poiché il rilevatore di perdite di sangue nell'emodializzatore verrà attivato o spegnerà il rilevatore di perdite di sangue nell'impostazione dell'emodializzatore.

  1. Preparare i materiali di consumo.
    1. Preparare le linee di sangue, le membrane in polisulfone ad alto flusso MWCO da 100 kDa, il dializzatore del sangue, il set per infusione, la soluzione salina fisiologica, la sacca per infusione, la soluzione di iodio e i tamponi di cotone prima della concentrazione (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Accensione del sistema e autotest.
    1. Controllare il collegamento del cavo di alimentazione dell'emodializzatore e accendere l'alimentazione principale.
    2. Attendere che la macchina completi l'intera procedura di autodiagnosi.
  3. Installa le linee di sangue e il dializzatore.
    1. Verificare le date di scadenza delle linee di sangue monouso e del dializzatore, assicurandosi dell'integrità della loro confezione esterna e controllando eventuali danni alle linee.
    2. Installare il tubo nella stessa direzione del flusso sanguigno nel circuito extracorporeo, chiudendo in sequenza le valvole di derivazione per formare una circolazione a circuito chiuso.
  4. Avviare la procedura di risciacquo.
    1. Utilizzare un set per infusione per collegare la soluzione salina fisiologica (senza eparina) da un tubo prima della pompa al circuito di dialisi. Collegare il sito di raccolta venosa alla sacca del fluido di scarto.
      NOTA: La soluzione fisiologica non deve contenere eparina o altri anticoagulanti.
    2. Collegare le linee di alimentazione/ritorno del dializzatore al dializzatore.
    3. Avviare l'emodializzatore e impostare la portata a 80-100 mL/min. Espellere tutta l'aria dal circuito di dialisi e dal dializzatore per garantire che l'intero sistema di tubi sia pieno di liquido.
    4. Regolare il piano del liquido nelle camere arteriosa e venosa a circa 2/3 di pieno. La soluzione salina scorre in sequenza attraverso la linea arteriosa, il dializzatore, la linea venosa e la sacca del liquido di scarto.
  5. Avviare la concentrazione di ultrafiltrazione.
    1. Al termine della procedura di risciacquo, appendere la sacca di drenaggio contenente il terreno di coltura filtrato sul supporto per infusione, disinfettare il canale di uscita con tamponi di cotone imbevuti di iodio e collegare il canale di uscita della sacca di drenaggio a una porta pre-pompa utilizzando un set per infusione.
    2. Unisci la porta arteriosa e la porta venosa delle linee di sangue. Stabilire un circuito di dialisi di ultrafiltrazione isolato (ISO-UF, ultrafiltrazione senza flusso di dializzato) (Figura 1).
    3. Regolare il volume target di ultrafiltrazione sulla macchina per dialisi in modo che corrisponda al volume totale di liquido presente nella sacca di drenaggio. Impostare il tempo di dialisi dell'ultrafiltrazione sul tempo minimo di funzionamento del sistema. Dopo che i parametri sono stati impostati correttamente, avviare l'ultrafiltrazione.
      NOTA: A causa del calcolo del sistema di emodialisi, il tempo di dialisi non sarà troppo breve ma sarà mantenuto a una velocità più moderata.
  6. Ottenere il fluido concentrato.
    1. Dopo aver raggiunto il volume di disidratazione target, chiudere il morsetto arterioso e collegare la porta venosa a una sacca per infusione sterile.
    2. Aprire la porta di pre-pompaggio delle linee ematiche monouso dotate di filtro dell'aria. Attivare la pompa del sangue a una velocità di circa 50 ml/min, consentendo al fluido all'interno delle linee sanguigne di circolare nuovamente dalla linea arteriosa alla linea venosa. Ritrarre tutto il fluido concentrato, circa 158 ml, dal circuito nella sacca sterile per infusione.
    3. Nella fase avanzata della concentrazione, raccogliere il liquido di scarto dalla linea di ritorno del dializzato. Applicare processi successivi identici a quelli del terreno di coltura concentrato al campione di fluido sprecato per monitorare eventuali perdite accidentali di sEV che potrebbero essersi verificate durante la concentrazione.
    4. Chiudere tutte le valvole e rimuovere la sacca per infusione, il dializzatore e tutte le linee. Spegnere l'alimentazione e disinfettare la macchina strofinandola.

3. Separazione delle sEV con ultracentrifuga

  1. Trasferire il terreno di coltura concentrato in provette per ultracentrifuga e quindi bilanciarle.
  2. Centrifugare in un'ultracentrifuga di grado clinico (vedi Tabella dei materiali) a 110.000 × g per 70 minuti, quindi lavare il pellet con soluzione salina sterile e procedere con una seconda centrifugazione a 110.000 × g per altri 70 minuti.
  3. Risospendere le sEV pellettate in una quantità appropriata di soluzione salina sterile.
  4. Trasferire le sEV in una provetta sterile per ulteriori test o conservarle a -80 °C per un uso futuro.

4. Caratterizzazione delle sEV ottenute

  1. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    1. Diluire le sEV ottenute (1 μL) con PBS (1 mL) (vedi Tabella dei materiali). Regolare il numero di sEV visibili nel campo visivo corrente in modo che sia compreso tra 50 e 200.
    2. Iniettare con cura il campione diluito nel pozzetto del campione, evitando l'introduzione di bolle d'aria.
    3. Eseguire la misurazione quando il numero di particelle nel campo visivo è il più alto e stabile possibile per tutte le posizioni. I parametri di analisi sono i seguenti: Area massima: 1000, Area minima: 10, Luminosità minima: 30, Lunghezza traccia: 15, Temperatura: 25 °C, Sensibilità: 75.
    4. Misurare ogni campione almeno tre volte.
  2. Analisi del Western blotting
    1. Soluzione diluita di sEVs in PBS. Utilizzare un kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinnico (BCA) (vedere la Tabella dei materiali) per misurare la concentrazione proteica.
    2. Far bollire i sEV nel tampone del campione a 100 °C per 5 minuti.
    3. Preparare un gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 12% (SDS-PAGE) (vedi Tabella dei materiali). Assemblare l'apparecchio per elettroforesi su gel. Caricare quantità uguali di proteine di ciascun campione nei pozzetti del gel SDS-PAGE. Impostare la tensione dell'elettroforesi a 80 V per la concentrazione e a 100 V per la separazione.
    4. Attivare la membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF) (vedere la Tabella dei materiali) con metanolo per 1 minuto, quindi immergere la membrana in PVDF nel tampone di trasferimento prima di procedere con il trasferimento a 100 V per 1 ora.
    5. Immergere la membrana PVDF in tampone TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) contenente il 5% di albumina sierica bovina (BSA; vedere Tabella dei materiali) e quindi bloccare per 30 minuti.
    6. Incubare la membrana in PVDF con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C su un agitatore. Gli anticorpi primari utilizzati sono i seguenti: anti-CD63 umano (diluizione 1:1000), anti-CD9 umano (diluizione 1:1000) e anti-HSP70 umano (diluizione 1:1000) (vedi Tabella dei materiali).
    7. Il giorno successivo, lavare la membrana in PVDF con la soluzione di TBST cinque volte per 5 minuti ciascuna e quindi incubare con anticorpo secondario coniugato HRP (diluizione 1:10000) (vedere la Tabella dei materiali) a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
    8. Dopo aver lavato con TBST cinque volte, utilizzare un reagente di rilevamento della chemiluminescenza per l'imaging su un sistema a chemiluminescenza.
  3. Microscopia elettronica a trasmissione
    1. Aggiungere una goccia di campione diluita con PBS da 20 μl a una carta oleata. Quindi, posizionare una griglia di rame (vedere Tabella dei materiali) sulla goccia in modo che la goccia del campione possa coprire la griglia di rame e lasciarla riposare a RT per 20 minuti.
    2. Assorbire il liquido in eccesso con carta da filtro. Quindi, fissare i campioni in una soluzione da 20 μL di paraformaldeide al 2%, glutaraldeide al 2% e una soluzione di fosfato 0,05 M per 2 minuti.
    3. Sciacquare la griglia di rame tre volte con acqua bidistillata, quindi colorare con 20 μL di acido fosfotungstico al 2% (PTA) per 1 minuto a RT.
    4. Assorbire il liquido ridondante con carta da filtro. Asciugare le griglie per una notte prima di essere analizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Le impostazioni consigliate per TEM sono le seguenti: Esposizione: 1,0 s, Tensione HT 100,00 kV, Corrente del fascio: 50 μA, Dimensione spot: 1, Modalità: TEM. Queste impostazioni potrebbero cambiare seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).

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Risultati

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Caratterizzazione morfologica delle sEV
Nella fase finale della concentrazione, anche il fluido sprecato è stato raccolto come descritto. Il mezzo concentrato e il fluido di scarto sono stati ultracentrifugati, rispettivamente. Abbiamo raccolto le precipitazioni per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Come anticipato, un numero significativo di nanovescicole a forma di coppa è stato osservato nel gruppo del mezzo concentrato (

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Discussione

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I metodi tradizionali per l'isolamento delle sEV includono l'ultracentrifugazione differenziale, la cromatografia ad esclusione dimensionale e la precipitazione PEG, ciascuno con i propri pregi e demeriti. Sebbene l'amalgama di queste tecniche disparate possa migliorare la resa o la purezza delle sEV, passaggi aggiuntivi spesso introducono maggiori opportunità di contaminazione del campione. Sul mercato sono emersi sistemi integrati che dichiarano di estrarre sEV in massa e di aderire ag...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Science Foundation of China (822101167, a BB) e della Natural Science Foundation di Chongqing (da CSTB2022NSCQ-MSX0020 a BB), del Chongqing PhD "Through Train" Scientific Research Project of China (CSTB2022BSXM-JCX0031 a BB) e della National Science Foundation of China (da 82271132 a YL). Siamo grati per l'assistenza del Dipartimento di Nefrologia, del Primo Ospedale affiliato, della Terza Università Medica Militare (Università Medica dell'Esercito) e dell'Istituto di Patologia e del Centro Oncologico del Sud-Ovest, dell'Ospedale del Sud-Ovest, della Terza Università Medica Militare (Università Medica dell'Esercito) per le attrezzature e il supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema SBI anti-CD63BiosciencesEXOAB-CD63A-1Diluizione 1:1000
SBI Anti-CD9BiosciencesEXOAB-CD9A-1Diluizione 1:1000
Sistema SBI Anti-HSP70BiosciencesEXOAB-Hsp70A-1Diluizione 1:1000
Kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinchoninicoBeyotimeP0012
BloodlinesFresenius Medical CuraAP16641
Albumina sierica bovina 5%Solarbio9048-46-8
Integratore per colture cellulariHeliosHPCPLCGL055% (v/v) in terreni di coltura cellulare
Griglia di rameRGRS preciso  GP-SMPG-1
DializzatoreHelixoneFX8100 kDa MWCO
Sacca di drenaggioCZRUIDEYLD-01
Capra  Anti-coniglio  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 diluizione
Capra  Anti-coniglio  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 diluizione
Capra  Anti-coniglio  HRP SBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-1Diluizione 1:10000
Cellule staminali mesenchimali Terreno basale (MSCBM)DakeweDKW34-BM20500
Membrana di microfiltrazioneshanghaixingyaWKLM-50-100.45 μ m e 0,22 μ m 
ParafilmFisher Scientific1337416
Pompa peristalticaLongerPumpYZ1515x
Soluzione salina tampone fosfatoSolarbioP1022-500ml
Immun-Blot Membrana PVDFBIO-RAD1620177
SDS-PAGE Gel Kit di preparazione rapidaBeyotimeP0012AC
SDS-PAGE Tampone di caricamento del campioneBeyotimeP0015A
Substrato di Western Blotting Super ECL PlusBIOGROUNDBG0001
Tampone TBSTSolarbioT1081
Provette per ultracentrifuga 38,5 mLBeckman344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Sistema di imagingBIO-RAD
HemodialyzerNIKKISODBB-27
Analisi di tracciamento delle nanoparticelleZetaViewPMX120Per misurare la distribuzione delle dimensioni
delle particelle e la concentrazione di particelle
Microscopia elettronica a trasmissioneJEOL JEM-1400PLUSImpostazioni consigliate? Esposizione: 1,0 s, HT Voltafe 100,00 kV, Larghezza corrente: 50 μ A, Dimensione spot: 1, Modalità: TEM.
UltracentrifugaBECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti Rotore a secchiello oscillante
Sistema

Riferimenti

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  1. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 17(2024).
  2. Xia, Y., Zhang, J., Liu, G., Wolfram, J. Immunogenicity of extracellular vesicles. Adv Mater. 36 (33), e2403199(2024).
  3. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  4. Harrell, C. R., Jovicic, N., Djonov, V., Arsenijevic, N., Volarevic, V. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and other extracellular vesicles as new remedies in the therapy of inflammatory diseases. Cells. 8 (12), 1605(2019).
  5. Lin, Z., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cancer therapy resistance: Recent advances and therapeutic potential. Mol Cancer. 21 (1), 179(2022).
  6. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  7. Syromiatnikova, V., Prokopeva, A., Gomzikova, M. Methods of the large-scale production of extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (18), 10522(2022).
  8. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  9. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  10. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7871(2023).
  11. Shin, S., et al. Separation of extracellular nanovesicles and apoptotic bodies from cancer cell culture broth using tunable microfluidic systems. Sci Rep. 7 (1), 9907(2017).
  12. Zeng, L., et al. Extraction of small extracellular vesicles by label-free and biocompatible on-chip magnetic separation. Lab Chip. 22 (13), 2476-2488 (2022).
  13. Dong, J., et al. Coupling nanostructured microchips with covalent chemistry enables purification of sarcoma-derived extracellular vesicles for downstream functional studies. Adv Funct Mater. 30 (49), 2003237(2020).
  14. Meng, Y., et al. Direct isolation of small extracellular vesicles from human blood using viscoelastic microfluidics. Sci Adv. 9 (40), eadi5296(2023).
  15. Martins, T. S., Vaz, M., Henriques, A. G. A review on comparative studies addressing exosome isolation methods from body fluids. Anal Bioanal Chem. 415 (7), 1239-1263 (2023).
  16. Börger, V., Staubach, S., Dittrich, R., Stambouli, O., Giebel, B. Scaled isolation of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e128(2020).
  17. Mohajerani, F., Clark, W. R., Ronco, C., Narsimhan, V. Mass transport in high-flux hemodialysis: Application of engineering principles to clinical prescription. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (5), 749-756 (2022).
  18. Zawada, A. M., et al. Impact of hydrophilic modification of synthetic dialysis membranes on hemocompatibility and performance. Membranes (Basel). 12 (10), 932(2022).
  19. Ghannoum, M., Roberts, D. M. Management of poisonings and intoxications. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (9), 1210-1221 (2023).
  20. Khan, M. S., et al. Managing heart failure in patients on dialysis: State-of-the-art review. J Card Fail. 29 (1), 87-107 (2023).
  21. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: Exodus. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  22. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  23. Koch, L. F., et al. Novel insights into the isolation of extracellular vesicles by anion exchange chromatography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1298892(2023).
  24. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  25. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  26. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  27. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).

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