Articolo metodologico

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

DOI:

10.3791/67648

⸱

31 gennaio 2025

 , 
1Department of Immunology, Harvard Medical School, 2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento di popolazioni vive immunitarie e non immuni dal polmone di topo allo stato stazionario e in seguito all'infezione influenzale. Fornisce inoltre strategie di gating per l'identificazione di sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il polmone è continuamente esposto ad agenti patogeni e altri stimoli ambientali nocivi, che lo rendono vulnerabile a danni, disfunzioni e sviluppo di malattie. Gli studi che utilizzano modelli murini di infezioni respiratorie, allergie, fibrosi e cancro sono stati fondamentali per rivelare i meccanismi di progressione della malattia e identificare i bersagli terapeutici. Tuttavia, la maggior parte degli studi incentrati sul polmone di topo dà la priorità all'isolamento delle cellule immunitarie o delle cellule epiteliali, piuttosto che di entrambe le popolazioni contemporaneamente. Qui, descriviamo un metodo per preparare una sospensione completa di singole cellule di popolazioni immunitarie e non immunitarie adatta per la citometria a flusso e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Queste popolazioni includono cellule epiteliali, cellule endoteliali, fibroblasti e una varietà di sottogruppi di cellule mieloidi. Questo protocollo prevede il lavaggio broncoalveolare e il successivo gonfiaggio dei polmoni con la dispasi. I polmoni vengono quindi digeriti in una miscela libera. Questo metodo di elaborazione libera una varietà di tipi di cellule diverse e si traduce in una sospensione di una singola cellula che non richiede la dissociazione manuale contro un filtro, promuovendo la sopravvivenza cellulare e producendo un numero elevato di cellule vive per le analisi a valle. In questo protocollo, definiamo anche schemi di gating per sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi sia nei polmoni naïve che in quelli infetti da influenza. L'isolamento simultaneo di cellule immunitarie e non immunitarie vive è fondamentale per interrogare il crosstalk intercellulare e ottenere una comprensione più profonda della biologia polmonare in salute e malattia.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il polmone è composto dalle vie aeree, dagli alveoli e dagli interstizi. Le cellule immunitarie e non immunitarie risiedono all'interno di questi compartimenti per contribuire sia alla funzione polmonare omeostatica (scambio gassoso) che alla difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali, come l'infezione virale. Le vie aeree grandi e piccole, o bronchi e bronchioli, sono rivestite da cellule epiteliali. Le cellule epiteliali predominanti in queste regioni sono le cellule club e ciliate che sono responsabili della secrezione di molecole protettive e della facilitazione della clearance mucociliare1. Gli alveoli sono le strutture più distali del polmone, rivestite da due tipi di cellule epiteliali, le cellule alveolari di tipo I (ATI) e le cellule alveolari di tipo II (ATII). Gli ATI sono responsabili dello scambio di gas e gli ATII secernono e riciclano i tensioattivi per garantire un'adeguata tensione superficiale 2,3. Gli ATII si autorinnovano e possono anche differenziarsi in ATI, un ruolo particolarmente rilevante dopo il danno polmonare4. Inoltre, gli ATII forniscono una nicchia di supporto per il principale tipo di cellule immunitarie che popolano la nicchia alveolare, i macrofagi alveolari (AM)5,6. Oltre all'epitelio, i fibroblasti, le cellule endoteliali e i macrofagi interstiziali (IM) (che possono essere associati sia ai nervi che ai vasi) comprendono l'interstizio 7,8,9,10. In risposta a infezioni e lesioni, numerose cellule polmonari muoiono e le cellule immunitarie, inclusi monociti e neutrofili, si infiltrano nel tessuto11,12. I monociti infiltranti i polmoni si differenziano in macrofagi e possono contribuire al compartimento dei macrofagi a lungo termine13.

Gli attuali metodi per preparare sospensioni di singole cellule dal polmone di topo sono generalmente a base di collagenasi e richiedono la dissociazione fisica del tessuto14. Ciò può comportare un basso numero di popolazioni di cellule non immunitarie vitali. Alcuni protocolli per isolare le cellule epiteliali sono basati sulla dispasi e producono proporzioni più elevate di cellule epiteliali vive; Tuttavia, questi protocolli generalmente non indagano la resa e la vitalità delle cellule immunitarie 15,16,17. La citometria a flusso è un metodo comune utilizzato per distinguere le popolazioni cellulari all'interno di un tessuto digerito. Al basale, il gating della citometria a flusso per AM, IM, monociti e neutrofili è chiaramente delineato. Tuttavia, durante l'infiammazione, il processo di gating diventa variabile e difficile da interpretare a causa del continuum nell'espressione del marcatore di superficie dei monociti infiltranti che si differenziano in macrofagi. Pertanto, il protocollo qui presentato delinea anche le strategie di gating per identificare le popolazioni di cellule mieloidi di interesse dopo l'infezione.

Una robusta dissociazione delle cellule epiteliali e mieloidi polmonari è essenziale per discernere le loro funzioni omeostatiche e infiammatorie. Un metodo per isolare questi compartimenti cellulari in parallelo consentirà l'analisi a valle dei tipi di cellule chiave che mantengono la salute e guidano la malattia. Una panoramica schematica del flusso di lavoro di questo protocollo è disponibile nella Figura 1.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è conforme alle linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Harvard Medical School (numeri di sovvenzione: R35GM150816 e P30DK043351). Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 8 e 12 settimane. Questo protocollo è adatto anche per i topi maschi. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dei materiali

  1. Scongelare gli enzimi necessari sul ghiaccio, tra cui la dispasi, la liberasi e la DNAsi.
  2. Preparare gli altri reagenti necessari. Riempire una siringa da 10 mL con 5 mL di EDTA da 2 mM in DPBS e inserirla con un ago da 27 G. Riempire la siringa da 1 ml con DPBS e collegare il catetere.

2. Prelievo dei polmoni

  1. Eutanasia del topo mediante iniezione intraperitoneale di 400-500 mg/kg e 25-100 mg/kg di miscela ketamina/xilazina (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Procedere con la dissezione quando il mouse non risponde al pizzicamento del poggiapiedi (~5 min).
    NOTA: Per l'eutanasia viene utilizzata una miscela di ketamina / xilazina al posto dell'anidride carbonica per prevenire l'emorragia indotta dal soffocamento e l'infiltrazione delle cellule immunitarie che possono confondere i risultati.
  2. Spruzzare il mouse con etanolo al 70%. Seziona il topo usando le forbici chirurgiche fini e le pinze #7. Fai un'incisione nell'addome usando le forbici e taglia lateralmente attraverso il peritoneo.
    1. Fai un piccolo taglio nel diaframma per rilasciare il vuoto. Tagliare il diaframma e la gabbia toracica inferiore dalla cavità corporea per esporre i polmoni e il cuore.
  3. Perfondere i polmoni con 5 mL di EDTA 2 mM in DPBS in una siringa da 10 mL dotata di un ago da 27 G. La perfusione viene eseguita entrando nella base del cuore con l'ago, diretto da destra nel ventricolo sinistro, ed erogando lentamente il liquido dalla siringa18.
    NOTA: La perfusione deve essere eseguita lentamente per evitare la rottura del sistema vascolare.
  4. Aprire la gabbia toracica allo sterno tagliando via i lati della gabbia toracica, quindi tagliare verticalmente attraverso lo sterno per esporre la trachea19. Taglia via quanto più muscolo e tessuto connettivo possibile usando forbici sottili e pinze #7 senza perforare la trachea o i polmoni.
  5. Avvolgere la trachea in una sutura (misura 2-0) come per legarla ma senza stringerla. Tagliare lateralmente la trachea e inserire il catetere. Fissare saldamente la sutura attorno al catetere tirando saldamente la sutura. Non inserire il catetere per più di 1 cm nel polmone.
  6. Gonfiare i polmoni con 1 mL di DPBS. Estrarre il DPBS tirando lentamente indietro la siringa. Gonfiare nuovamente i polmoni con lo stesso DPBS e tirare nuovamente indietro la siringa per raccogliere il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF).
  7. Scollegare la siringa dal catetere, lasciando il catetere inserito. Erogare BALF in una provetta da microcentrifuga.
  8. Riempire la stessa siringa da 1 mL con 1 mL di dispasi e ricollegarla al catetere. Erogare la siringa per gonfiare i polmoni con la dispasi. Durante la rimozione del catetere, stringere la sutura attorno alla trachea per evitare perdite di dispasi.
  9. Tagliare lateralmente la trachea. Rimuovere i polmoni dalla cavità corporea tagliando il tessuto connettivo lungo la parte posteriore della gabbia toracica mentre si utilizza una pinza per tirare i polmoni e la trachea verso l'alto.
  10. Rimuovi il cuore dai polmoni. Mettere i polmoni in 5 ml di DPBS su ghiaccio.
  11. A questo punto, prendere il BALF separato e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Il surnatante può essere aliquotato e conservato secondo necessità. Dovrebbe esserci un pellet cellulare visibile che può essere risospeso in 100 μL di RPMI.
    NOTA: Si può attendere fino a 2 ore per procedere con la digestione, il che consente di raccogliere più topi alla volta.

3. Digerire i polmoni

  1. Preparare la miscela di digest. Aggiungere 83 μg/mL di liberasi (50 μL di soluzione madre) e 100 μg/mL di DNAsi (15 μL di soluzione madre) in 3 mL di RPMI per polmone.
  2. Sezionare i cinque lobi dei polmoni e scartare il tessuto connettivo19,20. Tagliare il polmone con le forbici per 1 minuto su un vetrino.
  3. Trasferire il polmone tagliato in una provetta da centrifuga da 50 ml utilizzando le forbici da dissezione. Aggiungere il pellet di cella recuperato dal BALF e risospeso in RPMI nella provetta da centrifuga. Aggiungere 3 mL di miscela digestiva alla provetta contenente il campione utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
  4. Miscela di digestato polmonare pipettato su e giù 2-3 volte. Porre a 37 °C in un agitatore orbitale a 140 giri/min con tubi di digestione posizionati con un angolo di 45 gradi per 40 minuti.

4. Preparazione della sospensione a cella singola

  1. Rimuovere le provette da centrifuga da 50 mL dall'agitatore orbitale e metterle sul ghiaccio. Pipettare la miscela di digestato polmonare su e giù 5-6 volte. Filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 mL. Lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro e neutralizzare gli enzimi con 10 mL di FBS al 5% in RPMI.
  2. Centrifugare per 5 min 4 °C a 600 x g. Aspirare il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto o una pipetta. Risospendere in 1 mL di tampone di lisi ACK e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi (RBC). Aggiungere 9 mL di PBS e pipettare su e giù.
  3. Centrifugare per 5 minuti a 4 °C a 600 x g. Aspirare il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto o una pipetta. Risospendere in 1 mL di tampone FACS (1% FBS in PBS) e filtrare attraverso una rete da 64 μm in una provetta per microcentrifuga utilizzando una pipetta p1000.

5. Citometria a flusso e analisi a valle

  1. Se si esegue la citometria a flusso o la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza in una piastra a 96 pozzetti, colorare circa 1-2 milioni di cellule per pozzetto o una frazione dell'8% della sospensione polmonare.
  2. Gira le celle verso il basso. Tutte le centrifughe in una piastra a 96 pozzetti devono essere eseguite per 2,5 minuti (4 °C) a 600 x g. Staccare il surnatante e lavare le celle una volta risospendendo in 200 μl di DPBS. Gira verso il basso e scorri.
  3. Se le cellule devono essere colorate per l'analisi di citometria a flusso, procedere con la seguente procedura di colorazione.
    1. Risospendere le cellule nella colorazione Zombie vivo/morto (1:150) e nel blocco Fc (1:250) in 25 μL di DPBS per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
    2. Preparare la miscela colorante con anticorpi a una concentrazione 2x nel tampone FACS.
      NOTA: Una miscela colorante deve includere tutti i marcatori nel pannello mieloide (Tabella 1) o nel pannello epiteliale (Tabella 2) alle concentrazioni indicate.
    3. Aggiungere 25 μl di miscela colorante a 25 μl di sospensione polmonare in una piastra e incubare su ghiaccio per 30 minuti al buio. Il volume totale di colorazione dovrebbe ora essere di 50 μl e gli anticorpi primari dovrebbero essere alla loro concentrazione finale di colorazione 1x.
    4. Aggiungere 150 μl di tampone FACS, centrifugare per 2,5 minuti a 4 °C a 600 x g e rimuovere il surnatante. Lavare due volte in 200 μl di tampone FACS.
    5. Se è necessaria la colorazione intracellulare, fissare le cellule con un kit di fissazione intracellulare. Se non è richiesta la colorazione intracellulare, le cellule possono essere fissate per 20 minuti in PFA al 4% in DPBS.
    6. Lavare il fissativo con 200 μL di tampone FACS tre volte. I campioni possono essere conservati risospesi in 200 μL di tampone FACS a 4 °C al buio per 2-3 giorni. Prima di eseguire i campioni, è possibile aggiungere microsfere di conteggio per quantificare il numero di cellule.
  4. Se le cellule devono essere ordinate, procedere con la seguente procedura di colorazione.
    1. Risospendere le cellule in una miscela di anticorpi colorante 1x con blocco Fc (1:250). Incubare per 30 minuti su ghiaccio al buio.
    2. Aggiungere 150 μl di tampone FACS, centrifugare per 2,5 minuti a 4 °C a 600 x g e rimuovere il surnatante. Lavare tre volte con 200 μl di tampone FACS e risospendere in 200 μl di tampone FACS prima di ordinare.
      NOTA: Si consiglia di aggiungere un colorante vitale, come il DAPI, alle cellule prima della cernita.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un digest di successo si tradurrà in circa 20-25 milioni di cellule con una vitalità del 90%-95%. Se circa 25.000 microsfere di conteggio vengono aggiunte a una frazione dell'8% del polmone, le microsfere dovrebbero compromettere l'1%-3% degli eventi raccolti. Dopo il gating su singoletti, circa il 90%-95% delle cellule dovrebbe essere Zombie Aqua negativo (indicando vitalità) (Figura 2A, Figura 3A).

Delle cellule CD45+, le...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo delinea un digestato polmonare di topo che isola circa 20-25 milioni di cellule per topo con una vitalità del 90%-95%. Consente inoltre la raccolta di BALF per ulteriori analisi. La sospensione cellulare risultante è compatibile con diverse tecniche di laboratorio, tra cui la citometria a flusso e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per isolare le cellule per il sequenziamento o la coltura cellulare. In breve, dopo la perfusione, viene raccolto il BALF e ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Institutes of Health (R35GM150816 e P30DK043351), della Charles H. Hood Foundation e dell'Harvard Stem Cell Institute. Ringraziamo Alexander Mann e tutti gli altri membri del laboratorio Franklin per il loro aiuto e la loro consulenza nella progettazione e nel perfezionamento degli schemi e delle analisi di citometria a flusso. Ringraziamo anche il Nucleo di Citometria a Flusso di Immunologia della Harvard Medical School. L'analisi della citometria a flusso è stata eseguita utilizzando FlowJo. Gli schemi delle figure sono stati creati utilizzando BioRender.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mL con punta a slittamentoVWRBD309659
provetta per microcentrifuga da 1,7 mLDOT ScientificRN1700-GMT
Pipette da 10 mL (monouso)Fisher Scientific12-567-603
Siringa da 10 ml con punta BD Luer-LokVWR75846-756
123 conteggi eBeads Conta perleThermo Scientific01-1234-42
pipetta a 12 canali (30-300ul)USA Scientific 7112-3300
16% paraformaldeideVWR100503-917
Ago da 23 G con smusso regolareVWR305194
Ago da 27 G con smusso regolareVWRBD305109
pipette da 5 mL (monouso)Thermo Fisher Scientific170373
provette da centrifuga da 50 mLOlympus 28-108
Piastra inferiore rotonda a 96 pozzettiCorning3797
ACK tampone di lisiGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-topo CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Anticorpo monoclonale di ratto (PE (Ficoeritrin)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-topo CD64 (Fcγ RI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-topo CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Cateteri IV schermati VWR381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-topo/umano CD11bBioLegend101235
Brilliant Viola 605 anti-topo Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-topo CD45BioLegend103147
C57BL/6J topi Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Anticorpo monoclonale (APA5), PE-Cianina7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Anticorpo monoclonale (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Filtri cellulariCorning352350
CentrifugaEppenodorfCentrifuga 5910R
Desossiribonucleasi I da pancreas bovino (DNasi)Millipore SigmaDN25-100MGRicostituito a 20 mg/mL in DPBS come soluzione madre conservata a -20 ° C
DispaseVWR76176-668Scongelato una volta e conservato in aliquote da 1 ml a -20 gradi; C
Pinza per dissezione (Dumont #7)Fine Science Tools11297-00
Forbici per dissezioneFine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
Kit di fissaggio eBioscienceLife Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
EtanoloVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Scongelato una volta e inattivato a caldo prima dello stoccaggio a lungo termine come aliquote a -20 ° C
FITC anti-topo CD31 AnticorpoBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
VetriniFisher Scientific12-552-3
serbatoio graduatoUSA Scientific 1930-2235
Secchiello del ghiaccioCorning432128
Iniezione di ketamina idrocoloride (100 mg/mL)DechraLa miscela di eutanasia e xialazina può essere conservata a 30 mg/mL di ketamina cloridrato e 4,5 mg/mL di xilazina in DPBS sterile per un massimo di un mese.
LiberaseMillipore Sigma5401119001ricostituito a 5 mg/mL in DPBS come soluzione madre conservata a -20 gradi; C
Coperchi per piastre a 96 pozzettiFisher Scientific07-201-731
Agitatore per incubatore orbitaleBarnstead Lab-LineSHKE4000
pipetta p1000Eppenodorf3123000063
puntali p1000USA Scientific 1122-1830
pipetta p200Eppenodorf3123000055
puntali p200USA Scientific 1110-1700
PE anti-topo CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cianina5.5 anti-topo CD104 AnticorpoBioLegend123614
PerCP/Cianina5.5 anti-topo Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
Anti-topo purificato CD16/32 BioLegend101302Indicato come "blocco Fc" nel testo
Flacone sprayVWR23609-182
Sutura (Misura 2-0)VWR100190-026
SottocuscinettiVWR56617-014
Xysed (xilazina 100mg/mL)PivetalVedi le note sulla ketamina idrocoloride sopra.
Kit di viabilità riparabile Zombie AquaBioLegend423102

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745(2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964(2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773(2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920(1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761(2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544(2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988(2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632(2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652(2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cellule polmonari di topoIsolamento di cellule mieloidiIsolamento di cellule epitelialiSospensione cellulare singolaCitometria a flussoSmistamento cellulareLavaggio broncoalveolareDigestione polmonareIsolamento di cellule immunitarieGating delle popolazioni cellulari

Articoli correlati