Articolo metodologico

Inoculazione intradermica di Mycobacterium avium nell'orecchio del topo

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DOI:

10.3791/67675

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3 luglio 2025

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1Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children's Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of Washington School of Medicine, 3Department of Global Health, University of Washington

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'esecuzione di un'inoculazione intradermica a basse dosi di Mycobacterium avium in un orecchio di topo per riflettere le condizioni di esposizione.

Abstract

A differenza dell'esposizione naturale a micobatteri non tubercolari (NTM) o delle infezioni la cui patologia è fondata su un organismo a replicazione lenta, l'infezione da aerosol in un modello murino può causare un'elevata proliferazione di crescita batterica nei polmoni. L'aerosol cronico e le infezioni sistemiche possono essere trattate con farmaci anti-micobatterici, che potrebbero anche riflettere un'esposizione precedente, ma queste procedure sono lunghe e meno rappresentative delle esposizioni naturali. L'obiettivo di questo protocollo è quello di sviluppare un modello murino meno invasivo di condizioni simili all'esposizione a NTM che siano più traslazionali. Qui, descriviamo un metodo per sfidare intradermicamente i topi preclinici attraverso il tessuto dell'orecchio utilizzando Mycobacterium avium (M. avium) per imitare un'esposizione e consentire risposte immunitarie ai batteri senza malattia evidente. In questo articolo, descriviamo il metodo di iniezione intradermica dell'orecchio e confermiamo la presenza di un'infezione micobatterica sostenuta e contenuta, che fornisce ulteriori opportunità per interrogare le risposte immunitarie in questo modello in vivo .

Introduzione

I micobatteri non tubercolari (NTM) sono un elenco in espansione di specie che includono un sottoinsieme di batteri patogeni che sono spesso difficili da trattare 1,2. L'NTM può essere trovato in fonti ambientali come il suolo, l'acqua e gli aerosol d'acqua 3,4,5. Nonostante le tendenze riportate suggeriscano un aumento delle infezioni da NTM, come gruppo, vengono regolarmente segnalate in meno di 20 stati degli Stati Uniti.6,7. Gli individui con comorbilità specifiche, comprese le persone con fibrosi cistica o gli individui che assumono farmaci immunosoppressori, sono a maggior rischio di infezione produttiva da specie patogeneNTM 2. Si presume che gli individui sani, tuttavia, abbiano esposizioni ripetute e continue a NTM attraverso fonti ambientali senza portare a infezioni robuste o croniche. Ci sono alcune prove che l'esposizione a NTM può "precondizionare" la risposta immunitaria complessiva agli antigeni micobatterici nelle vaccinazioni8, gli esiti dopo l'esposizione ad altri micobatteri e i test diagnostici9, ma fino ad oggi la modellazione preclinica di questo tipo di esposizione è stata difficile.

Le infezioni polmonari croniche10 e i trattamenti che vengono sfruttati per studi sull'efficacia dei vaccini specifici per agenti patogeni non rappresentano esposizioni ambientali relativamente innocue e le risposte immunitarie presumibilmente diverse che ne derivano. Le infezioni croniche, ad esempio, possono indurre tessuti gravemente danneggiati e malattia disseminata10. C'è stato uno slancio recente per colmare questa lacuna nella ricerca, incluso un modello murino che fornisce l'esposizione a NTM attraverso l'acqua potabile, dal laboratorio Henao-Tamayo11, dove la risposta immunitaria a questa esposizione è stata ulteriormente interrogata a lungo. La tubercolosi latente (TB) è un altro stato patologico dell'infezione micobatterica che è stato difficile da modellare negli animali preclinici. Il laboratorio Kaufmann ha sperimentato le infezioni intradermiche dell'orecchio con M. tuberculosis nei topi C57BL/612 e NOS2-/-13 per imitare l'infezione latente da TBC, la riattivazione e per caratterizzare i meccanismi dei granulomi ipossici. Nemeth et al. hanno sfruttato il modello dell'orecchio intradermico contenuto per imitare la precedente esposizione a M. tuberculosis, caratterizzando risposte immunitarie distinte, al fine di determinare in che modo ciò ha influenzato i successivi esiti di sfida14. Il modello dell'orecchio intradermico è stato riportato con successo utilizzando 104 unità formanti colonie (CFU) dei ceppi H37Rv ed Erdman di M. tuberculosis , ma ad oggi non è stato testato utilizzando isolati NTM.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di stabilire un modello di provocazione dell'orecchio NTM riproducibile che limiti la malattia causata da altre vie di provocazione, che può essere ulteriormente studiato per quanto riguarda la risposta immunitaria all'esposizione. L'esposizione di topi C57BL/6 sensibili ad alte dosi di M. avium nell'acqua potabile provoca un maggior numero di condizioni simili all'infezione rispetto alle esposizioni11. Pertanto, il razionale per lo sviluppo di questa tecnica include il successo precedente nell'utilizzo di M. tuberculosis come organismo di sfida per il derma dell'orecchio con una dose di sfida relativamente più alta 12,13,14. Qui, abbiamo cercato di valutare se il modello può essere adattato con successo per un isolato di M. avium a metà della concentrazione batterica precedentemente riportata 12,13,14 (102 CFU). Ci aspettiamo che l'avanzamento di nuovi modelli di esposizione alle NTM, e non di infezione, aiuterà ad affrontare le questioni biologiche in sospeso su questa influenza sulla salute e sulle future dinamiche di infezione/vaccinazione.

Protocollo

Le femmine di C57BL/6 sono state acquistate da un laboratorio di ricerca a 6-7 settimane di età. I topi sono stati ospitati presso la struttura per animali di livello 2 di biosicurezza 2 (BSL-2) del Seattle Children's Research Institute (SCRI) in condizioni prive di agenti patogeni e sono stati maneggiati in conformità con protocolli sperimentali approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) SCRI. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative pertinenti in materia di benessere degli animali. L'istituto opera con il certificato USDA #91-R-0061 e PHS Assurance #A4337-01. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione delle scorte batteriche per l'inoculazione

  1. In una cappa di biosicurezza adatta al lavoro batterico, rimuovere una fiala madre di Mycobacterium avium (ATCC 25291) da una conservazione a -80 °C e scongelare a temperatura ambiente.
    NOTA: Le concentrazioni stock di M. avium sono determinate in anticipo, come best practice con tutti i materiali stock, mediante diluizioni seriali su piastre di agar 7H10 e contando le unità formanti colonie (CFU).
  2. Utilizzando un ago da 26 G con punta smussata, risospendere il campione madre facendo passare il liquido su e giù per la siringa da 1,0 ml 10 volte o più per creare una sospensione uniforme.
  3. Controllare la concentrazione di M. avium placcando 100 μL di diluizioni seriali 1:10 della sospensione su piastre di agar 7H10. Incubare le piastre per 3 settimane a 37 °C e contare le colonie per assicurarsi che le concentrazioni dell'inoculo siano accurate.
  4. Regolare la concentrazione di M. avium alla dose preferita diluendo il campione con PBS sterile. Conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
    NOTA: In questo esperimento sono stati utilizzati 102 CFU per dose di 10 μl.

2. Preparazione e anestesia degli animali

  1. Prima di somministrare l'anestesia, preparare una superficie calda, come un termoforo, su cui possono essere tenute le gabbie dei topi inoculati nel tentativo di regolare la loro temperatura corporea durante il recupero.
  2. Iniettare il cocktail di ketamina (100 mg/mL) e xilazina (20 mg/mL) nei topi per via intraperitoneale.
  3. Una volta anestetizzato, eseguire un pizzico di dita dei piedi per confermare che i topi siano sufficientemente anestetizzati per le manipolazioni della procedura.
  4. Applicare il lubrificante per gli occhi bilateralmente.

3. Piattaforma di inoculazione e preparazione dei materiali

  1. Usa una tavola di gommapiuma per creare una sporgenza su cui il mouse può stabilizzarsi mentre viene manipolato.
    NOTA: Il nastro biadesivo aiuterà a tenere l'orecchio sulla piattaforma in un orientamento piatto. L'adesivo non deve essere troppo forte per preservare la salute del tessuto dell'orecchio.
  2. Disponete una lente d'ingrandimento illuminata per vedere la piattaforma.
  3. Raccogli una siringa di Hamilton sterile e un preparato funzionante di M. avium nelle vicinanze.

4. Inoculazione del derma dell'orecchio

  1. Posizionare il mouse in posizione supina in cima alla sporgenza in modo tale che l'orecchio possa essere posizionato su nastro biadesivo.
  2. Esercitare una leggera pressione per appiattire l'orecchio sul nastro e assicurarsi che l'orecchio non si muova.
    NOTA: Le salviettine imbevute di alcol possono essere utilizzate sulle orecchie prima dell'iniezione per aiutare a limitare la contaminazione incrociata e l'infezione con i commensali cutanei dopo l'infezione. Tuttavia, tali infezioni non sono state osservate in studi pilota senza l'uso di salviettine imbevute di alcol.
  3. Aspirare 10 μl di preparato di M. avium contenente 100 CFU nella siringa sterile di Hamilton.
    NOTA: Agitare la sospensione di M. avium prima di prelevare un volume di 10 μl per assicurarsi che sia omogeneo.
  4. Tenere la piattaforma in una mano e la siringa Hamilton nell'altra, assicurandosi che il lato smussato dell'ago sia rivolto verso l'alto (Figura 1).
  5. Posizionare la siringa di Hamilton sotto il derma dell'orecchio esercitando una pressione molto leggera. Assicurati che l'ago non passi completamente attraverso il tessuto sottile dell'orecchio.
  6. Una volta posizionato l'ago, premere lo stantuffo della siringa a un ritmo graduale e lento.
  7. Osservare il colore dell'orecchio durante la somministrazione.
    NOTA: La somministrazione riuscita apparirà come un'elevazione opaca nel sito di iniezione, come una bolla.
  8. Una volta che il dosaggio è completamente somministrato, controllare l'orecchio del topo e il nastro adesivo per eventuali segni di perdite.
    NOTA: Se si verifica una perdita, è possibile somministrare una dose persa stimata all'orecchio opposto. Come minimo, l'animale deve essere contrassegnato e registrato come se avesse ricevuto una dose inferiore all'obiettivo.
  9. Quando il dosaggio ha successo, assicurarsi che il topo venga riposto nella gabbia di casa per essere esposto alla superficie calda mentre viene monitorato fino a quando non si è svegliato con successo dall'anestesia.

5. Valutazione della carica batterica

  1. Sopprimere gli animali secondo i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali.
    1. Qui, l'eutanasia si completa con un minimo di due metodi per sacrificio. Per questa procedura, le due metodiche scelte sono l'uso dell'asfissia da CO2 e della lussazione cervicale.
    2. Innanzitutto, estendere un tubo per erogare il gas CO2 nella gabbia domestica dei topi e somministrare il gas fino a quando non ci sono più segni di movimento da parte dei topi. Fare attenzione a utilizzare una gabbia che non permetta al gas di fuoriuscire.
    3. Successivamente, lussare le vertebre cervicali attraverso la manipolazione manuale.
  2. Sezionare le orecchie da animali sfidati da M. avium quattro settimane dopo l'esposizione (28 giorni, in base agli studi precedenti12). Sezionare le orecchie di 2 topi utilizzando strumenti sterili. Inserire le orecchie in provette coniche contenenti tampone CFU (PBS + 0,05% Tween80) e utilizzare un omogeneizzatore tissutale per omogeneizzare fino a formare una sospensione uniforme. Anche le orecchie incontrastate vengono lavorate e servite come controlli.
    NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi punto temporale post-esposizione e organi di interesse. Per questo esperimento, sono stati raccolti anche il polmone, la milza, il linfonodo drenante e gli organi cerebrali.
  3. Aggiungere 100 μl di omogenato a 700 μl di tampone CFU in un blocco di pozzetti profondi con una diluizione di 1/8 di volta. Ripetere l'operazione su tutto il blocco in modo da generare un minimo di 5 diluizioni seriali. Aggiungere 50-100 μL di omogeneizzato pulito o diluizioni seriali (diluizioni da 0 a 5 utilizzate qui) alle tripiastre di agar 7H10, distribuire uniformemente con divaricatori a T e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 2-3 settimane.
  4. Contare le unità formanti colonie (CFU) e trasformarle in log10 a scopo di analisi in un software per fogli di calcolo.

Risultati

Abbiamo utilizzato il protocollo descritto sopra per determinare se fosse possibile stabilire un modello di provocazione NTM riproducibile utilizzando il derma dell'orecchio come via di infezione o esposizione. Le orecchie sono state raccolte da due animali a 28 giorni dopo la sfida, omogeneizzate e piastrate come descritto sul terreno 7H10 selettivo per i micobatteri. Abbiamo osservato che M. avium persisteva fino a 28 giorni nelle orecchie che erano state sfidate per via intradermica e un'assenza di M. avium nell'orecchio non contestato (Figura 2).

Sebbene non sia stata osservata la disseminazione nell'orecchio non contestato entro 28 giorni dall'infezione, altri che utilizzano questo modello di derma dell'orecchio per la modellazione della TB latente hanno osservato la disseminazione in altri siti di organi distali14. Abbiamo ipotizzato che una dose più bassa di provocazione e l'uso dell'isolato di M. avium possano ridurre la diffusione a punti temporali successivi che potrebbero riflettere meglio l'esposizione rispetto all'infezione cronica. Pertanto, l'eutanasia è stata eseguita su coorti di topi n=5 M . avium challenged a 28, 56, 90 e 132 giorni dopo l'infezione. I seguenti organi sono stati omogeneizzati con lo stesso protocollo descritto per i tessuti dell'orecchio: polmone, milza, linfonodo drenante (DLN) e cervello. Questa via di provocazione ha portato a una disseminazione sporadica nel tempo, in cui meno della metà degli animali ha dimostrato CFU contabili negli organi testati entro 56 o 90 giorni dopo l'infezione (Tabella 1). Entro 132 giorni dalla sfida, tutti i topi avevano M. avium rilevabile nella milza (n = 5/5 animali valutati) ma sembravano ospitare batteri minimi (n = 1/5 in DLN) o assenti (n = 0/5 nei polmoni o nel cervello) in altri organi entro questo punto temporale (Tabella 1).

figure-results-1
Figura 1: Orientamento di un ago con il lato smussato rivolto verso l'alto. Prima dell'inserimento dell'ago, il lato smussato deve essere rivolto verso l'alto per somministrare correttamente l'inoculo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Colonizzazione del tessuto dell'orecchio da parte di M. avium 28 giorni dopo la provocazione. I topi femmina C57BL/6 sono stati sfidati nell'orecchio con 102 CFU di Mycobacterium avium. L'orecchio sfidato (+) è stato confrontato con l'orecchio non sfidato (-) a 28 giorni, n = 2 singoli animali da un singolo esperimento mostrato, con ogni animale in un colore e simbolo diverso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tempo (giorno)Log Organo10 CFU
PolmoneMilzaDLNCervello
283.08, ND, ND, ND, ND2.81, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0,78, 0,90, ND, ND, ND
562.30, ND, ND, ND, ND1,53, 3,43, ND, ND, ND2.78, ND, ND, ND, ND1,20, ND, ND, ND, ND
90ND, ND, ND, ND, ND0,60, 3,35, 3,26, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0,60, ND, ND, ND, ND
132ND, ND, ND, ND, ND4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.692.41, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND
DLN = linfonodo drenante, ND = non rilevato

Tabella 1: Disseminazione di M. avium dall'orecchio nel tempo dopo la provocazione. I polmoni, la milza, il linfonodo drenante (DLN) e il cervello sono stati prelevati da n=5 topi per punto temporale dopo la provocazione. I tessuti omogeneizzati sono stati piastrati e valutati per la crescita batterica. Le CFU degli organi si presentavano come valori trasformati log10 in cui i batteri sono stati contati e non rilevati (ND) dove non sono state osservate CFU a nessuna concentrazione placcata. Dati sull'andamento temporale rappresentativi di un esperimento.

Discussione

Qui abbiamo dimostrato come sfidare in modo riproducibile i topi con micobatteri in un modello di orecchio intradermico contenuto. È fondamentale, quando si esegue questa procedura, seguire le precauzioni di sterilità ed evitare lesioni da puntura d'ago. Con questo metodo di inoculazione, è fondamentale disporre di una stazione di installazione adeguata e di una buona illuminazione per garantire che lo spazio del derma sia mirato e non perforato completamente attraverso l'orecchio. Se ciò dovesse accadere, a seconda dello studio, è possibile effettuare un secondo tentativo nell'altro orecchio. Le orecchie non trattate all'interno dello stesso mouse possono essere utilizzate anche come controllo per mouse. Questo metodo dovrebbe essere accessibile ai ricercatori che hanno bisogno di attrezzature o tempo minimi. Dedicare i topi e il tempo per l'addestramento aiuta con il tasso di successo dell'inoculazione del protocollo. Gli errori più comuni in questa tecnica sono non entrare nello spazio intradermico con la siringa (e perforare l'orecchio) o premere la siringa troppo rapidamente, causando un'erogazione incoerente o lo slittamento dell'ago dallo spazio intradermico. Una buona illuminazione e un buon ingrandimento possono aiutare con il corretto posizionamento dell'ago per l'inoculazione.

Stiamo sfruttando la metodologia per le condizioni "exposure-like" di NTM. La stragrande maggioranza di M. avium è contenuta all'interno dell'orecchio o del DLN. Tuttavia, un limite di questa metodologia è che la disseminazione agli organi sistemici, vale a dire la milza, è stata osservata in tutti gli animali valutati entro 132 giorni dopo il challenge. Potrebbe esserci una soglia di inoculazione batterica che potrebbe ridurre la quantità o la frequenza di disseminazione, che potrebbe essere raggiunta con uno studio di titolazione. Questa procedura è suscettibile di modificare sia l'organismo, ad esempio altre specie di NTM, sia la dose erogata, a seconda della domanda di ricerca.

Il comportamento umano (mancanza di un adeguato trattamento dell'acqua potabile, inquinamento, fumo), l'aumento del numero di persone con problemi di salute deteriorati a causa dell'età di15 anni e di altre comorbidità, la mancanza di test diagnostici appropriati e il cambiamento climatico16 possono svolgere un ruolo nell'aumento dei tassi di infezioni da NTM e questa tendenza è destinata ad aumentare nel prossimo futuro. Proponiamo che modelli come la somministrazione della mucosa attraverso l'acqua potabile11 o le infezioni intradermiche dell'orecchio contenute con NTM nei topi forniscano l'opportunità di determinare quale influenza avrà questa crescente esposizione sulla successiva vaccinazione e sull'efficacia del vaccino. Sebbene abbiamo adattato questa metodologia di un modello auricolare confinato per M. avium, proponiamo che possa essere utilizzata con successo per altre specie di NTM come tecnica di esposizione.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori esprimono la loro gratitudine al personale del vivaio per l'eccezionale cura degli animali durante questo studio. Gli autori desiderano anche ringraziare l'Henao-Tamayo Lab della Colorado State University per aver condiviso il ceppo di M. avium utilizzato in questo studio. Gli autori desiderano ringraziare i membri dei laboratori Aderem e Urdahl del Seattle Children's Research Institute per la formazione sulla metodologia originale. Questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, nell'ambito del contratto n. 75N93021C00029 (a RNC) e delle sovvenzioni R01AI125160 e R01AI183642 (a RNC e SLB).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tween80SigmaP6224
Siringa da 1 mlFisher15-823-434
7H10 agar triplatesMoltox21-40S234
26G ago smussatoFisherNC0981254
Armadio di biosicurezzaNuaireNU-543-400
CO2 incubatoreFisher Scientific15-103-0513
Nastro biadesivoScotch3136
Hamilton 701N siringa da microlitroFisher14-824-16
Punte omni per tessuti duriFisher15-340-102
Cuscinetto riscaldanteKent ScientificHTP-1500
Ago per insulinaFisherNC1551333
KetaminaPatterson Veterinary07-890-8598
Lente d'ingrandimento illuminataBrightechB07MMZ27QK
PBS ThermoFisher10010072
Omogeneizzatore di tessutiOmniTH115
Supporto per omogeneizzatore di tessutiOmniS1000
XylazinePatterson Veterinary07-808-1947

Riferimenti

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