Metodologia migliorata per l'erogazione di liquidi al polmone di topo: intubazione con un otoscopio consumer

Sommario

Questo protocollo mostra come il posizionamento ottimale di un topo e l'inserimento transorale di un otoscopio basato su telecamera consentano la visualizzazione della glottide, l'intubazione rapida con un trauma tissutale minimo e l'erogazione costante di liquidi ai polmoni.

Abstract

La somministrazione costante di liquidi, comprese le potenziali terapie, ai polmoni è fondamentale per modellare la malattia polmonare e lo sviluppo terapeutico preclinico. Tuttavia, gli attuali metodi utilizzati nei topi, come l'aspirazione orofaringea con il metodo del tiralingua della lingua, possono portare a una somministrazione variabile. Qui, descriviamo l'uso di un otoscopio illuminato economico, collegato al telefono cellulare, per visualizzare la glottide e consentire l'inoculazione diretta nelle vie aeree. Descriviamo in dettaglio una tecnica di messa in scena ottimizzata con un'illuminazione e ausili di posizionamento adeguati. Viene inoltre descritto come l'intubazione può essere condotta in modo affidabile utilizzando un catetere flessibile da 20 G con o senza luce a fibre ottiche. Questa tecnica riduce notevolmente la varianza nel parto intrapolmonare e aumenta il volume di liquido erogato che raggiunge i polmoni. A causa della ridotta varianza, quando si utilizza questo metodo è possibile utilizzare coorti di dimensioni più piccole invece dell'instillazione orofaringea con il metodo del tiralingua della lingua. Quello che segue è un metodo per l'intubazione efficace, rapida e coerente dei topi e la consegna ai polmoni, inclusa una solida conferma del posizionamento del tubo endotracheale. Grazie a questa metodologia migliorata, l'intubazione coerente e sicura e la somministrazione replicabile ed efficiente ai polmoni sono a portata di mano.

Introduzione

A livello globale, le malattie respiratorie sono la prima causa di morte per i bambini di età inferiore ai 5 anni e sono una delle principali cause di morbilità e mortalità negli adulti^. Nel 2021, l'infezione da SARS-CoV2 è stata la terza causa di morte negli Stati Uniti². I modelli murini sono spesso utilizzati per studiare le malattie polmonari, tra cui l'asma, la polmonite, la broncopneumopatia cronica invadente e la fibrosi polmonare. Quasi tutti questi modelli richiedono l'erogazione di agenti liquidi ai polmoni. Questo può essere fatto mediante canulazione diretta della trachea (tipicamente sotto visualizzazione diretta utilizzando una tecnica chirurgica di taglio), consegna intranasale o aspirazione orofaringea con il consolidato metodo di estrazione della lingua ^3,4,5. Tuttavia, queste tecniche hanno tutte degli svantaggi. La formazione di tessuto cicatriziale dopo la tecnica chirurgica di riduzione lo rende inappropriato per gli studi che richiedono la somministrazione ripetuta di agenti al polmone e le ultime due tecniche possono portare a una consegna polmonare variabile. Inoltre, quando si utilizza il metodo del tiramento della lingua, il trauma tissutale alla lingua può essere pronunciato e l'efficienza di erogazione dipende dal ricercatore che esegue la procedura, vedere la Figura 1.

Figura 1: L'intubazione guidata e l'instillazione IT si traducono in una migliore erogazione al polmone e in una minore variabilità rispetto all'estrazione della lingua. (A) Tre diversi ricercatori hanno erogato 50 μL di inchiostro di china diluito mediante estrazione della lingua, il metodo stabilito per la somministrazione orofaringea (OP). Due ricercatori hanno anche somministrato inchiostro al polmone utilizzando l'intubazione come descritto. (B) I polmoni sono stati rimossi 1-4 ore dopo il parto e fotografati con un ingrandimento 2x. Le fotografie sono state valutate per l'area macchiata, utilizzando ImageJ. (n=6 (intubazione) o 9 (somministrazione di operatoria), risultati di 2 o 3 repliche indipendenti da parte di 2 -3 diversi ricercatori, p<0,0001 Test T di Welch) (C) La variabilità nella somministrazione polmonare è stata anche calcolata come deviazione percentuale dalla media. L'amministrazione dell'OP era molto più variabile. (p = 0,0317, T-Test di Welsh, GraphPad Prism 10.2.3 tutte le statistiche e i grafici) (Sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL/6J, avevano ~10 settimane di età.) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'anatomia murina rende l'intubazione difficile e dispendiosa in termini di tempo. La bocca è piccola e il tessuto buccale può ostruire la vista del ricercatore della rima glottidis⁶. Inoltre, le corde vocali sono molto piccole e può essere difficile vederle poiché si trovano vicino alla base della lingua. Infine, la conferma del corretto posizionamento del tubo endotracheale è difficile poiché il piccolo volume corrente spesso non riesce ad appannare uno specchio⁷. Queste difficoltà hanno incoraggiato una serie di tecniche innovative per intubare i topi. Questi metodi migliorati includono l'uso di un laringoscopio neonatale e di un filo per far avanzare un catetere nella trachea ^8,9, l'uso di una sorgente di luce a fibre ottiche per guidare e irrigidire il catetere^10,11 e l'uso di un feed video in diretta⁶. Più recentemente, l'uso di un otoscopio clinico ha aiutato nell'intubazione orotracheale¹². Altri hanno impiegato la transilluminazione per visualizzare la glottide e intubare i topi ^7,13,14. Tuttavia, ci sono molti aspetti negativi di questi metodi. L'uso di agenti depilatori sul collo del topo e la vicinanza dell'animale a una fonte di luce calda rendono la transilluminazione un approccio tutt'altro che ideale. L'uso dell'ago all'interno del catetere o l'inserimento di strumenti affilati nella bocca significa che alcuni metodi per irrigidire il catetere espongono gli animali a un rischio eccessivo. Infine, fare un'incisione sulla trachea per confermare il posizionamento presenta svantaggi significativi, tra cui la necessità di sterilità e l'accumulo di tessuto cicatriziale. A questo punto, l'instillazione intratracheale mediante intubazione si è dimostrata troppo difficile per un'adozione diffusa¹⁵ e i progressi nello sviluppo metodologico sono rimasti isolati e inutilizzati da molti laboratori¹⁵. Ulteriori studi si sono concentrati sulla scelta dell'anestetico durante la somministrazione, scoprendo che la ketamina può avere vantaggi rispetto all'isoflurano⁵. Tuttavia, l'isoflurano, non essendo una sostanza controllata e svanendo rapidamente al termine della procedura, presentava vantaggi interessanti, quindi abbiamo utilizzato questa forma di anestesia ottimizzando altri aspetti di questa metodologia^16,17.

Il metodo che descriviamo supera le sfide di visualizzazione che altri hanno tentato di affrontare, mitiga i rischi per gli animali da esperimento, riduce il tempo necessario per instillare piccoli volumi intratracheali tramite un tubo endotracheale, aumenta il volume di liquido che raggiunge il polmone e offre un metodo migliorato per la conferma del posizionamento del tubo endotracheale. L'utilizzo di un supporto di sospensione, di mani magnetiche che aiutano (clip a coccodrillo su bracci flessibili fissati a una base) e di un'illuminazione più intensa consentono a un singolo ricercatore di eseguire un'efficiente erogazione intratracheale. La visualizzazione è facilitata dall'utilizzo di un otoscopio "a casa" con connettività WIFI. Questo dispositivo è più conveniente degli strumenti di intubazione commerciali. Inoltre, la connettività WIFI consente un feed video simultaneo su un dispositivo portatile (come un telefono cellulare), rendendolo adatto per l'allenamento. L'intubazione può utilizzare una sorgente luminosa a fibre ottiche infilata in un catetere flessibile (PTFE) da 20 g x 1" (ago rimosso) o il catetere senza luce. La profondità è controllata da due metodi: l'aggiunta di un cuneo di sicurezza per l'intubazione (una protezione conica sul catetere) e l'osservazione della profondità nel feed video. Il posizionamento del tubo endotracheale è confermato utilizzando il "metodo a bolle" per visualizzare il volume corrente in modo più chiaro rispetto al tradizionale metodo a nebbia a specchio¹⁸. Questo è meno stressante per l'animale rispetto all'affidamento sull'ostruzione tracheale per modificare l'urgenza respiratoria¹⁰ per confermare il posizionamento. L'uso combinato di un tubo di prolunga accoppiato al catetere per confermare il successo dell'intubazione (di seguito denominato metodo a bolle), semplificato da Watanabe et. ^{7 e} un videootoscopio consumer in un'unica procedura rende l'intubazione un metodo pratico per la somministrazione terapeutica al polmone e un netto miglioramento del metodo di estrazione della lingua (vedi Figura 1). Se si cerca un metodo affidabile, coerente e conveniente per la somministrazione di liquidi non chirurgici nei polmoni di topo, soprattutto senza l'uso di sostanze controllate (come la ketamina) o attrezzature costose, il seguente metodo potrebbe essere l'ideale.

Protocollo

È imperativo che queste procedure siano esaminate e approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC), elencato nel protocollo, e che il personale veterinario sia consultato prima di procedere. L'IACUC presso il nostro istituto ha approvato il protocollo prima di iniziare l'esperimento e ha esaminato il contenuto del video prima dell'invio. Il supporto e la formazione sono stati ricevuti attraverso il Dipartimento di Medicina Comparata di Tulane per garantire il più alto standard di cura a tutti i nostri animali da laboratorio.

1. Impostare

NOTA: Vedere la Figura 2 per la configurazione.

Figura 2: La stazione utilizzata per l'intubazione guidata è preparata come mostrato. Da sinistra: pipette per l'erogazione, tubo a bolle per la conferma del corretto posizionamento del tubo endotracheale, pinze, spatola, speculum nasale pediatrico (discusso ma non necessario per questa procedura), mani di aiuto, luce d'ingrandimento, supporto per mouse con cono nasale, sonda a fibre ottiche, camera di induzione dell'anestesia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Pulire il cuneo di sicurezza fornito con il kit di intubazione con un tampone di preparazione in isopropanolo. Far scorrere il cuneo di sicurezza pulito (verde nel video) sulla cannula flessibile da 20 G e gettare l'ago fornito in modo sicuro.
   NOTA: Il kit per l'intubazione dei roditori (Tabella dei materiali) utilizzato include cunei di sicurezza per l'intubazione. Si tratta di piccoli manicotti conici che si adattano a un catetere flessibile da 20 G x 1 pollice. Impediscono al catetere di danneggiare la carena.
2. Raccogli gli altri strumenti necessari, tra cui un telefono cellulare, un otoscopio commerciale, un supporto per mouse con un cono nasale, una pinza piegata finemente seghettata, il tubo endotracheale preparato (da 1.1) e la luce a fibre ottiche se lo usi. Pulisci tutti questi con tamponi di preparazione all'isopropanolo prima dell'uso.
3. Prendi circa 20 cm di tubo flessibile. Piegalo a forma di U, aggiungi una connessione Luer lock su un'estremità e fissalo con una fascetta. Aggiungere 200-300 μl di acqua filtrata sterile o inchiostro di china alla provetta. D'ora in poi, questo assemblaggio viene definito "tubo a bolle".
4. Crea un anello di sutura legando ~13 cm di sutura di seta intrecciata di misura 0 in un cerchio. Posiziona questo anello nella parte superiore del supporto e assicurati che entrambi i lati della sutura siano fissati e che il supporto sia pulito. Posizionare il supporto del mouse sopra la base metallica della luce di ingrandimento. Posiziona le mani che aiutano intorno al punto in cui sarà la bocca del topo.
   NOTA: Molti fornitori realizzano supporti intercambiabili (vedi Tabella dei materiali) e uno può essere realizzato all'interno del laboratorio a buon mercato ^4,7,14. Per sospendere l'animale è stata utilizzata una sutura di seta intrecciata di misura 0. Tuttavia, l'uso di altri materiali per lo stesso scopo è stato descritto ^4,13.
5. Metti un topo nella camera di induzione dell'anestesia. Utilizzare una portata costante O₂ a 0,8 L/min e isoflurano al 2%. Anestetizzare l'animale a sufficienza (vedi nota) in modo che non si risvegli durante il posizionamento del cono del naso. Non sopprimere in modo significativo la frequenza respiratoria del topo. Respiri regolari aiutano nell'apprezzamento delle corde vocali.
   NOTA: La frequenza respiratoria del mouse dovrebbe essere normale. Questo criterio viene utilizzato per stabilire la profondità appropriata dell'anestesia. Questo può variare da un animale all'altro e può superare i 200 respiri/min. Pertanto, non è pratico o necessario contare le respire o utilizzare un pizzico per le dita dei piedi.
   ATTENZIONE: Questa procedura può essere interrotta quando necessario. Tuttavia, gli animali non devono rimanere nella camera di induzione più a lungo dello stretto necessario.
6. Collegare l'otoscopio a un telefono cellulare e assicurarsi che il feed video sia stabile.
   ATTENZIONE: Per ridurre al minimo l'esposizione all'isoflurano dei ricercatori durante questa procedura, utilizzare un respiratore chimico se si eseguono più intubazioni o si esegue una formazione su questo metodo. In alternativa, eseguire la procedura in una cappa aspirante.

2. Messa in scena degli animali

1. Non appena il primo animale si addormenta, rimuovilo dalla camera di induzione, inseriscilo e posiziona i denti superiori sulla lunghezza della sutura. Applicare una leggera tensione all'animale per mantenere la posizione della sutura mentre si appoggia il mouse sul supporto.
   NOTA: In media, gli animali vengono anestetizzati per un totale di 2 minuti, compresa l'induzione. Ciò riduce notevolmente il rischio per l'animale, elimina la necessità di lubrificazione oftalmica e previene l'accumulo di saliva. Lavora per mantenere gli animali sedati il meno tempo possibile.
2. Regolare l'angolo del manico leggermente all'indietro (posizionando il collo in estensione minore, 5°-15°). Spingi delicatamente il cono del naso sopra le narici. Non spingere con decisione il cono verso il basso, poiché può interferire con la sutura, sospendendo il topo.
3. Afferra saldamente la lingua il più vicino possibile al labbro inferiore, usando una pinza piegata grande e finemente seghettata. Tiralo verso il basso e allontanalo dai denti superiori su un lato dei denti inferiori.
   ATTENZIONE: La trazione prolungata, la tensione eccessiva o lo schiacciamento della lingua possono compromettere la salute degli animali. Si prega di monitorare la lingua per segni di trauma (lividi, sanguinamento, gonfiore o essiccazione) e, se osservato, interrompere la procedura e avvisare il personale veterinario.
4. Se si utilizzano le mani che aiutano, sostenere la pinza in questa posizione. A seconda dell'esperienza e dell'acuità visiva del ricercatore, una lente d'ingrandimento illuminata può aiutare a posizionare l'animale in modo appropriato.
5. Alimentare la luce a fibre ottiche (se utilizzata) attraverso il catetere flessibile con il cuneo di sicurezza per l'intubazione (verde nel video) in posizione.
   NOTA: Non fissare troppo saldamente il cavo in fibra ottica alla sorgente luminosa. Spingere troppo forte rende difficile rimuovere la luce lasciando il tubo endotracheale in posizione.

3. Apprezzamento visivo delle corde vocali e intubazione

1. Con l'otoscopio nella mano non dominante, premerlo leggermente sulla lingua. Quindi, angola la fotocamera e la sua fonte di luce per visualizzare le corde vocali vicino alla base della lingua.
   NOTA: Lievi variazioni nell'anatomia e nel colore dei tessuti possono rendere difficile l'orientamento. Utilizzare il movimento associato alla respirazione per confermare l'identificazione strutturale.
2. Con la luce a fibre ottiche accesa (se utilizzata), inserire la cannula lungo la parte superiore dell'otoscopio, facendo un leggero contatto con la base della lingua o la parte labiale dell'otoscopio come riferimento. Farlo avanzare nella bocca del topo tra la paletta morbida e il bordo dell'otoscopio.
   NOTA: Se la luce a fibre ottiche non viene utilizzata, il "tubo a bolle" descritto nel passaggio 4 può essere collegato al catetere in questa fase. Per questa modifica della procedura è necessaria un'illuminazione brillante e focalizzata nella bocca del topo.
3. Regolare l'angolo di approccio in modo che il catetere sia molto poco profondo. Subito dopo aver inserito il catetere (meno di 1 mm oltre le corde vocali), sollevare la punta del catetere, in modo che sia quasi parallela al piano di lavoro. Ciò impedisce all'epiglottide di forzare il catetere dorsalmente nell'esofago. Soprattutto durante l'allenamento, quando si hanno difficoltà, o all'inizio della propria esperienza, l'uso del feed video è prezioso per posizionare il tubo endotracheale tra le corde vocali.
   NOTA: La produzione di saliva non ostruisce la visione delle corde vocali durante il completamento di questa procedura. Tuttavia, l'uso di un applicatore di cotone a punta di lancia per rimuovere la saliva ostruente è stato descritto, in precedenti pubblicazioni, durante l'intubazione dei ratti¹⁹. Questo metodo può rivelarsi utile se la saliva diventa un problema.
   1. In caso di resistenza, rimuovere immediatamente il catetere e consentire alla respirazione di tornare alla normalità. Se si osserva sanguinamento, consultare il personale veterinario.
      NOTA: Non dovrebbe esserci quasi nessuna resistenza durante l'avanzamento del catetere.

4. Conferma del posizionamento del tubo endotracheale

1. Confermare visivamente che il tubo endotracheale sia nella posizione corretta utilizzando l'otoscopio. Inoltre, assicurarsi del corretto posizionamento del tubo considerando che la trachea fornisce meno resistenza durante il posizionamento rispetto all'esofago. Osservare che nella posizione appropriata, il tubo endotracheale si trova a ~5 mm oltre le corde vocali. Cerca la luce dalla sorgente a fibre ottiche che brilla attraverso la pelle del collo per confermare nuovamente che il posizionamento è corretto.
   NOTA: Il cuneo di sicurezza per l'intubazione deve impedire l'inserimento del tubo endotracheale troppo lontano. Il cuneo di sicurezza previene traumi alla carena; Tuttavia, non è necessario che impedisca l'avanzamento. Dovrebbe essere usato come caratteristica di sicurezza e la profondità ottimale è spesso inferiore a quella consentita dal cuneo.
2. Quindi, tenendo il tubo endotracheale in posizione, rimuovere la luce a fibre ottiche. Garantire il posizionamento appropriato del catetere utilizzando il "metodo a bolle" (descritto di seguito) piuttosto che l'appannamento dello specchio.
3. Recupera il tubo a bolle d'aria preparato al passaggio 1.3. Preparalo prima della procedura e riutilizzalo per tutti gli animali.
   ATTENZIONE: I 200-300 μL di acqua o inchiostro nel tubo a bolle d'aria non devono mai essere aspirati. Per evitare ciò, assicurarsi che il liquido sia lontano dal Luer lock.
4. Con il tubo endotracheale in posizione, fissare il tubo a bolle in posizione utilizzando il Luer lock. Il volume di marea dovrebbe essere immediatamente evidente. In caso contrario, il tubo endotracheale è mal posizionato. Rimuoverlo rapidamente e consentire al topo di tornare alla normale frequenza respiratoria.
   ATTENZIONE: L'errato posizionamento del catetere nell'esofago comprimerà la trachea, impedendo una respirazione sufficiente. L'errata collocazione sarà spesso accompagnata da una respirazione affannosa (compreso il contributo apprezzabile dei muscoli intercostali) e/o da una drastica riduzione della frequenza respiratoria. Inoltre, la canulazione dell'esofago può portare a uno spasmo muscolare rendendo più difficile la successiva intubazione; Per questo motivo consigliamo l'uso di più animali durante l'addestramento.

5. Consegna intratracheale

ATTENZIONE: Proprio come il metodo di estrazione della lingua per il parto orofaringeo, il parto tramite intubazione rischia di annegare l'animale. Nei topi adolescenti e adulti, 50 μl è un volume di liquido generalmente sicuro da erogare ed è sufficiente per diffondersi nei polmoni.

1. Se si utilizza una siringa per la somministrazione: staccare il tubo a bolle e il Luer lock dal catetere, collegare una siringa Luer slip carica e premere lo stantuffo per erogare il volume desiderato (massimo 50 μl).
2. Se si utilizza una pipetta per la somministrazione: Pipettare il volume desiderato (massimo 50 μl) direttamente nel catetere e lasciare che il topo inali la soluzione.
   NOTA: Durante l'allenamento, prendere in considerazione l'utilizzo di un indicatore come inchiostro di china diluito e filtrato o blu di metilene.
3. Per garantire un rilascio diffuso ai polmoni, sciacquare il liquido erogato nei polmoni con un massimo di 500 μL di aria²⁰. Questo può essere fatto utilizzando una siringa Luer lock precaricata da 0,5 ml o un pipettatore P1000 dotato di un puntale filtrante, entrambi si sono dimostrati affidabili. Se lo si desidera, è possibile eseguire più depressioni del pipettatore senza rischiare l'aspirazione negativa del liquido erogato.
   ATTENZIONE: Se si inocula l'animale con questo metodo, prendere in considerazione la riduzione della concentrazione dell'inoculo a causa dell'aumento dell'efficienza di somministrazione rispetto all'aspirazione orofaringea o alla somministrazione intranasale.
   NOTA: L'uso di un volume superiore a quello corrente (~200 μL) può essere necessario quando si lava l'inoculo con aria. Tuttavia, l'uso di 500 μL non comporta il rischio di barotrauma in quanto rappresenta solo circa la metà della capacità vitale²¹. I topi adulti hanno una capacità di riserva inspiratoria di circa ~800 μL, quindi anche se il topo ha inspirato immediatamente prima del lavaggio, il barotrauma non si verifica²¹. Considerare se volumi di lavaggio dell'aria inferiori potrebbero soddisfare le proprie esigenze per la distribuzione dell'inoculo (è stato suggerito 100-200 μl).

6. Valutazione della consegna

NOTA: Questo viene fatto solo se ci si sta allenando o praticando la procedura.

1. Sopprimere l'animale in modo umano secondo il protocollo IACUC approvato. Qui sono stati impiegati l'asfissia da CO₂ come metodo primario di eutanasia e la lussazione cervicale come metodo di conferma dell'eutanasia.
2. Aprire la parete toracica e rimuovere i polmoni. Fallo aprendo il peritoneo, accedendo al diaframma dal lato caudale e perforandolo con un piccolo paio di forbici dove si può vedere il cuore. Ciò causerà la retrazione dei polmoni e darà più spazio per aprire la cavità toracica tagliando le costole.
   NOTA: Se è necessaria la perfusione per ridurre il sangue nei polmoni, eseguire la procedura attraverso il ventricolo destro del cuore in questa fase.
3. Sciacquare brevemente i polmoni con 1 ml di PBS sterile dopo la rimozione. Appoggiali su una superficie bianca (come una spugna chirurgica) per esporre l'area massima mantenendo il posizionamento relativo del lobo.
4. Fotografare i polmoni ex vivo (abbiamo usato un telefono cellulare), aprire le immagini in ImageJ e quantificare le aree macchiate e non colorate tracciando il contorno del fronte del colorante. Quantifica l'area colorata utilizzando un ricercatore indipendente in cieco per evitare distorsioni.
   NOTA: Se si utilizza la luminescenza e l'IVIS, come mostrato nella Figura 3, è necessario eseguire l'imaging dal vivo in vivo al posto del passaggio 6.

Risultati

Come si vede nella Figura 1 e nella Figura 3, l'inoculazione intrapolmonare con il tradizionale metodo di estrazione della lingua (somministrazione orofaringea) ha portato a una distribuzione dell'inchiostro irregolare e incoerente e a una maggiore variabilità tra i ricercatori. Al contrario, l'instillazione IT dopo l'intubazione ha portato a una somministrazione più coerente sia ai polmoni destro che a quello sinistro ed è stata meno variabile (Figure 1C e Figura 3D). Nei polmoni degli animali a cui è stato somministrato l'inchiostro mediante aspirazione orofaringea mediante trazione della lingua, l'inchiostro è sottile e presente solo vicino alle grandi vie aeree degli animali (Figura 1A). Al contrario, quando l'intubazione guidata è stata utilizzata per erogare l'inchiostro, si è diffuso molto di più nel tessuto marcando un'area molto più ampia dei polmoni. Quando la superficie polmonare colorata con l'inchiostro è stata confrontata tra i metodi, il metodo di intubazione si è dimostrato di gran lunga superiore all'estrazione della lingua (Figura 1B). Anche la variabilità della quantità di erogazione di inchiostro era drasticamente inferiore nella condizione di intubazione (Figura 1C). L'aumento dell'area polmonare colorata e la minore variabilità nella quantità di liquido che raggiunge i polmoni suggeriscono fortemente che la somministrazione di IT è superiore all'estrazione della lingua.

Come si vede nel Video 1, gli endoscopi tradizionali (come precedentemente pubblicato) hanno una lunghezza focale troppo lunga, per apprezzare le corde vocali e guidare il posizionamento del tubo endotracheale ^6,19. Al contrario, le immagini video scattate con un otoscopio consumer (Figura S1 e timestamp: 6:34 e 7:05 nel video) avevano una risoluzione molto migliore che portava a una migliore visualizzazione della glottide.

Questo metodo di intubazione include molteplici verifiche del posizionamento del tubo nella trachea. Il volume corrente del topo era immediatamente evidente quando si utilizzava il metodo a bolle (Figura S2 e Timestamp: 8:25) e funge da garanzia finale che qualsiasi fluido erogato entrerà nei polmoni.

Per valutare ulteriormente la varianza dei due metodi di somministrazione, abbiamo valutato l'espressione del transgene nel tessuto polmonare dopo che i topi sono stati inoculati con 1 x 10¹¹ vg di AAV6.2-luciferasi utilizzando i due diversi metodi (instillazione orofaringea con il metodo del pull della lingua o consegna intratracheale dopo intubazione guidata). Sette giorni dopo la somministrazione del vettore, le misurazioni della luminescenza sono state effettuate utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS) (Figura 3A). Quindi, abbiamo calcolato la radianza media in entrambi i polmoni. 10 minuti prima dell'imaging (30 s di esposizione), sono stati iniettati (per via sottocutanea) 200 μL di luciferina (15 mg/mL). Come mostrato nella Figura 3B, gli animali a cui è stato somministrato il vettore mediante instillazione orofaringea avevano un segnale luminescente ampiamente distribuito sia nel torace che nella regione nasale. Al contrario, gli animali a cui è stato somministrato il vettore mediante somministrazione intratracheale utilizzando l'intubazione guidata hanno mostrato una luminescenza concentrata nei polmoni. La radianza media negli animali intubati era sostanzialmente maggiore rispetto alla somministrazione orofaringea, indicando una migliore efficienza della somministrazione del vettore ai polmoni e una minore variabilità della consegna, calcolata utilizzando la differenza dalla media (Figura 3C e Figura 3D).

I risultati positivi del metodo di intubazione sono stati l'instillazione replicabile fino a 50 μL nei polmoni di topo (condotta in Figura 1 e Figura 3), con distribuzione diffusa in tutto il polmone (come evidenziato nella Figura 1) e non in altre aree (come le vie aeree superiori/naso come si vede nella Figura 3).

Qualsiasi danno arrecato all'animale, stress eccessivo, riduzione del volume di liquido che raggiunge i polmoni, cattiva distribuzione dell'inoculo nei polmoni o necessità di addestramento prolungate avrebbero costituito un risultato negativo, ma non si sono verificati.

Video 1: Una visione endoscopica tradizionale dell'orofaringe del topo e delle corde vocali è sfocata e difficile da usare in modo efficace. La lunghezza focale di 3 cm di questo endoscopio rende difficile apprezzare le corde vocali e l'orientamento. Linguetta in basso a sinistra. Clicca qui per scaricare questo video.

Figura 3: L'intubazione produce una maggiore erogazione al polmone con una minore variabilità rispetto all'aspirazione O.P. (A) A topi femmina BALB/c di 6-10 settimane sono stati somministrati 1x10¹¹ vg di AAV6.2-Luciferasi, (Penn Vector Core), quindi valutati con imaging bioluminescente in vivo (IVIS) 7 giorni dopo. 10 minuti prima dell'imaging (30 s di esposizione), sono stati iniettati (per via sottocutanea) 200 μL di luciferina (GoldBio, 15 mg/mL). (Creato con biorender.com) (B) Immagini IVIS rappresentative di topi che ricevono AAV6.2-luciferasi mediante aspirazione OP (estrazione della lingua, a sinistra) o somministrazione di IT (intubazione, a destra). Le regioni di interesse hanno le stesse dimensioni e la radianza media all'interno della regione è mostrata nell'immagine. (C) Quantificazione del segnale della luciferasi nei topi in aspirazione OP (n=7) rispetto all'intubazione (n=5). p<0,0001 dal test t di Welsh non accoppiato con dopo la trasformazione logaritmica dei dati grezzi della luciferasi. (D) Deviazione dalla media come percentuale della radianza media media. (p=0,0381, test T di Welsh) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1: Immagini di esempio dell'otoscopio di consumo utilizzato nel protocollo descritto per l'intubazione guidata (a sinistra) e di un endoscopio di costo e disponibilità simili (a destra). Si notino le chiare differenze di messa a fuoco tra le immagini. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S2: Un'immagine di esempio che mostra il tubo a bolle in uso. Il volume corrente sposta rapidamente la gocciolina nel tubo a bolle di diversi centimetri. La gocciolina si muove molto poco se il tubo si trova nell'esofago. La frequenza respiratoria e il volume corrente potrebbero essere stimati con questo metodo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S3: Un gruppo di illuminazione di base che elimina la necessità di acquistare un costoso kit di illuminazione a fibre ottiche. Un ago da 20 G è stato inserito in un cavo in fibra ottica conico da 50 mL da 0,75 mm, è stato acquistato a buon mercato (e alla rinfusa) e tagliato a misura (~1 m) con una lama di rasoio e fissato con nastro adesivo. Il fissaggio del catetere in posizione non era necessario a causa della perfetta aderenza al cavo in fibra ottica. Fissando il coperchio conico su una torcia del telefono cellulare, si ottiene una trasduzione della luce sufficiente per eseguire l'intubazione in una stanza buia. Questo assemblaggio riduce ulteriormente i costi sostenuti da un laboratorio che incorpora questa tecnica. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'intubazione e l'instillazione intratracheale sono i metodi migliori per la somministrazione di liquidi al polmone, ma le abbondanti sfide presentate dall'anatomia murina hanno impedito un'adozione diffusa nei laboratori di ricerca polmonare¹⁵. Sebbene garantisca un'erogazione efficiente di un inoculo al polmone, un potenziale svantaggio della somministrazione di IT da parte di questa e di altre tecniche di intubazione è il bypass delle vie aeree superiori. La somministrazione intranasale è un metodo collaudato che non bypassa le vie aeree superiori. Sebbene la somministrazione intranasale sia spesso utilizzata nei laboratori di virologia polmonare e possa essere più efficace in alcuni casi²², non riflette la via di esposizione naturale²³ per alcuni agenti aspirati, si traduce in quantità più variabili di inoculo nel polmone²⁴ ed è meno efficace quando si utilizza l'isoflurano come anestetico⁵. Pertanto, è stato svolto un ampio lavoro sugli apparecchi di aerosolizzazione e sul loro confronto con altre tecniche di somministrazione polmonare²⁵, ma questi metodi presentano rischi associati all'aerosol e tendono ad essere costosi. Tutte queste difficoltà hanno portato all'instillazione orofaringea mediante estrazione della lingua²⁶, che è il metodo preferito per la somministrazione di liquido polmonare in molti laboratori. Come abbiamo dimostrato, questo metodo è molto più variabile dell'instillazione intratracheale dopo l'intubazione. Inoltre, il parto con il metodo del tiralingua non può essere valutato durante la somministrazione e possono essere causati traumi indebiti alla lingua del topo a causa della tensione necessaria per prevenire la deglutizione. La lingua viene anche trattenuta nella tecnica di intubazione guidata e instillazione IT. Tuttavia, poiché il feed video mostra la glottide, un ricercatore che utilizza il nostro metodo non ha bisogno di forzare il posizionamento laringeo esercitando una tensione significativa sulla lingua. Questa diminuzione della trazione provoca meno traumi tissutali. Tuttavia, nonostante i notevoli vantaggi presentati dall'intubazione e dall'instillazione informatica, le sfide hanno ostacolato il suo utilizzo in alcuni laboratori. Ad esempio: la compressione della trachea dovuta a un'errata canulazione dell'esofago può ostruire la respirazione e aumentare la mortalità; l'inserimento del tubo endotracheale troppo in profondità può causare danni alla carena o ai bronchi del tronco principale; Infine, l'intubazione murina con i metodi tradizionali richiede molto tempo, il che la rende poco pratica per la maggior parte dei ricercatori che cercano un parto intrapolmonare affidabile. Il nostro metodo affronta le difficoltà associate all'intubazione dei topi, superando anche le barriere anatomiche all'intubazione dei topi.

Sono stati proposti diversi metodi per superare le sfide anatomiche dell'intubazione murina implementando ausili visivi. Ad esempio, è stato proposto l'uso di un endoscopio tradizionale⁶. Tuttavia, la lunga profondità focale dello strumento è poco adatta ad essere utilizzata per l'intubazione murina (Figura S1). Questo è evidente anche nel video 1, dove le corde vocali possono essere viste ma sono sfocate. Gli otoscopi clinici sono stati utilizzati anche per la laringoscopia diretta¹². Tuttavia, il costo degli otoscopi clinici e la mancanza di un feed video li rendono inaccessibili per la maggior parte dei laboratori e inadatti alla formazione. L'uso di un otoscopio di consumo ampiamente disponibile ha notevolmente migliorato la praticità dell'intubazione guidata. La lunghezza focale più corta, il corpo più piccolo e il labbro depressore esteso consentono un feed video più chiaro, una migliore manovrabilità e posizionamento, e il labbro dell'otoscopio può essere utilizzato per applicare pressione alla base della lingua, migliorando l'accesso alla rima glottidis. Oltre a questi ausili visivi, la transilluminazione è stata utilizzata anche per visualizzare con successo la glottide e intubare i topi ^7,13,14. Tuttavia, gli approcci basati sulla transilluminazione possono richiedere agenti depilatori sull'area che si sovrappone al collo del topo, la vicinanza a una fonte di luce calda, l'uso dell'ago all'interno del catetere, l'inserimento di strumenti affilati nella bocca del topo e/o una piccola incisione da praticare sulla trachea per confermare il posizionamento. Il metodo qui descritto evita questi rischi e si basa sugli aspetti migliori di questi metodi pubblicati. Oltre a superare le barriere anatomiche all'intubazione, nel nostro metodo sono state prese in considerazione considerazioni sui costi.

Insieme, l'uso di mani che aiutano, un supporto per il mouse, l'otoscopio e una luce a fibre ottiche rendono l'intubazione più facile da imparare e molto più veloce da eseguire, con una spesa ridotta per i laboratori. Il costo del supporto per intubazione disponibile in commercio può essere evitato utilizzando uno fatto a mano²⁷. Il costo dell'assemblaggio della luce in fibra ottica può essere sostenuto acquistando il cavo in fibra ottica separatamente (a un costo molto più basso, ~ $ 9 contro $ 218-kent scientific- al momento della scrittura). Per completare la sorgente luminosa a fibre ottiche, è possibile utilizzare un coperchio conico da 50 ml con un foro stenopeico e nastro adesivo per raccogliere la luce da una torcia per telefoni cellulari (vedere la Figura S3 e la Tabella dei materiali). Das et. al descrivere un dispositivo simile¹¹. Per alcuni laboratori, il costo ridotto di questa soluzione può rendere il nostro metodo una procedura molto più accessibile. Al di là dei costi, la difficoltà di confermare il posizionamento del tubo endotracheale ha reso scoraggiante l'intubazione dei topi.

In passato, per confermare che il tubo endotracheale fosse posizionato in modo appropriato, i ricercatori si sono affidati all'appannamento dello specchio tenendo uno specchio dentale sopra il tubo endotracheale¹⁸. Tuttavia, il piccolo volume di marea e le variazioni della temperatura ambiente spesso impediscono l'appannamento degli specchi e portano a errori di giudizio. In caso di intubazione murina, ciò comporta un grave rischio di lesioni. Altri hanno fatto ricorso all'induzione di distress respiratorio ostruendo il tubo endotracheale¹⁰. Ciò provoca un forte stress all'animale e fornisce meno informazioni rispetto al "metodo a bolla". Inoltre, l'introduzione di terapie polmonari e aria nello stomaco a causa di una conferma inadeguata del posizionamento del tubo endotracheale può causare angoscia oltre a ostacolare l'efficacia dell'agente somministrato. L'uso del "metodo a bolle" fornisce una conferma visiva più rapida e affidabile del posizionamento del tubo endotracheale ed è un leggero miglioramento rispetto a un metodo simile descritto in precedenza²⁸. Il "metodo delle bolle" consente inoltre a un ricercatore di stimare approssimativamente la frequenza respiratoria e il volume corrente dell'animale.

Il posizionamento degli animali e la visualizzazione delle corde vocali sono fondamentali per questa tecnica. Abbiamo scoperto che gli speculum nasali pediatrici erano troppo grandi e ingombranti per tenere la bocca aperta e le guance lontane durante l'intubazione, ma erano molto utili durante la formazione in quanto consentivano a un ricercatore di dimostrare il posizionamento dell'otoscopio. Guidare un tirocinante a riconoscere l'anatomia pertinente è difficile ed è stato fondamentale migliorare la visibilità nella bocca del topo, il che è stato notevolmente aiutato dall'uso dell'otoscopio commerciale. La stadiazione con una lente d'ingrandimento illuminata e l'aiuto delle mani sono parte integrante dell'assistenza agli operatori inesperti nell'intubazione, anche se potrebbero non essere così critici per gli operatori esperti.

Durante la formazione su questo metodo, potrebbe essere necessaria la risoluzione dei problemi. Se il tubo endotracheale entra ripetutamente nell'esofago, la glottide potrebbe avere spasmi, il palato molle potrebbe essere infiammato e il corretto posizionamento potrebbe essere più difficile. In questa circostanza, lasciare che l'animale si riprenda per diversi minuti prima di tentare nuovamente l'intubazione. Il numero di tentativi ripetuti deve essere specificato nel protocollo IACUC e sempre rispettato. Se hai difficoltà a vedere le corde vocali, la frequenza respiratoria potrebbe essere soppressa a causa di troppa anestesia o il posizionamento del mouse potrebbe essere inappropriato (più comunemente la testa inclinata all'indietro troppo lontano). In questo caso, riposiziona l'animale e lasciagli riprendersi dall'anestesia prima di riprovare. Il tubo a bolle dovrebbe dimostrare chiaramente il volume corrente dell'animale. Se la bolla si muove solo leggermente, i rantoli dovuti alla pressione esercitata sulla trachea da un tubo endotracheale mal posizionato possono causare questo movimento. In questo caso, fare riferimento al timestamp: 8:25 e alla Figura S3 per vedere quanto sia facilmente evidente il volume corrente quando si utilizza il "tubo a bolle" su un tubo endotracheale posizionato correttamente. Se il tubo endotracheale è fuori posto, rimuovilo immediatamente e lascia che l'animale si riprenda prima di ritentare la procedura.

Sebbene l'intubazione e l'instillazione intratracheale siano di gran lunga superiori ad altri metodi, sono state troppo difficili dal punto di vista tecnico per essere ampiamente adottate. I metodi qui descritti rendono l'instillazione intratracheale e l'intubazione murina accessibili e pratiche. Sebbene le future applicazioni di questa tecnica dipendano fortemente da ciò che viene consegnato ai polmoni e dal contesto in cui vengono forniti, un metodo semplice e affidabile apre la strada a molti progressi nella biologia polmonare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Luce a fibre otticheKit di illuminazione a fibre ottiche, mouse	Kent Scientific	ETI-12ETI-MSE-02	Un componente del gruppo in fibra ottica, compatibile con altre luci e il cavo in fibra ottica di ricambio sottostante
Assemblaggio in fibra ottica alternativo	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	un'alternativa, non discussa (ma non vediamo alcun motivo per cui non funzionerebbe)
Assemblaggio in fibra ottica alternativo	Harvard apparatus	72-9075	un'alternativa, non discussa (ma non vediamo alcun motivo per cui non funzionerebbe)
Assemblaggio alternativo in fibra ottica	fatto a mano dal laboratorio	N / A	Istruzioni trovate qui utilizzando un tappo di gomma: DOI 10.3791 / 50318
Assemblaggio alternativo in fibra ottica	Fatto a mano dal laboratorio	N / A (materiali elencati di seguito)	Realizzato con un coperchio conico da 50 ml, nastro adesivo e supporto per intubazione in fibra ottica da 0,75 mm
, Mouse	Kent Scientific	ETI-MSE-01	Supporto regolabile per intubazione, molte versioni autocostruite disponibili, rack per puntali e piattaforme in legno utilizzate, alcune alternative elencate molte alternative adatte disponibili.
Stand per intubazione alternativi	Braintree Scientifuc	RIS 100	un'alternativa, non discussa (ma non vediamo alcun motivo per cui non funzionerebbe)
Stand per intubazione alternativi	Natsume Seisakusho	KN-1014	un'alternativa, non discussa (ma non vediamo alcun motivo per cui non funzionerebbe)
Stand per intubazione alternativi	Vetland	000A3467	un'alternativa, non discussa (ma non vediamo alcun motivo per cui non funzionerebbe)
Supporti per intubazione alternativi	fatti a mano da lab	N/A Realizzato	con un raccoglitore a 3 anelli qui: DOI 10.3791/60844 (diversi metodi alternativi pubblicati)
Sutura di seta intrecciata non assorbibile, misura 0	Fine Science Tools	18020-00	qualsiasi lunghezza superiore a 1 pollice danneggerà la carena
Catetere IV Safelet 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	O simile
RS-5358 Micro Pinze da dissezione	Fisher	RS-5358	O simile, include l'aiuto delle mani
Lente d'ingrandimento con luce e supporto, mano magnetica flessibile EOOKU, 5X e 10X 12V 108pcs LED perline lampada d'ingrandimento, 3 modalità regolabile girevole collo d'oca bracci & Piastra di base per impieghi gravosi	Amazon	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Flessibile-Regolabile-Collo d'Oca /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfy gaSMgW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& parole chiave=ingrandimento+vetro+con +luce+EOOKU+3+in+1& qid=1709661 709& sprefix=ingrandimento+vetro+con+ luce+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5	O simile, qualsiasi pinza piegata finemente seghettata funzionerà
Rimozione del cerume - Strumento di rimozione del cerume con set di orecchie da 8 pezzi - Detergente per le orecchie con fotocamera - Kit di rimozione del cerume con luce - Fotocamera per le orecchie con 6 cucchiai per le orecchie - Detergente per le orecchie per iOS e iOS Android (Nero)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Rimozione-Rimozione-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1AD2066F-97D2-4731 -9356-36B3EDF1AE04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& psc=1	o simile, diverse marche disponibili
AZIMOM PMMA Cavo in fibra ottica con bagliore terminale in plastica 0,75 mm (0,02 pollici) 100 m (328 piedi) / rotolo per soffitto a cielo stellato Tutti i tipi di driver per motori a led Sorgente	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastic-Cuttable-Ceiling-1pcs0-00 98in328ft / dp / B07WC9JV5N / ref = sr _1_9?dib = eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB < br / > hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& parole chiave=fibra%2Boptic%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th=1	O simile, la fibra viene utilizzata per costruire il dispositivo in linea 7
50mL tubo conico	Cell Treat	229421	qualsiasi coperchio conico con tappo a vite in plastica opaca da 50mL dovrebbe funzionare. Non entra in contatto o si avvicina all'animale, quindi non necessita di sterilità
Isoflurano	VetOne	Consultare Veternary Staff
Innoculum	N/A	Specifico per il tuo esperimento
Puntali per pipette (filtro)	N/A	Filtro sterile p100 e p1000 puntali utilizzati	Marca/Fornitore non rilevante
Camera di induzione	N/A	Come disponibile presso il tuo istituto	Marca/Fornitore non rilevante
Isopropanolo Prep Pads	N/A	Per la pulizia degli strumenti	Marca/Fornitore non rilevante
Tubi	N / Un	tubo flessibile di piccolo diametro funzionerà	Per la costruzione di "tubo a bolle"  (il nostro ha un diametro di ~3 mm ed è stato preso da una linea IV)
Luer lock	N/A	per adattarsi al tubo sopra	Per la costruzione del
respiratore a semimaschera 3M	3M	17-986-9B	per limitare l'esposizione ai gas
Twist Tie	N/A	N/A	per mantenere la forma a U del tubo a bolle