Separazione e frazionamento delle proteine filtrate di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis

Anbarasu Deenadayalan; Madhavan Dhanapal; Uma Devi Ranganathan; Ramalingam Bethunaickan

doi:10.3791/67679

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Separazione e frazionamento delle proteine filtrate di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis

880 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67679

⸱

11 luglio 2025

Anbarasu Deenadayalan¹ , Madhavan Dhanapal¹ , Uma Devi Ranganathan¹^,² , Ramalingam Bethunaickan¹^,²

¹Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, ²Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la coltura, la raccolta e la concentrazione delle proteine secrete di Mycobacterium tuberculosis. Le proteine filtrate di coltura (CFP) vengono quantificate, separate in 20 frazioni mediante focalizzazione isoelettrica e ulteriormente risolte in 30 frazioni utilizzando un SDS-PAGE preparativo e un sistema di elettroeluizione.

Abstract

Le proteine secrete del Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) svolgono un ruolo cruciale nella patogenesi della tubercolosi, nella modulazione immunitaria e nella progressione della malattia. Comprendere la loro composizione e funzione è essenziale per identificare nuovi biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi della tubercolosi, nello sviluppo di vaccini e negli interventi terapeutici. Questo studio si concentra sull'isolamento, il frazionamento e la caratterizzazione sistematici delle proteine filtrate di coltura (CFP) per consentire analisi immunologiche e proteomiche complete. Le CFP sono state ottenute da colture H37Rv di M. tuberculosis coltivate in condizioni chimicamente definite per garantire un'espressione proteica controllata. Il surnatante di coltura è stato purificato mediante filtrazione e concentrato utilizzando un sistema a fibre cave per trattenere le proteine superiori a 10 kDa. Il frazionamento è stato ottenuto attraverso la focalizzazione isoelettrica in fase liquida, separando le proteine in base ai loro punti isoelettrici in 20 frazioni distinte. Un'ulteriore risoluzione è stata eseguita utilizzando l'elettroforesi preparativa su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), seguita da elettroeluizione, ottenendo 30 frazioni proteiche. Le proteine frazionate ottenute attraverso questo approccio forniscono una risorsa preziosa per la profilazione immunologica e le analisi proteomiche basate sulla spettrometria di massa. Isolando e caratterizzando sistematicamente le proteine secrete, questo studio contribuisce all'identificazione di biomarcatori proteici specifici per la tubercolosi, che potrebbero migliorare l'accuratezza diagnostica e far progredire la nostra comprensione della patogenesi di M. tuberculosis .

Introduzione

Ricerche approfondite hanno evidenziato il ruolo significativo delle proteine secrete nella crescita e nelle interazioni immunitarie del Mycobacterium tuberculosis¹. Il filtrato di coltura di M. tuberculosis contiene una complessa gamma di componenti proteici e non proteici, che lo rendono una risorsa preziosa per comprenderne la biologia e le proprietà immunogeniche. I primi studi di proteomica hanno identificato quasi 450 proteine nel filtrato^{di coltura 2}, molte delle quali svolgono un ruolo fondamentale nell'suscitare risposte immunitarie contro la tubercolosi. L'ide....