Questo protocollo descrive la coltura, la raccolta e la concentrazione delle proteine secrete di Mycobacterium tuberculosis. Le proteine filtrate di coltura (CFP) vengono quantificate, separate in 20 frazioni mediante focalizzazione isoelettrica e ulteriormente risolte in 30 frazioni utilizzando un SDS-PAGE preparativo e un sistema di elettroeluizione.
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Articolo metodologico
Separazione e frazionamento delle proteine filtrate di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine secrete del Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) svolgono un ruolo cruciale nella patogenesi della tubercolosi, nella modulazione immunitaria e nella progressione della malattia. Comprendere la loro composizione e funzione è essenziale per identificare nuovi biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi della tubercolosi, nello sviluppo di vaccini e negli interventi terapeutici. Questo studio si concentra sull'isolamento, il frazionamento e la caratterizzazione sistematici delle proteine filtrate di coltura (CFP) per consentire analisi immunologiche e proteomiche complete. Le CFP sono state ottenute da colture H37Rv di M. tuberculosis coltivate in condizioni chimicamente definite per garantire un'espressione proteica controllata. Il surnatante di coltura è stato purificato mediante filtrazione e concentrato utilizzando un sistema a fibre cave per trattenere le proteine superiori a 10 kDa. Il frazionamento è stato ottenuto attraverso la focalizzazione isoelettrica in fase liquida, separando le proteine in base ai loro punti isoelettrici in 20 frazioni distinte. Un'ulteriore risoluzione è stata eseguita utilizzando l'elettroforesi preparativa su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), seguita da elettroeluizione, ottenendo 30 frazioni proteiche. Le proteine frazionate ottenute attraverso questo approccio forniscono una risorsa preziosa per la profilazione immunologica e le analisi proteomiche basate sulla spettrometria di massa. Isolando e caratterizzando sistematicamente le proteine secrete, questo studio contribuisce all'identificazione di biomarcatori proteici specifici per la tubercolosi, che potrebbero migliorare l'accuratezza diagnostica e far progredire la nostra comprensione della patogenesi di M. tuberculosis .
Introduzione
Ricerche approfondite hanno evidenziato il ruolo significativo delle proteine secrete nella crescita e nelle interazioni immunitarie del Mycobacterium tuberculosis1. Il filtrato di coltura di M. tuberculosis contiene una complessa gamma di componenti proteici e non proteici, che lo rendono una risorsa preziosa per comprenderne la biologia e le proprietà immunogeniche. I primi studi di proteomica hanno identificato quasi 450 proteine nel filtratodi coltura 2, molte delle quali svolgono un ruolo fondamentale nell'suscitare risposte immunitarie contro la tubercolosi. L'identificazione di questi antigeni immunologicamente rilevanti è essenziale per lo sviluppo di strumenti diagnostici e vaccini innovativi per la tubercolosi. Tuttavia, i progressi in questo settore sono messi in discussione dalla complessità della risposta immunitaria all'infezione da M. tuberculosis e dai limiti tecnici dei metodi di purificazione biochimica utilizzati per isolare le proteine micobatteriche.
Varie tecniche di separazione sono state impiegate per risolvere le proteine di M. tuberculosis, facilitando la rilevazione di proteine minori ma funzionalmente significative e ampliando l'ambito degli studi proteomici. Un metodo di separazione ideale risolve efficacemente miscele proteiche complesse in un numero limitato di frazioni distinte. Due approcci ampiamente utilizzati per separare le proteine micobatteriche sono i metodi basati sulla cromatografia e quelli basati sull'elettroforesi 1,2.
Le tecniche cromatografiche, tra cui l'affinità, lo scambio ionico e la cromatografia in fase inversa, sono state la pietra angolare del frazionamento delle proteine per oltre un decennio. Questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per separare le proteine di M. tuberculosis 3. Tuttavia, sono limitati da fattori come la bassa resa proteica e l'interferenza di componenti non proteici, che possono complicare le successive analisi immunologiche. Questi inconvenienti limitano l'utilità della cromatografia per l'identificazione di antigeni immunologicamente rilevanti.
Per affrontare queste limitazioni, è stato adottato un metodo di separazione bidimensionale basato sull'elettroforesi. Nella prima dimensione, le proteine vengono separate in base alla loro focalizzazione isoelettrica (IEF) utilizzando un sistema preparativo IEF, che segrega le proteine in base ai loro punti isoelettrici. Nella seconda dimensione, le proteine vengono ulteriormente risolte dal peso molecolare utilizzando SDS-PAGE preparativo, seguito da eluizione con uno strumento eluter a gel intero.
Questo approccio bidimensionale offre diversi vantaggi. Riduce significativamente la complessità delle proteine filtrate di coltura (CFP) frazionandole in 600 frazioni distinte. Inoltre, le frazioni sono adatte per l'analisi immunologica diretta perché il processo di eluizione non introduce componenti che interferiscono con i saggi immunologici cellulari 4,5,6.
Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione e la separazione delle proteine filtrate di coltura per l'analisi immunologica6.
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Protocollo
I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Crescita di Mycobacterium tuberculosis e preparazione di proteine filtrate di coltura (CFP)
- Preparazione del mezzo liquido di Sauton
- Combinare i seguenti componenti in 950 ml di acqua distillata: glicerolo, 30,0 ml; Diidrogeno ortofosfato di potassio (KH2PO4), 0,5 g; Solfato di magnesio, 0,5 g; Acido citrico, 2,0 g; Idrolizzato di caseina, 0,5 g; Solfato ferrico di ammonio, 0,05 g; Glutammato di sodio, 4,0 g.
- Regolare il pH a 7,2 utilizzando idrossido di potassio al 40% (circa 5 ml/L).
- Portare il volume a 1 L e sterilizzare in autoclave a 15 psi per 20 min.
- Preparazione della sospensione micobatterica
- Trasferire le colonie di Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) coltivate sui pendii di Lowenstein-Jensen (LJ) in 2 mL di terreno liquido di Sauton.
- Rompere i grumi di micobatteri agitando vigorosamente con perle di vetro in condizioni sterili.
- Avvio della crescita micobatterica
- Trasferire la sospensione batterica in un flacone McCartney contenente 10 ml di terreno liquido Sauton.
- Incubare il flacone a 37 °C per 2 settimane.
- Espansione della cultura
- Trasferire la coltura coltivata in 200 ml di terreno di coltura Sauton in un flacone da 1 L.
- Incubare su agitatore a 37 °C per 4 settimane.
- Trasferire la coltura in fase logaritmica in un pallone da 4 L contenente 2 L di terreno di Sauton.
- Coltivare la coltura a 37 °C in condizioni stazionarie per altre 4 settimane fino a quando non si forma una pellicola superficiale.
- Raccolta delle proteine filtrate di coltura (CFP)
- Raccogliere la coltura mediante centrifugazione a 1.000-1.500 x g per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Filtrare il surnatante attraverso un sistema di filtrazione sottovuoto da 0,45 μm.
- Concentrare il filtrato contenente CFP utilizzando un sistema di filtrazione a flusso tangenziale con un cutoff di 10 kDa.
- Stoccaggio della PCP raccolta
- Stimare il contenuto proteico utilizzando il kit di dosaggio BCA disponibile in commercio.
- Aliquotare le proteine, aggiungere sodio azide a una concentrazione finale dello 0,2% e conservare a -80 °C.
2. Focalizzazione isoelettrica in fase liquida preparativa (IEF)
- Preparazione del campione proteico
- Solubilizzare la CFP del Mycobacterium tuberculosis in 60 mL di tampone di separazione IEF contenente 8 M di urea, 1 mM di ditiotreitolo (DTT), 5% di glicerolo, 2% di digitonina, 2% di anfoliti (pH 3,0-10,0 e pH 4,0-6,0 in rapporto 1:4).
- Configurazione del sistema IEF
- Riempire la camera anodica con acido fosforico 0,1 M e la camera catodica con idrossido di sodio 0,1 M.
- Assemblare la cella preparativa IEF secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
- Esecuzione di IEF
- Caricare fino a 350 mg di proteine nel sistema IEF.
- Focalizzare le proteine a 4 °C con un sistema di raffreddamento dell'acqua circolatoria.
- Applicare una potenza costante di 12 W fino a quando la tensione si stabilizza a circa 1400 V, quindi continuare per altri 30 minuti.
- Raccolta e analisi delle frazioni
- Raccogli le frazioni IEF e determina il loro pH.
- Analizza ogni aliquota mediante SDS-PAGE e visualizza le proteine utilizzando la colorazione con argento.
3. SDS-PAGE preparativa ed eluizione su gel intero
- Preparazione dei campioni per SDS-PAGE
- Mescola le frazioni IEF con il tampone campione SDS-PAGE 6x disponibile in commercio.
- Scaldare il composto a 95 °C per 5 min.
- Esecuzione di SDS-PAGE preparativa
- Caricare fino a 10 mg di proteine in un gel di poliacrilammide da 16 cm × 20 cm con un gel impilabile al 4% e un gel risolutivo al 12,5%.
- Eseguire l'elettroforesi a una corrente costante di 50 mA fino a quando il fronte del colorante si trova a 2 cm dal fondo.
- Eluizione delle proteine dal gel
- Equilibrare il gel nel tampone di eluizione (60 mM di Tris, 40 mM di CAPS, pH 9,4) per 10 min.
- Trasferire il gel nello strumento per l'elettricità in gel intero.
- Eluire le proteine applicando una corrente costante di 250 mA per 1 ora.
- Raccolta e analisi delle frazioni
- Eluire le proteine separate in 30 frazioni individuali, ciascuna con un volume di 2,5 ml.
- Determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo di stima delle proteine BCA seguendo le istruzioni del produttore.
- Analizza 10 μg di proteine da ciascuna frazione mediante SDS-PAGE e visualizza utilizzando la colorazione con argento.
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Risultati
La Figura 1 illustra la complessità delle proteine filtrate di coltura (CFP) preparate. Inizialmente, 100 μg di CFP sono stati sottoposti all'analisi 2D-SDS PAGE per valutarne la complessità. Questa analisi ha rivelato la presenza di quasi 100 macchie proteiche distinte nella CFP (Figura 1).
Le 20 frazioni raccolte da ogni corsa sono state analizzate da SDS-PAGE. Di queste, tre frazioni rappresentative di tre diverse esecuzioni sono m...
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Discussione
Le proteine filtrate di coltura (CFP) di Mycobacterium tuberculosis rappresentano una miscela complessa di diversi componenti proteici presenti a concentrazioni variabili. Studi di proteomica hanno identificato fino a 1.314 proteine all'interno della CFP 4,5. Numerose indagini hanno evidenziato il ruolo cruciale delle CFP nella modulazione delle risposte immunitarie. In particolare, le CFP svolgono un ruolo indispensabil...
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ä Sistema di filtrazione a flusso tangenziale KTA flux | CYTIVA | 29038437 | |
| Anfoliti (pH da 3,0 a 10,0 ) | BIO-RAD | 1632094 | |
| Anfoliti (pH da 4,0 a 6,0 ) | BIO-RAD | 1631143 | |
| Saggio delle proteine BCA | MERCK | 71285-M | |
| TAPPI | MERCK | C2632 | |
| Idrolizzato di caseina | MERCK | 65072-00-6 | |
| Acido citrico | MERCK | Codice: C0759 | |
| Digitonina | MERCK | 300410 | |
| DTT | MERCK | D9779 | |
| Solfato di ammonio ferrico | HIMEDIA | GRM10944 | |
| Glicerolo | MERCK | G5516 | |
| Glicerolo | MERCK | 252859 | |
| Lowenstein-Jensen inclinazioni | HIMEDIA | SL001 | |
| Solfato di magnesio | MERCK | Visualizzazione del materiale M7506 | |
| Sistema di filtrazione sottovuoto a sgancio rapido Millipore Stericup | MERCK | S2HVU11RE | |
| Acido fosforico | MERCK | 695017 | |
| Ortofosfato monobasico di potassio | MERCK | P0662 | |
| Idrossido di potassio | MERCK | 484016 | |
| Cella preparativa IEF (Rotofor) | BIO-RAD | 170-2986 | |
| Sodio azide | MERCK | Episodio 2002 | |
| Glutammato di sodio | MERCK | 49621 | |
| Idrossido di sodio | HIMEDIA | MB095 | |
| Tris | MERCK | 252859 | |
| Urea | MERCK | U5128 | |
| Intero Gel Eluter apparato | BIO-RAD | 1651250 |
Riferimenti
- Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
- de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
- Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
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- Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
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Ristampe e permessi
