Articolo metodologico

Separazione e frazionamento delle proteine della parete cellulare e della membrana cellulare da Mycobacterium tuberculosis per l'analisi delle proteine a valle

DOI:

10.3791/67680

⸱

26 settembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo separa le proteine insolubili della parete cellulare e della membrana in frazioni semplici (1-5 proteine) utilizzando la focalizzazione isoelettrica preparativa (IEF) basata sul punto isoelettrico, seguita dalla separazione per peso molecolare. Le frazioni risultanti possono essere utilizzate direttamente per analisi immunologiche e proteomiche senza ulteriore purificazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le proteine della parete cellulare e della membrana dei micobatteri, che svolgono un ruolo centrale nella patogenesi della tubercolosi, sono state separate con successo utilizzando la focalizzazione isoelettrica preparativa (IEF) e l'elettroforesi preparativa su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Segue l'eluizione su gel, superando i limiti dei metodi convenzionali per la separazione delle proteine idrofobiche. In questa procedura, le colonie di M. tuberculosis sono state trasferite dalle inclinazioni di Lowenstein-Jensen in 2 mL di brodo 7H9, disperse con perle di vetro e incubate a 37 °C per 2 settimane. Quindi, la coltura è stata scalata fino a 200 ml e coltivata in uno shaker per 4 settimane. È stato ulteriormente aumentato a 1 litro con 500 ml di brodo 7H9 e coltivato per altre 4 settimane. I micobatteri cresciuti sono stati pellettati mediante centrifugazione a 1741 × g per 30 minuti. Per ogni pellet da 2 g, è stato aggiunto 1 mL di tampone di rottura e il campione è stato sonicato. Il lisato è stato centrifugato a 3436 × g per 15 minuti per rimuovere le cellule integre e il surnatante è stato concentrato. Questo surnatante (lisato di cellule intere) è stato centrifugato a 13751 × g per 30 minuti per pellettare le proteine della parete cellulare. Il surnatante rimanente è stato ultracentrifugato a 100.000 × g per 4 ore per separare la membrana cellulare e il citosol. La parete cellulare isolata e le proteine di membrana sono state caricate su un sistema IEF preparativo liquido a 4 °C e separate a 12 W fino a quando la tensione si è stabilizzata a 1400 V, che separa 20 frazioni. Queste frazioni IEF sono state ulteriormente separate mediante SDS-PAGE preparativo e le proteine sono state eluite utilizzando un intero gel eluter a 250 mA, ottenendo 30 frazioni. Attraverso questo protocollo, siamo stati in grado di identificare nuove pareti cellulari di M. tuberculosis e biomarcatori specifici per la membrana, e mostra anche il potenziale per caratterizzare proteine simili in altri patogeni.

Introduzione

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Studi immunologici hanno dimostrato che oltre alle proteine solubili, che sono facili da purificare, la risposta immunitaria umana a patogeni come M. tuberculosis è diretta anche la proteina idrofobica presente nella parete cellulare1 e le proteine della membrana cellulare2 di Mycobacterium tuberculosis. Queste proteine della parete cellulare e della membrana svolgono un ruolo cruciale nel controllo immunologico contro molti agenti patogeni, tra cui la tubercolosi. Alcune di queste proteine sono riportate come antigeni immunodominanti che montano la risposta delle cellule T e B. Al contrario, altre proteine sono identificate come firme molecolari di agenti patogeni che sono riconosciuti per avviare una risposta immunitaria innata, come i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP) da parte delle cellule immunitarie, avviando così una risposta immunitaria. Ad esempio, le lipoproteine micobatteriche come LprG, LpqH, LprA e PhoS1 sono riconosciute dal recettore Toll-like 23.

La natura idrofobica delle proteine della parete cellulare e della membrana presenta sfide tecniche significative in termini di solubilizzazione e separazione. Gli studi hanno dimostrato che le proteine di membrana costituiscono circa il 20-30% delle regioni codificanti di tutti gli organismi, compresi i micobatteri 4,5. A causa della loro natura intrinseca e delle sfide tecniche, le proteine della parete cellulare e della membrana sono più difficili da solubilizzare e isolare rispetto alle proteine solubili. Di conseguenza, è stato riportato solo il 2% delle strutture proteiche di membrana6. Diversi fattori contribuiscono alla difficoltà di isolare queste proteine. La sfida principale è la loro bassa abbondanza all'interno della cellula, che complica l'isolamento delle singole proteine per un'ulteriore caratterizzazione7. Inoltre, queste proteine tendono ad aggregarsi, complicando ulteriormente la loro solubilità. Questo problema può essere risolto aggiungendo detergenti per facilitare la solubilizzazione. Tuttavia, alcune proteine possono comunque formare aggregati anche in presenza di detergenti, nel qual caso si possono utilizzare agenti caotropici e agenti riducenti per migliorare la solubilità.

L'uso di detergenti per la solubilizzazione può interferire con i successivi metodi di separazione. Ad esempio, i detergenti caricati non possono essere utilizzati con la cromatografia a scambio ionico e tutti i detergenti possono interrompere la cromatografia di interazione idrofobica8. Pertanto, la selezione di un detergente compatibile con il metodo di separazione scelto è fondamentale. Un altro passo importante nell'isolamento della parete cellulare e delle proteine di membrana è la rimozione dei detergenti utilizzati per la solubilizzazione, in quanto questi possono interferire con le successive analisi funzionali delle proteine.

Abbiamo sviluppato una metodologia robusta che supera molte delle sfide associate all'analisi delle proteine di membrana, in particolare le proteine idrofobiche della parete cellulare e della membrana cellulare. Una sfida chiave nello studio di queste proteine è la loro solubilizzazione, poiché la loro natura idrofobica le rende difficili da estrarre e analizzare. La metodologia qui descritta impiega un tampone di focalizzazione isoelettrica (IEF) appositamente formulato, che solubilizza in modo efficiente le proteine della parete cellulare e della membrana cellulare. Questa fase di solubilizzazione è fondamentale in quanto consente la successiva analisi di queste proteine idrofobiche.

Un ulteriore vantaggio di questo metodo è la sua capacità di ridurre la complessità della miscela proteica. Utilizzando due tecniche di separazione complementari, basate sul punto isoelettrico (pI) e sul peso molecolare delle proteine, questa metodologia separa in modo efficiente le proteine della parete cellulare e della membrana cellulare in frazioni semplificate. Ogni frazione contiene in genere solo da una a tre proteine, migliorando significativamente la risoluzione e facilitando la caratterizzazione a valle.

Questa metodologia, sviluppata utilizzando le proteine della parete cellulare e della membrana cellulare del Mycobacterium tuberculosis come sistema modello, affronta efficacemente le sfide associate all'isolamento e all'analisi delle proteine idrofobiche. Fornisce un approccio affidabile per l'isolamento, la separazione e la caratterizzazione di queste frazioni proteiche complesse, migliorando la capacità di studiarle in dettaglio.

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Protocollo

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Questo studio è conforme alle linee guida governative pertinenti ed è stato approvato dal Comitato Consultivo Scientifico Istituzionale e dal Comitato Etico. Il consenso informato è stato ottenuto dalla popolazione dello studio prima che i campioni fossero prelevati.

1. Coltura di M. tuberculosis

  1. Trasferire circa 10 colonie di M. tuberculosis dalle inclinazioni di Lowenstein-Jensen a 2 ml di terreno da brodo 7H9 (sospendere 2,35 g di Middlebrook 7H9 Broth Base in 400 mL di acqua distillata, 50 mL di integratore di albumina oleica destrosio catalasi [OADC], 0,5 g di Tween 80 e portare fino a 500 mL)
    NOTA: M. tuberculosis è un patogeno del gruppo di rischio 3; deve essere maneggiato in una cabina di sicurezza biologica (BSC) nella struttura BSL3. Devono essere utilizzati dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati.
  2. Disperdere le cellule utilizzando perle di vetro in condizioni sterili in uno shaker per bottiglie a 15 giri/min per 1 minuto.
  3. Trasferire la sospensione batterica in 10 mL di terreno da brodo 7H9 in una bottiglia McCartney e incubare a 37 °C per 2 settimane in un'incubatrice shaker a 30 giri/min.
  4. Aumentare la coltura in fase loglogaritmica a 200 ml di terreno da brodo 7H9 e far crescere in una coltura shaker per 4 settimane a 30 giri/min.
  5. Inoltre, ingrandire la coltura in un pallone da 1 litro contenente 500 ml di terreno da brodo 7H9 e crescere come coltura shaker a 30 giri/min per 4 settimane a 37 °C.
  6. Raccogliere i micobatteri centrifugando a 1741 g per 30 min.

2. Preparazione di proteine del lisato a cellula intera

  1. Sottoporre il pellet batterico isolato a sonicazione seguendo un protocollo standard.
  2. Preparare il tampone di rottura con la seguente composizione: 20 mM Tris con NaCl all'8,5% (8,5 g per 100 mL).
  3. Regolare il pH finale a 7,4 con HCl concentrato.
  4. Aggiungere gli inibitori della proteasi appena preparati al tampone di rottura con le seguenti concentrazioni (i dettagli sugli inibitori della proteasi da aggiungere sono elencati nella Tabella supplementare 1)
  5. Trattare i bacilli di M. tuberculosis (100 mL di volume confezionato e pesato) per ogni 2 g di pellet di cellule batteriche, aggiungere 1 mL di tampone di rottura con lisozima (1 mg/5 mL di sospensione cellulare) e incubare per 15 minuti a 37 °C agitando delicatamente.
  6. Sospendere i bacilli nel doppio del suo volume di tampone di rottura.
  7. Aggiungere lo 0,04% (wt/vol) di sodio azide e lo 0,05% di Tween 80 al tampone.
  8. Distruggi le cellule batteriche nel tampone di rottura utilizzando un sonicatore con un ciclo di 9 s on e 9 s off per 30 minuti al 40% di ampiezza, mantenendo la sospensione sul ghiaccio per prevenire la denaturazione delle proteine.
  9. Centrifugare il lisato preparato a 3438 g per 15 minuti a 4 °C per eliminare le cellule integre.
  10. Concentrare il surnatante utilizzando concentratori centrifughi (cutoff 3 kDa - 5 mL).
  11. Determinare la concentrazione proteica nel surnatante utilizzando il test di quantificazione delle proteine dell'acido bicinconninico (BCA) utilizzando la proteina BSA come standard.
    NOTA: Nell'analisi SDS-PAGE, caricare 50 μg di proteina per l'analisi.

3. Isolamento delle proteine della parete cellulare e della membrana cellulare mediante ultracentrifugazione

  1. Isolare la parete cellulare, la membrana cellulare e le proteine citosoliche dall'intero lisato cellulare seguendo il protocollo di Raja et al.9. come descritto di seguito.
  2. Centrifugare l'intero lisato cellulare a 13751 × g a 4 °C per 30 minuti, separando le proteine della parete cellulare sotto forma di pellet.
  3. Sottoporre il surnatante a ultracentrifugazione a 100.000 × g a 4 °C per 4 ore utilizzando un'ultracentrifuga, separando le proteine della membrana cellulare come un pellet e lasciando le proteine citosoliche nel surnatante.
  4. Stimare le concentrazioni proteiche nella parete cellulare e nelle frazioni della membrana cellulare utilizzando il saggio delle proteine BCA.
    NOTA: Nell'analisi SDS-PAGE, caricare 50 μg di proteina per l'analisi. La parete cellulare e la membrana cellulare separate vengono conservate in un congelatore a -80 °C fino a ulteriori analisi.

4. Focalizzazione isoelettrica preparativa in fase liquida (Rotofor [apparecchio IEF])

  1. Solubilizzare la parete cellulare e le proteine della membrana cellulare isolate mediante ultracentrifugazione in un tampone IEF contenente 8 M di urea, 1 mM di DTT, 5% di glicerolo, 2% di digitonina.
  2. Aggiungere il 2% di anfoliti (pH da 3,0 a 10,0 e pH da 4,0 a 6,0 in rapporto 1:4)
  3. Frazionare le proteine solubilizzate utilizzando un sistema IEF liquido mantenuto a 4 °C con un bagno di acqua di raffreddamento.
  4. Eseguire la separazione IEF secondo le istruzioni del produttore, applicando una potenza costante di 12 W fino a quando la tensione non si stabilizza (tra 1300 V e 1600 V).
  5. Continuare l'esecuzione IEF per altri 30 minuti dopo la stabilizzazione della tensione, con un tempo di funzionamento totale di circa 5-6 ore.
  6. Raccogliere le singole frazioni IEF utilizzando una pompa a vuoto e determinarne i valori di pH.
  7. Sottoporre le frazioni separate (50 μg) a SDS-PAGE e visualizzare le proteine utilizzando la colorazione Coomassie Brilliant Blue (CBB) o argento. Conservare le frazioni IEF separate in un congelatore a -80 °C fino a ulteriori analisi.

5. SDS-PAGE preparativa ed eluizione dell'intero gel

  1. Miscelare le frazioni della parete cellulare e della membrana cellulare separate da IIF con 6 tamponi campione SDS-PAGE e riscaldare a 95 °C per 5 minuti prima dell'analisi SDS-PAGE.
  2. Separare le frazioni proteiche nella seconda dimensione utilizzando gel di poliacrilammide da 16 cm e 20 cm costituiti da un gel risolutivo al 12,5% e da un gel impilabile al 4%.
  3. Utilizzare un singolo pozzetto per campioni lungo 13 cm per caricare il campione.
  4. Condurre l'elettroforesi a una corrente costante di 50 mA/gel fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.
  5. Equilibrare il gel nel tampone di eluizione (60 mM Tris, pH 9,4; 40 mM 3-(Acido cicloesilammino)-1-propansulfonico [CAPS]) per 10 minuti dopo l'esecuzione dell'elettroforesi.
  6. Trasferire il gel in un intero apparecchio per gel elettrico come descritto dal produttore dello strumento.
  7. Eluire le proteine dal gel facendo scorrere l'eluter a una corrente costante di 250 mA per 1 ora.
  8. Raccogliere circa 30 frazioni proteiche, ciascuna con un volume di 3 ml, da ciascun gel utilizzando una pompa a vuoto.
  9. Quantificare la concentrazione proteica nelle frazioni eluite utilizzando il saggio delle proteine BCA.
  10. Sottoporre 10 μg delle frazioni eluite all'analisi SDS-PAGE e visualizzare mediante colorazione blu brillante (CBB) di Coomassie.
    NOTA: Le frazioni di gel eluito intere separate sono state conservate nel congelatore a -80 °C fino a ulteriori analisi.

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Risultati

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Isolamento delle proteine della parete cellulare e della membrana cellulare mediante ultracentrifugazione ad alta velocità
Le proteine della parete cellulare e della membrana sono state isolate da lisati cellulari interi mediante ultracentrifugazione, come indicato nel protocollo. L'analisi SDS-PAGE delle frazioni subcellulari separate, della parete cellulare, della membrana cellulare e dei profili proteici del citosol di M. tuberculosis è mostrata nella Figura 1...

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Discussione

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La natura idrofobica delle proteine della parete cellulare e della membrana presenta sfide sperimentali significative nella loro solubilizzazione e separazione. Nel protocollo sopra menzionato, abbiamo descritto un nuovo metodo di separazione bidimensionale basato sull'elettroforesi per isolare efficacemente queste proteine idrofobiche. In questo protocollo, abbiamo inizialmente separato le proteine della membrana e della parete cellulare in base ai loro punti isoelettrici utilizzando il...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è pienamente supportato dalla sovvenzione DST SERB del Dr. K. R. Uma Devi. Il Dr. B. Ramalingam è stato finanziato dalla borsa di studio DBT-Ramalingaswamy.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
7H9 brodo Himedia Visualizzazione M198
40% Bio-Lyte 3/10 Anfolita BIO-RAD1631113
Saggio delle proteine BCA MERCKBCA1
Bio-Lyte 5/7 Anfolita BIO-RAD1631152
concentratori centrifughi 3 kDaMERCKZ629456
Digitonina.MERCKD141
DnaseMERCK11284932001
DTTMERCKD9779
EDTAMERCKE 9884
EGTAMERCKE3889
GliceroloMERCKG5516
LeupeptinMERCKE18
Pepstatina AMERCKP5318
PMSFMERCK78830
RnaseMERCK10109134001
Rotofor BIO-RAD170-2986  Apparecchio di focalizzazione isoelettrica (IEF)
SonicatoreVibra-Cell, SoniciVC 750
TLCKMERCKCodice: T7254
TPCKMERCK4376
ureaMERCKU5378
Intero Gel Eluter apparato BIO-RAD1651250

Riferimenti

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  3. Drage, M. G., et al. TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis. Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).
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