Articolo metodologico

Sul posto Isolamento e coltura di batteri del suolo recalcitranti utilizzando un chip di isolamento (iChip)

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DOI:

10.3791/67692

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6 agosto 2025

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la progettazione e l'uso di un chip di isolamento (iChip) per la coltivazione in situ di microbi del suolo recalcitranti nel loro ambiente naturale. Descrive anche la coltivazione in situ di batteri del suolo che producono antimicrobici. Il protocollo può essere adattato per recuperare batteri da diverse nicchie con altre proprietà desiderabili.

Abstract

Gli ecosistemi ospitano milioni di microbi ambientali, alcuni dei quali in grado di produrre prodotti biotecnologicamente rilevanti come enzimi, vitamine, aminoacidi, acidi organici, agenti antiparassitari e agenti antimicrobici. La maggior parte di questi batteri ambientali sono considerati "incoltivabili" poiché i metodi di coltura in laboratorio non riescono a soddisfare i loro requisiti nutrizionali/ambientali. Inoltre, poiché coesistono in natura, possono anche dipendere da un nutriente/metabolita prodotto da un altro membro della comunità microbica. Portare la diversità microbica "non coltivata" nella coltura rappresenterà un'opportunità per esplorare la vasta gamma di prodotti bioattivi che possono codificare. Questo articolo descrive l'implementazione della tecnologia iChip, una camera di diffusione multicanale sviluppata per una coltura in situ ad alto rendimento dei batteri "non coltivabili". Data la minaccia globale della resistenza antimicrobica, l'articolo fornisce un protocollo dettagliato per la coltivazione in situ e il recupero di isolati dalla "materia oscura" microbica in grado, ad esempio, di produrre agenti antimicrobici. Questo protocollo descrive le fasi coinvolte, dalla fase di raccolta del campione di terreno fino al recupero degli isolati, ed evidenzia i fattori plausibili che possono influenzare il successo dell'isolamento. L'uso di questa tecnologia non solo facilita l'isolamento di batteri altrimenti "non coltivabili" per la scoperta di antibiotici, ma consente anche ai ricercatori di approfondire la complessa ecologia del suolo, che può quindi essere sfruttata per una miriade di altre applicazioni.

Introduzione

Ricchi depositi di microbi precedentemente inesplorati esistono in ambienti naturali come il suolo, i corpi idrici e gli ambienti estremi. Tuttavia, è difficile attingere a questa enorme biodiversità di microbi, poiché la maggior parte di essi non può essere facilmente coltivata utilizzando terreni e metodi di laboratorio tradizionali. L'anomalia del grande numero di piastre descrive questo fenomeno, evidenziando il numero discordante di microrganismi che possono essere osservati visivamente rispetto a quelli che si osservano crescere nei terreni di coltura1. Aggirare questa barriera e consentire l'accesso alla diversità incoltivabile dei microbi e dei loro prodotti potrebbe soddisfare varie esigenze biotecnologiche.

Ad esempio, lo sviluppo della resistenza antimicrobica è diventato una minaccia per la salute pubblica globale. Le principali aziende farmaceutiche sono state riluttanti a perseguire la scoperta di nuovi antimicrobici, causando una diminuzione del tasso di scoperta rispetto al tasso di comparsa della resistenza agli antibiotici esistenti 2,3. Pertanto, vi è un bisogno critico per la scoperta di nuovi antimicrobici4. Poiché le comunità microbiche si sono evolute insieme in concomitanza o in competizione5, hanno sviluppato il potenziale per produrre nuovi composti chimici che aumentano le loro possibilità di sopravvivenza. L'enorme diversità dei microbi ambientali e dei loro prodotti non è stata completamente esplorata, poiché i metodi tradizionali basati sulla coltura di laboratorio spesso portano all'isolamento di microbi simili e noti. Questo perché i terreni e i metodi di coltura convenzionali sono orientati verso la coltivazione di microbi rilevanti per l'uomo e non riescono a imitare gli ambienti naturali. La progettazione di terreni di coltura per la coltivazione di microbi ambientali è impegnativa, poiché la crescita di alcune specie può richiedere vari nutrienti, spesso prodotti da altri microbi nelle vicinanze, e condizioni ambientali specifiche.

Per affrontare questo problema e per coltivare microbi ambientali in situ, sono state sviluppate per la prima volta camere di diffusione6. La camera di diffusione è un O-ring in acciaio inossidabile. Lo spazio all'interno dell'anello viene riempito con agar seminato con un'appropriata diluizione del campione. La parte superiore e inferiore dell'anello vengono quindi sigillate con membrane in policarbonato, che consentono la diffusione di nutrienti e metaboliti derivati dal suolo impedendo l'infiltrazione di altri microbi nella camera6. Dopo la semina, la piastra viene posta nell'ambiente da cui viene raccolto il campione per consentire la coltura in situ. La camera di diffusione è stata altamente efficiente e ha portato alla coltivazione di numerosi microbi precedentemente non coltivabili. Tuttavia, il design dell'O-ring con agar è diventato laborioso e a bassa produttività, lasciando aperto uno spazio problematico per ulteriori innovazioni6. Poco dopo, èstato progettato un chip di isolamento (iChip), in grado di eseguire la coltura in situ e il recupero simultaneo ad alto rendimento di colture pure. Questo design è concettualmente lo stesso di una camera di diffusione, ma consiste di più canali in cui ogni canale agisce come una camera di diffusione indipendente, consentendo il potenziale recupero di una singola microcolonia da ciascuna camera8. La rivisitazione del design della camera di diffusione ha notevolmente migliorato la produttività della tecnologia e ha consentito l'isolamento e la coltivazione di una maggiore biodiversità di taxa dal suolo, dall'acqua marina9, dalle sorgenti termali10, ecc. La teixobactina, un antibiotico descritto di recente, è stata scoperta seguendo la tecnologia descritta sopra11. Ha mostrato un nuovo meccanismo di azione antimicrobica ed è risultato letale contro gli agenti patogeni che causano infezioni invasive, dimostrando che l'isolamento ad alto rendimento dei microbi dalla "materia oscura" microbica può essere semplificato in modo efficiente per la scoperta di prodotti naturali biotecnologicamente rilevanti utilizzando questa tecnologia12.

Questo articolo funge da guida procedurale per l'efficace implementazione di questa tecnologia ad alto rendimento per la coltivazione in situ e il recupero di batteri recalcitranti produttori di antimicrobici dalla "materia oscura" microbica del suolo. Il protocollo delinea la progettazione di un chip di isolamento, la raccolta dei campioni, la preparazione dei campioni, la semina, l'incubazione e il recupero. Sebbene il protocollo presentato dimostri la coltura in situ di microbi dal suolo, lo stesso può essere facilmente adattato per la coltivazione in situ di microbi da qualsiasi ambiente. Le capacità ad alto rendimento di questa tecnologia potrebbero aumentare la probabilità di scoprire nuovi microbi e utilizzare il loro potenziale biosintetico per varie applicazioni biotecnologiche.

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Protocollo

1. Progettazione e stampa 3D

  1. Scegliere il design e le dimensioni in base al tipo di campione, al volume per camera di diffusione, alle dimensioni della membrana da utilizzare e alla produttività richiesta (numero di camere di diffusione).
    NOTA: Lo spessore della piastra centrale e il diametro di ciascun canale determinano il volume di ciascuna camera di diffusione cilindrica. Le dimensioni dipendono dal numero di singole camere di diffusione da alloggiare e le dimensioni della membrana dipendono direttamente dal numero di camere di diffusione coperte (Figura 1).
  2. Utilizzare l'opzione Inserisci forme in qualsiasi programma software di presentazione per inserire cerchi delle dimensioni necessarie per fungere da iChip. Inserisci cerchi più piccoli all'interno per rappresentare i canali. Disporre i cerchi più piccoli nel modello desiderato per preparare un disegno preliminare per la piastra superiore/inferiore e centrale. Seleziona il disegno e usa il menu di scelta rapida per salvare il progetto preliminare come immagine.
  3. Utilizzando il progetto preliminare come modello, inizia a creare un progetto bidimensionale (2D) utilizzando un software di progettazione assistita da computer (CAD).
    1. Dal menu di schizzo, inserire forme predefinite, prevalentemente cerchi, per creare il disegno di base per le piastre e la serie di canali.
    2. Utilizzare l'opzione di quota per impostare le dimensioni effettive delle piastre e dei canali. Fare clic su OK per finalizzare il progetto, quindi utilizzare la funzione di estrusione per convertire il progetto 2D in un modello 3D dello spessore desiderato.
    3. Infine, utilizza il menu file Salva per salvare una copia del modello 3D nel formato di file stereolitografia (STL), compatibile per la stampa 3D.
  4. Scegli il materiale per la stampa in base all'applicazione desiderata, considerando fattori come il metodo di sterilizzazione preferito e il sito di impianto. Ad esempio, scegli un materiale resistente alla temperatura se verrà utilizzata l'autoclave per la sterilizzazione o se verranno piantati in un sito in cui la temperatura è elevata.
    NOTA: La stampa 3D per questo esperimento è stata eseguita utilizzando un materiale simile alla ceramica in grado di resistere a temperature elevate fino a 268 °C ed era, quindi, autoclavabile.
  5. Scegli un metodo di stampa 3D appropriato, a seconda delle dimensioni (dettaglio e risoluzione) e del materiale utilizzato.
    NOTA: La stampa 3D che utilizza la stereolitografia, un metodo di produzione additiva, può creare strutture complesse polimerizzando una resina termoindurente con un laser ultravioletto (UV). La stereolitografia può essere utilizzata con diversi materiali e consente eccellenti finiture superficiali e un'elevata risoluzione dei dettagli.

2. Raccolta di campioni di terreno

  1. Scarica e installa un'applicazione mobile di geocodifica che consente l'identificazione di siti di 3 m x 3 m in tutto il mondo fornendo un indirizzo univoco di 3 parole per il sito da qualsiasi negozio di applicazioni mobili. Identificare un sito per la raccolta di campioni di terreno. Quindi, apri l'applicazione mobile di geocodifica per identificare il sito di interesse e il suo indirizzo univoco di tre parole.
  2. Registrare l'indirizzo univoco di tre parole, la data, l'ora, la profondità alla quale il campione deve essere raccolto, le condizioni meteorologiche, la vita vegetale e animale nelle vicinanze, l'esposizione del sito e la temperatura del sito (superficie e sottosuolo alla profondità desiderata).
    NOTA: Il terreno può contenere batteri patogeni. Pertanto, utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati (guanti, camici da laboratorio, ecc.) e seguire protocolli appropriati per il livello di biosicurezza 2. Ridurre al minimo il contatto per prevenire la contaminazione e l'esposizione del campione. Disinfettare la superficie di lavoro prima e dopo aver maneggiato campioni di terreno.
  3. Decontaminare la pala spruzzandola con etanolo al 70% e strofinandola. Decontaminare la scatola di polistirolo, in cui deve essere raccolto il terreno, spruzzandola con etanolo al 70% e strofinandola. Lasciare asciugare completamente l'etanolo residuo prima di procedere ulteriormente.
    NOTA: Sebbene questo protocollo utilizzi una scatola di polistirene per raccogliere il campione ed eseguire l'incubazione, se lo si desidera, è possibile utilizzare anche alternative come contenitori di vetro e metallo.
  4. Rimuovere qualsiasi materiale vegetale, lettiera di foglie e/o pietre dalla superficie per esporre il terriccio. Decontaminare nuovamente la pala come prima, ripulire il terriccio e valutare il terreno a una profondità di 3-6 pollici sotto la superficie. Utilizzare un righello per misurare la profondità dalla superficie. Utilizzando la pala sterilizzata in superficie, raccogliere 4-5 kg di terreno dalla profondità desiderata nella scatola di polistirolo.
  5. Sigilla la scatola con un coperchio. Se è necessario raccogliere più di un campione, decontaminare la pala tra due siti di campionamento per evitare la contaminazione incrociata. Una volta raccolti tutti i campioni, trasportarli immediatamente in laboratorio.

3. Preparazione del campione per la semina

  1. Dal campione di terreno raccolto, pesare 1 g di terreno privo di detriti, rocce e lettiera di foglie in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml contenente 10 ml di soluzione fisiologica sterile.
    NOTA: Conservare parte del campione di terreno come scorte di glicerolo13,14 a -80 °C per conservare la popolazione microbica nativa per esigenze future.
  2. Mescolare il terreno con la soluzione salina agitando per circa 10 s per creare un impasto di terreno. Lasciare la provetta da centrifuga indisturbata per 5 minuti per consentire alle particelle di sporco più grandi nella provetta di depositarsi. Quindi, trasferire con cura la sospensione di terreno surnatante in una provetta fresca etichettata come "S".
  3. Utilizzando la sospensione di terreno come campione non diluito, eseguire la diluizione seriale trasferendo 1 mL del campione in 9 mL di soluzione fisiologica sterile in una provetta nuova. Preparare le diluizioni da 10-1 a 10-5.
    NOTA: La conta su piastra delle sospensioni di terreno diluite su terreni non selettivi può fornire alcune informazioni sulla densità dei batteri nel campione, che possono essere utilizzate per scegliere la diluizione appropriata per la semina. Tuttavia, si noti che questa è solo una stima dei batteri coltivabili presenti nel campione.

4. Semina e assemblaggio

  1. All'interno di una cappa di biosicurezza, decontaminare la piastra superiore, la piastra inferiore e la piastra centrale immergendola in etanolo al 70% per 10 minuti. Sciacquare l'etanolo in eccesso lavando le piastre con acqua deionizzata sterile e lasciarle asciugare all'aria in una capsula di Petri sterile.
  2. Mettere la piastra centrale in una capsula di Petri sterile, pronta per la semina. Quindi, sciogliere il terreno di coltura SMS agar in un forno a microonde, lasciarlo raffreddare e trasferire 22,5 ml di SMS agar a 45 °C in una provetta da centrifuga da 50 ml.
  3. A questo, aggiungere 2,5 mL di un'appropriata diluizione del campione di terreno e mescolare bene per leggera inversione, evitando l'introduzione di bolle d'aria.
    NOTA: Scegliere una diluizione appropriata per la semina. Per ottenere una densità di semina finale come nella diluizione 10-4 , scegliere la sospensione 10-3 poiché il campione verrà ulteriormente diluito di 10 volte nel terreno utilizzato per la semina.
    1. Scegliere la diluizione di semina per immobilizzare 1 cellula per camera, che può poi svilupparsi in una colonia in situ.
      NOTA: L'acqua distillata può anche essere utilizzata al posto del mezzo SMS per imitare l'ambiente del suolo e per consentire la crescita di microrganismi che crescono solo in tali condizioni. Opzionalmente, agenti antifungini come la cicloesimide possono anche essere aggiunti al terreno di semina per evitare la crescita di funghi.
  4. Versare lentamente 3-4 ml del terreno di coltura SMS agar seminato sulla piastra centrale, coprendo l'intera superficie. Quindi lasciare che l'SMS agar medio si fissi per circa 5-10 minuti. Controllare se il mezzo di trasmissione SMS è impostato. Quindi, con una lama di rasoio sterile, raschiare l'eccesso di SMS agar dalla superficie della piastra, lasciando dietro di sé i tappi di agar nelle singole camere di diffusione.
  5. Dopo aver rimosso il foglio protettivo da uno dei filtri a membrana in policarbonato da 0,03 μm, posizionarlo con cura all'interno della piastra superiore utilizzando una pinza sterile. Quindi, posizionare un altro filtro a membrana in policarbonato da 0,03 μm sul lato esposto della piastra centrale seminata utilizzando una pinza sterile.
  6. Posizionare le piastre superiore e inferiore, inserendo la piastra centrale e le membrane in policarbonato, avendo cura di allineare i fori delle viti in tutte le piastre, per completare il montaggio (Figura 1B). Serrare i dadi e i bulloni per fissare il gruppo.
    NOTA: E' buona norma assemblare in parallelo un iChip di controllo con solo agar SMS sterile, senza semina, e piantarlo nel terreno insieme a quello seminato per verificarne la tenuta. Ciò escluderebbe il possibile ingresso di microbi dall'ambiente e fungerebbe da controllo negativo.

5. Coltivazione e recupero in situ

  1. Crea una depressione più grande delle dimensioni dell'iChip nel terreno raccolto nella scatola di polistirolo usando una pala sterile. Piantare il gruppo verticalmente all'interno della depressione e compattarlo con il terriccio saldamente, assicurandosi che tutte le superfici siano completamente coperte. Quindi consentire la coltura in situ per la durata desiderata da 2 a 4 settimane. Durante l'incubazione, utilizzare acqua distillata sterile per inumidire periodicamente il terreno per evitare che i tappi di agar SMS seminati nelle camere di diffusione si secchino.
    NOTA: Posizionare il gruppo in posizione verticale impedisce continue infiltrazioni d'acqua attraverso le camere di diffusione durante il normale inumidimento del terreno, come può verificarsi se viene piantato orizzontalmente.
  2. Dopo l'incubazione desiderata, rimuovere delicatamente il terreno attorno all'iChip piantato per recuperarlo. Quindi, lavarlo con soluzione fisiologica sterile per rimuovere le particelle di sporco aderenti e trasferirlo in una cabina di biosicurezza per un'ulteriore lavorazione.
  3. Svitare i dadi e i bulloni dal gruppo. Quindi, smontarlo con cura. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere le membrane in policarbonato e trasferire la piastra centrale nella capsula di Petri preparata.
  4. Utilizzare applicatori sterili in legno per recuperare i singoli tappi di agar all'interno di ciascuna camera di diffusione. Inoculare i tappi di agar in terreni appropriati come l'agar SMS o l'agar di brodo di soia triptico 0,1x per tentare la coltivazione in laboratorio.
    NOTA: Gli isolati coltivati possono quindi essere sottoposti a screening per la produzione di antimicrobici con metodi di routine come l'agar overlay15.
  5. In alternativa, colorare e visualizzare i tappi di agar recuperati contenenti batteri del suolo recalcitranti coltivati in situ per confermare la crescita delle microcolonie in condizioni di in situ .
    NOTA: Per migliorare la sensibilità di rilevamento, il tappo di agar schiacciato può anche essere colorato utilizzando coloranti fluorescenti in grado di colorare i batteri, seguiti dalla microscopia a fluorescenza.

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Risultati

L'iChip utilizzato in questo protocollo è stato progettato, stampato in 3D e assemblato come mostrato nella Figura 1. La panoramica del protocollo descritto è mostrata nella Figura 2. Il campione di terreno utilizzato per l'esperimento è stato raccolto dal campus IIT Jodhpur nel Rajasthan, in India. L'indirizzo univoco di tre parole della posizione era "comunicare.supervisionare.ricorrenza". Il luogo scelto è stata una zona semi-arida con una temperatura di 40 °...

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Discussione

I numerosi habitat unici sulla Terra ospitano comunità microbiche distinte che rappresentano un'enorme diversità. Questo rimane inesplorato a causa delle limitazioni nel fornire le condizioni di crescita appropriate necessarie per la loro coltivazione. Alcuni batteri dipendono dai metaboliti rilasciati da altri per la loro sopravvivenza e quindi non sono in grado di sopravvivere in modo indipendente in condizioni di laboratorio. Inoltre, i batteri svolgono anche un ruolo cruciale nell'or...

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Dichiarazioni

Gli autori non rivelano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

A.V. è stato sostenuto dal programma Prime Minister's Research Fellowship (PMRF), Govt. V.V. è stato supportato dal programma Innovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship (INSPIRE) del Dipartimento di Scienza e Tecnologia, Governo dell'India. La visita di I.B. è stata parzialmente finanziata da una borsa di studio Fulbright APE dell'USIEF. Gli autori ringraziano il Dipartimento di Bioscienze e Bioingegneria e l'Indian Institute of Technology di Jodhpur per il supporto logistico e la fornitura di infrastrutture per questo lavoro. Si ringrazia l'assistenza tecnica del Dr. Sudarshna Negi, della Sig.ra Aastha Kapoor, del Sig. Tamal Dey, del Sig. Bharat Pareek, del Sig. Ajeet Singh e di altri membri del Laboratorio di Fisiologia Microbica, IIT Jodhpur.

Coorte di partecipanti ADSB-2024

La coorte di partecipanti al corso breve sulla scoperta di antibiotici nei batteri del suolo (ADSB) 2024, organizzato presso il Dipartimento di Bioscienze e Bioingegneria, Indian Institute of Technology Jodhpur (Nomi elencati in ordine alfabetico):

Abinash Kumar Jena, Banishree Jali, Bharat Gurnani, Bharat Pareek, Dipro Mukherjee, Garima Kanwar Shekhawat, GT Vishnu, Jayita Sarkar, Krishna Saharan, Kriti Singhal, Lekh Raj, Mitta Bindusree, Phulen Sarma, Priyanka Kumari, Rachana Dinesh, Satyendra Singh e Swathi Sujith

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Stampante 3DProtolabs, USA1631-833Fornitore di servizi di stampa 3D
Agarose Himedia, IndiaMB002Componente multimediale
Casamino AcidiSisco, India68806Componente multimediale
Caseina DigestASES, IndiaC5890Componente multimediale
Membrana in policarbonatoSterlitech, USAPCT00347100Consumabile
Fecola di patateHimedia, IndiaGM403Componente multimediale
PowerPointMicrosoft, USAN/AUtilizzato per la creazione di componenti iChip progettazione preliminare
PTCCreo PTC, USAN/AUtilizzato per computer 3D assistiti da computer modellazione di componenti iChip
Tryptic Soy BrodoHimedia, IndiaM011Mezzo di laboratorio
What3WordsWhat3Words, UKN/AUtilizzato per la registrazione delle coordinate del luogo di campionamento

Riferimenti

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