Articolo metodologico

Cellule Neurali Della Cresta Cranica Protocollo Tridimensionale In Vitro Di Differenziazione Per Saggio Multiplexed

DOI:

10.3791/67695

⸱

14 febbraio 2025

 ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Inserm, Institut Cochin

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo di differenziazione in vitro tridimensionale (3D) che genera neurosfere di dimensioni riproducibili per produrre cellule della cresta neurale cranica da cellule staminali embrionali di topo. Dimostriamo che questa metodologia riduce la variabilità rispetto ai protocolli precedenti e come può essere utilizzata per saggi multiplexati per studiare lo sviluppo delle cellule della cresta neurale cranica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con la loro notevole capacità di generare derivati sia ectodermici che mesenchimali, le cellule della cresta neurale cranica (CNCC) hanno suscitato molto interesse nello studio dei meccanismi che regolano le decisioni sul destino cellulare e la plasticità. Originata nel neuroepitelio dorsale, questa popolazione cellulare è transitoria e relativamente rara nell'embrione in via di sviluppo, rendendo difficili da eseguire test funzionali, screening genomici e saggi biochimici in vivo. Per superare queste limitazioni, sono stati sviluppati diversi metodi per modellare lo sviluppo CNCC in vitro. I metodi di coltura basati sulla neurosfera (NS) forniscono un microambiente complesso che ricapitola il neuroepitelio anteriore in via di sviluppo in 3D. Questi sistemi consentono la crescita di molte NS nella stessa piastra per generare una grande quantità di CNCC, ma le NS prodotte presentano un'elevata variabilità in termini di forma, dimensione e numero di CNCC formate, rendendo difficili da eseguire saggi quantitativi. Questo protocollo delinea un metodo riproducibile per generare NS da cellule staminali embrionali di topo (mESC) in un formato a 96 pozzetti. Le NS generate in piastre a 96 pozzetti producono cellule della cresta neurale cranica (CNCC), che possono essere ulteriormente coltivate. Controllando il numero di cellule iniziali, questo approccio riduce la variabilità delle dimensioni e della forma tra le NS e aumenta la riproducibilità tra gli esperimenti. Infine, questo sistema di coltura è adattabile a diverse applicazioni e offre un grado di flessibilità più elevato, rendendolo altamente personalizzabile e adatto al multiplexing di condizioni sperimentali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule della cresta neurale cranica (CNCC) sono una popolazione di cellule staminali che nasce nella parte più anteriore dell'embrione in via di sviluppo, al confine tra la placca neurale e l'ectodermadi superficie 1. Le CNCC subiscono quindi una transizione da epitelio a mesenchimale (EMT), si delaminano dal neuroepitelio e migrano dorsoventralmente verso varie posizioni nell'embrione dove si differenziano in un'ampia varietà di tipi di cellule2. Lo studio di questa popolazione cellulare è di grande interesse in quanto possiede una notevole plasticità3 e la capacità unica di differenziarsi sia in derivati ectodermici che mesenchimali, come le ossa craniofacciali e le cartilagini4. Sebbene le CNCC siano relativamente accessibili nell'embrione, si tratta di una popolazione transitoria con un basso numero di cellule, il che rende difficile condurre studi meccanicistici sistemici in vivo. Le linee cellulari CNCC sono state isolate e caratterizzate negli ultimi anni per superare queste limitazioni. In particolare, la linea cellulare O9-1 CNCC è un ottimo strumento per studiare lo sviluppo della cresta neurale migratoria e post-migratoria 5,6; Tuttavia, questa linea cellulare non consente lo studio degli eventi precoci prima della migrazione che portano all'induzione e alla specificazione della cresta neurale. A questo proposito, ci sono stati sviluppi significativi nello sviluppo di protocolli di differenziazione in vitro per differenziare la CNCC in un piatto attraverso l'uso di strutture 3D simili al neuroepitelio in via di sviluppo chiamate neurosfere (NS)7,8- ottenute dopo la differenziazione di colonie di cellule staminali embrionali (ESC). Questi protocolli 3D producono in modo robusto un numero elevato di CNCC, consentendo la conduzione di studi meccanicistici biochimici e genomici 9,10. Le NS sono coltivate su piastre a basso attacco in terreno integrato con N2B27, insieme al fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) e al fattore di crescita epidermico (EGF)10,11 per stimolare la proliferazione cellulare. Questi protocolli vengono eseguiti in piastre di Petri, coltivando numerosi NS nella stessa piastra. All'interno del NS in crescita, le cellule si aggregano e continuano a dividersi, raggiungendo un diametro di 100-200 μm alla maturità. Alla maturità (circa il giorno 5), le NS si attaccano al substrato e si differenziano in CNCC simile alle loro controparti in vivo 9,12. Questi CNCC vengono quindi sottoposti a EMT e delaminati sulla superficie della piastra. Le differenze morfologiche possono essere osservate a seconda delle dimensioni del NS, poiché le sfere più grandi appariranno più scure nel nucleo a causa della minore disponibilità di nutrienti e ossigeno, portando le cellule a subire l'apoptosi13. Sebbene questo tipo di procedura generi un gran numero di CNCC al punto finale di differenziamento, presenta diverse limitazioni, rendendo quasi impossibile lo studio delle varie dinamiche molecolari che avvengono durante il processo di differenziamento. In primo luogo, l'uso di colonie di cellule staminali embrionali, che variano in dimensioni, rende difficile controllare il numero di cellule iniziali per ogni esperimento. Ciò si traduce nella generazione di NS di varie forme e diametri che si sviluppano in modo diverso attivando specifiche vie di segnalazione, portando a un'alterata differenziazione cellulare e, quindi, non formando un campione uniforme in un dato momento temporale. In secondo luogo, la coltura di più NS nella stessa piastra spesso porta a fondere insieme14 e potenzialmente a rilasciare molecole di segnalazione che influenzano il microambiente dei loro vicini e, quindi, il loro sviluppo. Nel complesso, queste procedure generano molta variabilità tra campioni ed esperimenti.

Qui, presentiamo una strategia per superare queste difficoltà che genera un singolo NS - in grado di produrre CNCC - aggregando ESC di topo (mESC) in piastre a 96 pozzetti con fondo a U non trattate con TC. L'avvio della mESC consente di studiare il processo di specificazione e le prime fasi dello sviluppo della CNCC rispetto all'avvio da linee cellulari della cresta neurale già stabilite. Questo protocollo inizia con la disaggregazione delle colonie di mESC per ottenere una sospensione a singola cellula, seguita dalla semina di un numero specifico di mESC in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U non trattata con TC. Le celle vengono lasciate aggregare per due giorni e successivamente spostate in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC, in cui NS sarà in grado di attaccarsi al fondo della piastra. Controllando il numero di cellule iniziali e il microambiente di ciascuna NS durante il processo di differenziazione, questo protocollo riduce la variabilità del campione, aumentando la riproducibilità sperimentale. Riteniamo che questa sarà una piattaforma conveniente per la progettazione di esperimenti multiplexati, come testare l'effetto di diverse condizioni di coltura o eseguire screening di perturbazione genica.

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Protocollo

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1. Generazione di una sospensione unicellulare da colonie di ESC di topo

NOTA: Questo protocollo è adattato all'uso di CK35 mESC (una linea mESC competente per la trasmissione della linea germinale, per avere poi la possibilità di sviluppare modelli in vivo 15) coltivata su alimentatori inattivati in una piastra a 6 pozzetti trattata con TC rivestita di gelatina. Un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti trattata con TC dovrebbe produrre circa 1,5 × 106 mESC, che è sufficiente per il resto del protocollo. Se necessario, è possibile aumentarlo. Regolare le fasi iniziali in base al ceppo ESC scelto e al metodo di coltura di mantenimento, nonché al terreno di coltura appropriato. Questo protocollo deve essere eseguito in condizioni sterili. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo.

  1. Iniziare con mESC con una confluenza del 70%-80% coltivata in terreno di coltura mESC. Vedere la Tabella 1 per la composizione del terreno di coltura mESC utilizzata in questo studio.
    NOTA: Non lasciare che le mESC crescano oltre l'80% di confluenza, poiché inizieranno a differenziarsi e ciò influenzerà il processo di aggregazione. Le colonie devono essere compatte e presentare una morfologia sana (assenza di crepe o onde, contrasto nucleo-citoplasmatico distinto).
  2. Preparare il mezzo di differenziazione CNCC. Vedere la Tabella 1 per la composizione del mezzo di differenziazione CNCC.
    NOTA: Una volta aggiunti i fattori di crescita, il terreno può essere conservato per un massimo di 3 settimane a 4 °C. Assicurarsi che il mezzo sia protetto dalla luce.
  3. Preparare una soluzione fresca di collagenasi a una concentrazione di 2 mg/mL nel terreno DMEM-Knockout.
    NOTA: L'uso della collagenasi assicura che solo le colonie siano staccate e non gli alimentatori, poiché la loro presenza nei passaggi successivi interferirà con l'aggregazione delle NS. Filtrare la soluzione di collagenasi prima dell'uso con un filtro da 0,22 μm.
  4. Aspirare il terreno ESC da mESC.
  5. Aggiungere delicatamente 1 ml di PBS sul lato del pozzetto. Scuotere delicatamente la piastra per garantire un lavaggio uniforme.
  6. Rimuovere la PBS e sostituirla con 2 ml di soluzione di collagenasi. Incubare a 37 °C per 30-45 min.
    1. Controllare la lastra al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x dopo i primi 20 minuti e poi ogni 5 minuti.
    2. Quando le colonie mostrano i bordi arrotolati, picchiettare energicamente sul lato della piastra e le colonie si staccheranno.
  7. Con una pipetta sierologica da 5 mL, raccogliere le colonie e trasferirle in una provetta conica da 15 mL.
    NOTA: Controllare la piastra al microscopio ottico per verificare la presenza di colonie rimanenti. Questi possono essere raccolti con un lavaggio PBS.
  8. Centrifugare le colonie a 16 × g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
  9. Aspirare quanto più terreno possibile dal tubo conico, facendo attenzione a non disturbare le colonie sul fondo del tubo.
  10. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,05% e incubare la provetta a 37 °C per 5 minuti.
  11. Dissociare le colonie nel tubo pipettando energicamente su e giù, prima con una p1000 e poi con una micropipetta p200.
    NOTA: Ciò garantisce l'ottenimento di una sospensione a cella singola.
  12. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura mESC per bloccare la tripsina e centrifugare a 160 × g per 3 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione CNCC.
  13. Contare le cellule utilizzando un dispositivo di conteggio cellulare automatizzato o un sistema standardizzato al microscopio, seguendo le istruzioni del produttore.
  14. Dopo il conteggio, diluire con una quantità sufficiente di terreno di differenziazione CNCC per ottenere una concentrazione di 3000 cellule vive per 50 μL.
  15. Utilizzando una micropipetta p200, seminare 50 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U non trattata con TC, quindi rabboccare il pozzetto fino a 200 μl con mezzo di differenziazione CNCC.
    NOTA: Durante il riempimento della piastra, risospendere di tanto in tanto la sospensione a singola cellula con una micropipetta p1000 per ottenere una concentrazione omogenea.
  16. Incubare per una notte in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.

2. Trasferimento in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti per la differenziazione CNCC

  1. Il giorno successivo (giorno 1), osservare la lastra al microscopio ottico. Assicurati che un piccolo gruppo di celle con bordi chiari sia visibile sul fondo di ogni pozzetto. Rimetti la piastra nell'incubatrice per una notte.
    NOTA: Potrebbero esserci alcune celle attorno all'aggregato principale, alcune morte. Ciò non interferirà con l'aggregazione NS.
  2. Il giorno 2, rimuovere lentamente 100 μL di terreno da ciascun pozzetto.
    1. Quando si aspira il fluido, fare attenzione a non rimuovere l'NS. Per evitare di farlo, posizionare il puntale della pipetta vicino alla superficie e lontano dal fondo.
  3. Tagliare la punta di una micropipetta p200 a circa 3-4 mm dalla punta. Usalo per aspirare il NS con il terreno rimanente.
    NOTA: Per facilitare la raccolta dell'NS, pipettare delicatamente su e giù un paio di volte prima di aspirare.
  4. Trasferire NS e il terreno rimanente in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC e verificare il trasferimento al microscopio ottico, quindi riempire ogni nuovo pozzetto con 100 μl di terreno di differenziazione CNCC preriscaldato. Lasciare NS nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2, fino al giorno 4.
  5. Il giorno 4, rimuovere 100 μL di terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 100 μL di terreno di differenziazione CNCC preriscaldato.
    NOTA: Per evitare di disturbare l'attacco NS nella parte inferiore della piastra, aspirare lentamente e sostituire il fluido.
  6. Nei giorni 5 e 6, controllare l'attacco NS al microscopio ottico. Assicurarsi che le celle più leggere - delaminandosi dal NS - inizino a circondare il corpo principale del NS.
  7. Il giorno 7, cambiare il mezzo come descritto in 2.5. Cambiare il mezzo con la stessa procedura ogni 2 giorni fino al punto finale dello studio.

3. Passaggio e manutenzione CNCC

NOTA: Il passaggio CNCC può essere eseguito non appena è visibile una quantità sufficiente di celle intorno a NS. Questo può avvenire già dal giorno 7, poiché i punti temporali precedenti non forniscono una quantità sufficiente di CNCC.

  1. Preparare il mezzo di manutenzione CNCC. Vedere la Tabella 1 per la composizione del mezzo di manutenzione CNCC.
    1. Prima di aggiungerlo al terreno, filtrare il BSA dopo la solubilizzazione attraverso un filtro da 0,22 μm. Una volta aggiunti i fattori di crescita, conservare il terreno per un massimo di 3 settimane a 4 °C. Assicurarsi che il mezzo sia protetto dalla luce.
  2. Preparare la fibronectina a 7,5 μg/mL in PBS. Mescolate energicamente.
  3. Rivestire i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti non trattata con TC aggiungendo 100 μl di soluzione di fibronectina per pozzetto. Lasciare il cappotto sotto il cappuccio per 30 minuti a RT.
    NOTA: Se i CNCC sono destinati alla colorazione in immunofluorescenza, posizionare un vetrino coprioggetti in vetro sterile sul fondo del pozzetto prima del rivestimento. Assicurarsi che il vetrino rimanga sul fondo del pozzo e non galleggi per evitare di rivestire il lato opposto a quello che verrà utilizzato. Seguire le istruzioni nella sezione 5 per il fissaggio e il montaggio CNCC.
  4. Nel frattempo, nella piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC, aspirare quanto più mezzo di differenziazione CNCC possibile dai pozzetti e sostituirlo con 50 μL di accutasi. Incubare a 37 °C per 5 min.
  5. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 μl di terreno di mantenimento CNCC per pozzetto per estinguere l'accutasi. Rimuovere la fibronectina dai pozzetti della piastra ricevente a fondo piatto a 96 pozzetti non trattata con TC. Filtrare i CNCC post-migratori staccati facendoli passare attraverso un filtro da 40 μm sulla parte superiore della piastra ricevente a fondo piatto a 96 pozzetti non trattata con TC.
    NOTA: Questo filtrerà i grumi di cellule o le NS rimanenti che non sono state precedentemente rimosse. La CNCC coltivata nelle stesse condizioni può essere raggruppata in una provetta da 50 mL per essere poi seminata nello stesso pozzetto di una piastra a 6 pozzetti trattata con TC. In questo caso, rivestire il pozzetto con 1 mL di fibronectina e utilizzare 1 mL di terreno di mantenimento CNCC per spegnere l'accutasi.
  6. Lasciare attaccare il CNCC post-migratorio per 15-30 minuti a 37 °C. Eliminare il terreno e sostituirlo con 100 μL di mezzo di manutenzione CNCC. Cambiare il fluido ogni 2 giorni.
    NOTA: Aggiungere delicatamente il terreno poiché il flusso veloce induce la differenziazione della CNCC in derivati neurali. Se si lavora in un formato a 6 pozzetti, utilizzare 1 mL di terreno di manutenzione CNCC.

4. Fissazione e montaggio delle NS per l'immunofluorescenza

  1. Al momento desiderato, trasferire le NS dalla piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC in una provetta da 2 mL a basso legame di DNA tagliando la punta di una micropipetta p200 e pipettando delicatamente su e giù per prelevare le NS.
    NOTA: Nei momenti successivi (dal giorno 7 in poi), NS sarà abbastanza grande da essere visto ad occhio, ma sarà anche più difficile da staccare.
  2. Lasciare riposare NS nella provetta per 3 minuti a RT, rimuovere quanto più terreno possibile e risciacquare con 1 mL di PBS freddo.
    NOTA: Se si trasferisce un NS piccolo dai primi punti temporali (prima dei giorni 3-4), centrifugare a 16 × g per 3 minuti per assicurarsi che NS si stabilizzi sul fondo.
  3. Rimuovere il PBS e, in una cappa chimica, sostituirlo con 2 mL di PFA al 4% in PBS. Incubare per 20 minuti a RT.
    1. Capovolgere lentamente il tubo dopo aver aggiunto la soluzione di PFA al 4% e lasciarlo riposare durante il fissaggio laterale. L'obiettivo è quello di diffondere leggermente NS in modo che non si attacchino in questo passaggio.
  4. Rimuovere la soluzione di PFA al 4% (nella cappa chimica) e lavare NS con 1 mL di PBS freddo/0,5% Tween20. Lasciare riposare a RT per 3 min. Ripeti l'operazione 3 volte in totale.
    NOTA: NS si stabilirà in fondo.
  5. Rimuovere PBS/0,5% Tween20 e aggiungere 2 ml di PBS/0,1% Triton X-100. Capovolgere il tubo e lasciarlo riposare di lato. Incubare per 1 ora a RT.
  6. Lavare NS 3 volte in PBS freddo/0,5% Tween20, come indicato al punto 4.4.
  7. Rimuovere PBS/0,5% Tween20 e bloccare con 2% BSA in PBS a 4 °C per almeno 1 ora, preferibilmente durante la notte.
    NOTA: I campioni possono essere conservati in BSA/PBS al 2% per un massimo di 1 settimana a 4 °C. Proteggere dalla luce.
  8. Preparare la soluzione di anticorpi primari aggiungendo la corretta diluizione dell'anticorpo primario al 2% di BSA/PBS in un volume finale di 500 μL. Per la miscela di anticorpi primari utilizzata in questo studio, vedere la Tabella 2.
  9. Rimuovere la maggior parte possibile della soluzione bloccante e trasferire l'NS in una provetta da 0,5 mL tagliando la punta di una micropipetta p200.
  10. Aggiungere la soluzione di anticorpi primari e pipettare lentamente su e giù per risospendere l'NS. Incubare per una notte su un rotatore a 4 °C.
  11. Lavare NS 3 volte in PBS freddo per 5 minuti a RT.
  12. Preparare la soluzione di anticorpi secondari diluendo gli anticorpi secondari di scelta in BSA/PBS al 2% e aggiungendo 1/1000 DAPI. Per la miscela di anticorpi secondari utilizzata in questo studio, vedere la Tabella 2.
    NOTA: Tenere i tubi al riparo dalla luce.
  13. Sostituire il PBS con 500 μL di soluzione di anticorpi secondari e avvolgere la provetta con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce. Incubare per 1 ora sul rotatore a RT.
  14. Lavare NS 3 volte in PBS freddo, come indicato al punto 4.11.
  15. Rimuovere la maggior quantità possibile di PBS senza aspirare l'NS, sostituirla con 50 μl di agente chiarificante e seguire le istruzioni del produttore.
  16. Incubare per una notte a RT, al riparo dalla luce.
  17. Preparare le camere di montaggio.
    1. Su un vetrino da microscopio, posizionare tre strati di nastro biadesivo. Utilizzare nastro trasparente e privo di fibre per evitare residui nella camera di montaggio.
    2. Usando un rasoio, taglia una finestra di 3 mm × 8 mm nel doppio nastro.
      NOTA: Le dimensioni della camera dipendono dal punto di tempo del campione. Questo esempio è adatto per ospitare 50 μL di terreno di montaggio, che è ottimale per 10-20 singoli NS in punti temporali successivi (giorni 7-9).
  18. Sotto uno stereoscopio, trasferire con cautela l'NS nell'agente di pulizia nella camera di montaggio tagliando un puntale per micropipetta p200 a bassa aderenza. Utilizzare un ingrandimento compreso tra 2x e 4x per fornire un campo visivo dell'intera camera e un ingrandimento sufficiente per identificare l'NS. Se lo stereoscopio è attrezzato per l'imaging fluorescente, lavorare con un filtro a fluorescenza blu faciliterà l'identificazione della NS, poiché la colorazione DAPI farà risaltare la NS altrimenti trasparente.
    NOTA: Verificare che il mezzo formi un leggero menisco convesso sopra la camera. Ciò assicurerà che non ci siano bolle nella camera.
  19. Posizionare un vetrino coprioggetti sulla superficie e premere leggermente sui lati per farlo aderire. Eseguire questo passaggio sotto lo stereoscopio e verificare che i NS non vengano spinti fuori dalla camera.
  20. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'imaging.

5. Fissazione e montaggio CNCC per l'immunofluorescenza

  1. Rimuovere il mezzo di manutenzione CNCC dai pozzetti e lavarli con PBS. Aggiungere delicatamente il PBS pipettandolo sul lato del pozzetto.
  2. Procedere con la fissazione, la permeabilizzazione e la colorazione come descritto nei passaggi 4.3-4.14.
  3. Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino per microscopia aggiungendo un mezzo di montaggio sul vetrino, afferrando e ruotando il vetrino coprioggetti con l'uso di una pinzetta in modo che il CNCC post-migratorio sia rivolto verso il vetrino e posizionandolo sulla goccia.
    1. Opzionale: sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie o altri sistemi di sigillatura comunemente impiegati.
  4. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'imaging.

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Risultati

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Seguendo il protocollo, le colonie di mESC sono state dissociate e 3000 cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti con fondo a U non trattate con TC. Il giorno 2, le NS aggregate sono state trasferite in piastre a fondo piatto a 96 pozzetti non trattate con TC per consentirne l'adesione. Una visualizzazione semplificata del protocollo di aggregazione NS è fornita nella Figura 1A. Le NS sono state coltivate fino al giorno 9 e poi processate per la colorazione in immunofluorescenza. ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I modelli di differenziazione 3D in vitro consentono di analizzare interazioni cellulari complesse che potrebbero essere difficili - o non potrebbero - essere osservate in colture cellulari 2D. Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare lo sviluppo della CNCC in vitro. Questi sono generalmente derivati direttamente dalle colonie di ESC 7,21 o dagli espianti di tessuto22,23

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Remi Xavier Coux per i consigli sulla progettazione dei primer e l'esperienza nella coltura cellulare. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST) e dalla Fondation pour la Recherche Médicale (Amorçage - AJE202205015403).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 μ m filtri per siringheClearLine146560
15 mL Polipropilene ad alta trasparenza Tubo conicoFalcon352096
200 &; L ClearLine Plus Puntali con filtro a basso legameDutscher713263
40 &; m filtriFalcon352340
5 mL Pipetta sierologicaStarstedt86.1253.001
50 mL Polipropilene ad alta trasparenza Tubo conicoFalcon352070
AccutaseMerck-SigmaA6964
Alexa Fluor 488 asino anti coniglio IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21206
Alexa Fluor 594 asino anti topo IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21203
Alexa Fluor 647 asino anti capra IgG (H+L)Thermofisher ScientificA31571
Soluzione antibiotico-antimicotica Integratore Merck-SigmaA5955
B27 PLUSThermofisher Scientific17504044
Albumina sierica bovina (BSA)Merck-SigmaA9418
CloroformioCarlo Erba438601
Collagenasi di tipo IVThermofisher Scientific, Gibco17104019
Costar Piastre a pozzetti multipli trattate con TC a 6 pozzettiCorning3516
Occhiali di copertura, rotondiVWR  630-2113 
DMEM KnockOutThermofisher Scientific10829018
DMEM/F12+GlutamaxThermofisher Scientific10565018
DMEM ad alto glucosioMerck-SigmaD0822
DNA LoBind Provette da 2 mLEppendorf30108078
Acqua distillata senza DNasi/RNasiThermofisher Scientific10977-035
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermofisher Scientific14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0,5 mLEppendorf 30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mLEppendorf30120094
ESGRO mLIF Medium SupplementMerck-SigmaESG1107
Etanolo 70%Carlo Erba528170
Fetale Siero bovinoMerck-SigmaF7524
FibronectinaMerck-SigmaF085-2MG
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02
Soluzione di gelatinaMerck-SigmaES-006-B
GlutaMAXThermofisher Scientific35050061
Human EGFPeprotechAF-100-15-500UG
FGF umano-basicPeprotech100-18B
Anticorpo SOX9 umanoR& DsystemsAF3075
Insulina da pancreas bovinoMerck-SigmaI6634
iScript cDNA Synthesis KitBiorad1708891
Mouse Anti-Human AP-2 Alpha Monoclonal Antibody,DSHB3B5
Mouse Anti-Human PAX7, Integratore
Thermofisher Scientific17502048
Neurobasal MediumThermofisher Scientific 21103049
Piastra trattata con coltura non tissutale, 96 pozzetti,Falcon351172
Piastra trattata con coltura non tissutale, 96 pozzetti, Falcon con fondo a U351177
Soluzione di paraformaldeide al 16%,Microscopia elettronica15710
Propan-2-oloCarlo Erba415154
Purificato anti-Tubulina & beta; 3 (TUJ1) AnticorpoBiolegendMMS-435P
RapiClear 1.47Sunjin LabRC147001
RapiClear 1.52Sunjin LabRC152001
Scotch Biadesivo 12,7 mm e volte; 22,8 mNastro biadesivo trasparente senza fibre
Kit SensiFAST SYBR No-ROXMeridian BioscienceBIO-98020
Bisturi chirurgici monouso steriliSwann-Morton05XX
Superfrost Plus Vetrini per microscopio ad adesioneEprediaJ1800AMNZ
Triton X-100ThermofisherScientific A16046.
Reagente AP TRIzolFisherScientific15596026
Tripsina-EDTA (0,05%)Thermofisher Scientific25300054
Tween-20Fisher Scientific10113103
TWIST1 Rabbit mAb (formulato IF)Tecnologia di segnalazione cellulareE7E2G
β-mercaptoetanoloThermofisher Scientific
Anticorpo monoclonale non coniugato DSHB PAX7 N2 non coniugato a fondo piatto em grade 31350010

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. The molecular basis of neural crest axial identity. Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).
  2. Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-630 (2023).
  3. Zalc, A., et al. Reactivation of the pluripotency program precedes formation of the cranial neural crest. Science. 371 (6529), eabb4776(2021).
  4. Perera, S. N., Kerosuo, L. On the road again: Establishment and maintenance of stemness in the neural crest from embryo to adulthood. Stem Cells. 39 (1), 7-25 (2021).
  5. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. J Vis Exp. (140), e58346(2018).
  6. Ishii, M., Arias, A. C., Liu, L., Chen, Y. B., Bronner, M. E., Maxson, R. E. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells Dev. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Prescott, S., Brugmann, S. A., Swigut, T., Wysocka, J. Epigenomic annotation of enhancers predicts transcriptional regulators of human neural crest. Cell Stem Cell. 11 (5), 633-648 (2012).
  8. Cederquist, G. Y., et al. Specification of positional identity in forebrain organoids. Nat Biotechnol. 37 (4), 436-444 (2011).
  9. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  10. Prescott, S. L., et al. Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and chimp neural crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  11. Chaddah, R., Arntfield, M., Runciman, S., Clarke, L., van der Kooy, D. Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies. J Neurosci. 32 (23), 7771-7781 (2012).
  12. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  13. Sipahi, R., Zupanc, G. K. Stochastic cellular automata model of neurosphere growth: Roles of proliferative potential, contact inhibition, cell death, and phagocytosis. J Theor Biol. 445, 151-165 (2018).
  14. Mori, H., et al. Effect of neurosphere size on the growth rate of human neural stem/progenitor cells. J Neurosci Res. 84 (8), 1682-1691 (2006).
  15. Kress, C., Vandormael-Pournin, S., Baldacci, P., Cohen-Tannoudji, M., Babinet, C. Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell lines bearing the Omd conditional lethal mutation. Mamm Genome. 9 (12), 998-1001 (1998).
  16. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  17. Memberg, S. P., Hall, A. K. Dividing neuron precursors express neuron-specific tubulin. J Neurobiol. 27 (1), 26-43 (1995).
  18. Kim, C. N., Shin, D., Wang, A., Nowakowski, T. J. Spatiotemporal molecular dynamics of the developing human thalamus. Science. 382, eadf9941(2023).
  19. Grimaldi, A., Comai, G., Mella, S., Tajbakhsh, S. Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse. ELife. 11, e70235(2022).
  20. To, K., et al. A multiomic atlas of human early skeletal development. Nature. 635 (8039), 657-667 (2024).
  21. Bajpai, R., et al. Molecular stages of rapid and uniform neuralization of human embryonic stem cells. Cell Death Differ. 16 (6), 807-825 (2009).
  22. Kerosuo, L., Nie, S., Bajpai, R., Bronner, M. E. Crestospheres, Long-term maintenance of multipotent, premigratory neural crest stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 499-507 (2015).
  23. Abe, S., Yamaguchi, S., Sato, Y., Harada, K. Sphere-derived multipotent progenitor cells obtained from human oral mucosa are enriched in neural crest cells. Stem Cells Transl Med. 5 (1), 117-128 (2016).
  24. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  25. Ziegler, L., Grigoryan, S., Yang, I. H., Thakor, N. V., Goldstein, R. S. Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres. Stem Cell Rev Rep. 7 (2), 394-403 (2011).

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