Articolo metodologico

Analisi comparativa dell'analizzatore fecale automatico rispetto alla microscopia diretta a striscio umido per rilevare infezioni parassitarie in campioni di feci

DOI:

10.3791/67706

⸱

25 aprile 2025

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1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le infezioni parassitarie rappresentano una sfida significativa per la salute pubblica, specialmente nei paesi e nelle regioni in via di sviluppo. Questo studio confronta un analizzatore fecale automatico per valutarne l'efficacia diagnostica con quella del tradizionale metodo di microscopia diretta a striscio umido.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con lo sviluppo socio-economico, la prevalenza delle malattie parassitarie intestinali è diminuita significativamente di anno in anno. Tuttavia, le infezioni parassitarie rimangono un importante problema di salute pubblica a livello globale, in particolare nei paesi e nelle regioni in via di sviluppo. La diagnosi e il trattamento tempestivi sono fondamentali per controllare la diffusione di queste malattie. Il tradizionale metodo di microscopia diretta a umido, sebbene ampiamente utilizzato, è laborioso, soggetto a contaminazione e dipende dalle competenze del tecnico. Questo articolo introduce un analizzatore fecale automatico, che automatizza l'elaborazione del campione di feci, offrendo vantaggi rispetto al tradizionale metodo di microscopia diretta a striscio umido, come la facilità d'uso, il rilevamento rapido, un ambiente di lavoro pulito e igienico e un'elevata sensibilità e specificità, migliorando così l'efficienza e l'accuratezza diagnostica.

Abbiamo confrontato tre diversi metodi per l'analisi fecale: metodo di microscopia diretta a striscio umido, analizzatore fecale automatico (rapporto AI) e analizzatore fecale automatico (audit utente). Il rapporto AI utilizza l'analisi automatizzata delle immagini e gli algoritmi di apprendimento automatico per identificare componenti come parassiti e uova nei campioni fecali. Questo metodo è in grado di elaborare rapidamente un gran numero di campioni, aumentando l'efficienza. L'audit dell'utente utilizza anche un analizzatore fecale automatico, ma include una fase aggiuntiva di audit dell'utente. Tecnici esperti esaminano il rapporto AI per migliorare l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati. L'analizzatore ha dimostrato una sensibilità dell'84,31% per i report AI e del 94,12% per gli audit degli utenti, insieme a una specificità del 98,71% per i report AI e del 99,69% per gli audit degli utenti, rendendolo uno strumento prezioso per la diagnosi clinica e il trattamento delle infezioni parassitarie.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A livello globale, le malattie parassitarie intestinali persistono come un problema sostanziale di salute pubblica, prevalentemente nei paesi in via di sviluppo. I dati storici della Commissione per la salute e il benessere della Repubblica popolare cinese rivelano un netto calo dei tassi di infezione dal 62,63% nel 1992 al 5,96% nel 20151,2,3. Nonostante il suo drammatico declino1, con una prevalenza nazionale ponderata dello 0,47% e una stima di 5,98 milioni di individui infetti3, la prevalenza dell'infezione da Clonorchis sinensis nella popolazione del Guangdong rimane notevolmente alta al 4,90%4. Regioni specifiche come il Guangdong mostrano ancora tassi più elevati di infezione da C. sinensis, sottolineando la necessità di metodi diagnostici precisi.

La diagnosi delle malattie parassitarie può essere ottenuta attraverso l'esame microscopico, l'imaging medico, i metodi sierologici e molecolari. L'analisi sierologica mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è utile nella diagnosi di malattia parassitaria, ma la sensibilità è moderata, a circa l'80%5. Le tecniche diagnostiche di biologia molecolare hanno un'elevata sensibilità e specificità6, ma sono ostacolate da operazioni ingombranti e dispendiose in termini di tempo e da elevati costi di test, che le rendono inadatte per i test di routine su larga scala.

Il rilevamento di uova di C. sinensis nelle feci del paziente è la base per confermare la diagnosi. Il metodo Kato-Katz thick stick, che cerca le uova di C. sinensis, è il metodo classico comunemente usato per diagnosticare le malattie parassitarie7,8. Sebbene poco costoso, richiede molto tempo, è laborioso e non è adatto alla pratica clinica a fronte di un elevato volume di campioni da sottoporre a screening. La maggior parte degli ospedali primari attualmente utilizza il metodo della microscopia diretta a striscio umido. Tuttavia, questo metodo richiede ancora molto tempo e lavoro, con un odore fecale sgradevole ed è soggetto a contaminazione incrociata, elevati rischi di biosicurezza e risultati che dipendono dall'esperienza e dalla diligenza del personale addetto ai test9.

Le tecniche diagnostiche convenzionali, sebbene preziose, incontrano limitazioni in termini di sensibilità e praticità. Tuttavia, con i continui progressi della scienza e della tecnologia, i test fecali stanno diventando più automatizzati e standardizzati. Gli strumenti automatizzati che utilizzano metodi basati su immagini digitali per rilevare quantitativamente i parassiti o le uova di parassiti nelle feci stanno guadagnando popolarità nei laboratori clinici. Offrono vantaggi come la facilità d'uso, il rilevamento rapido, un ambiente di lavoro pulito e igienico e un'elevata sensibilità e specificità. L'analizzatore fecale automatico utilizza la tecnologia di imaging digitale per documentare le osservazioni microscopiche catturando una serie di fotografie digitali a basso e alto ingrandimento attraverso il microscopio e il suo sistema di imaging digitale integrato. Il sistema trasmette quindi queste immagini a un sistema informatico di elaborazione dati, che le identifica e le analizza di conseguenza. Recentemente, abbiamo tentato di diagnosticare uno spettro di infezioni parassitarie, concentrandoci sul rilevamento di parassiti e delle loro uova in campioni fecali. I campioni positivi sono identificati dalla presenza delle loro caratteristiche morfologiche. Abbiamo valutato l'analizzatore fecale automatico per rilevare i parassiti nei campioni fecali e abbiamo confermato il suo potenziale in aggiunta ai metodi di microscopia convenzionali. L'analizzatore fecale automatico è composto da un mainframe e da un software di accompagnamento dotato di diverse unità specializzate, tra cui un'unità di campionamento automatico, un'unità di campionamento della puntura, un'unità di osservazione delle caratteristiche e del colore del campione, un'unità telecamera e un'unità di scheda reagente (Figura 1).

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Figura 1: Componenti dello strumento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo studio, 2.305 campioni di feci fresche provenienti da pazienti ricoverati presso l'Ospedale del Popolo Provinciale del Guangdong nel luglio 2024 sono stati valutati in doppio cieco utilizzando l'analizzatore fecale automatico e il metodo della microscopia diretta a striscio umido (Figura 2). Un gruppo ha condotto test utilizzando un metodo di microscopia diretta a striscio umido, mentre l'altro ha utilizzato un analizzatore fecale automatico con un rapporto generato dall'intelligenza artificiale. Dopo aver documentato i risultati di ciascun gruppo, un terzo gruppo di sperimentatori ha esaminato manualmente le immagini catturate dall'analizzatore automatico. Hanno esaminato i parassiti o le uova sospette, le immagini che si discostavano dall'analisi automatica, le immagini sfocate o mancanti e quelle con sfondi complessi contenenti residui eccessivi. Questo processo comportava la correzione dei risultati, che venivano poi indicati come audit dell'utente dell'analizzatore fecale automatico. Alla fine, un quarto individuo ha riassunto e analizzato statisticamente i risultati. L'efficacia della strumentazione fecale completamente automatizzata è stata valutata attraverso un rilevamento in doppio cieco di parassiti/uova, confrontando il tempo di rilevamento e i risultati tra le tre metodologie.

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Figura 2: Illustrazione schematica del piano di ricerca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal Comitato di Revisione Etica dell'Ospedale Provinciale del Popolo del Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, Cina (Numero di approvazione: KY2024-445-02). Tutti i partecipanti hanno firmato un consenso informato scritto prima dell'arruolamento. I reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Raccolta di campioni

  1. Utilizza le provette per la raccolta dei campioni del produttore dell'analizzatore fecale automatico, assicurandoti che siano tappate, sigillabili, pulite, asciutte, prive di perdite e che abbiano un'apertura e un volume appropriati per il campionamento multipunto.
  2. Seleziona quanta più materia fecale fresca anormale possibile, contenente muco, pus o sangue, con una quantità target di circa 0,5 g. Quando le feci sono diluite o acquose, utilizzare una pipetta monouso per raccogliere il volume di campione necessario.
    NOTA: È necessario prestare attenzione per prevenire la contaminazione da tutti i campioni fecali non pazienti. Ciò include, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, feci di clisteri o lassativi a base di olio, campioni di padelle o servizi igienici, feci contaminate da piante, suolo, liquami, disinfettanti, detergenti, urine, sangue mestruale o leucorrea.

2. Metodi di test fecali

  1. Metodo di microscopia diretta a striscio umido10,11
    1. Applicare 1-2 gocce di soluzione salina su un vetrino da microscopio pulito.
    2. Prelevare un piccolo campione dall'area anormale o da più aree delle feci per lo smearing.
    3. Distribuire uniformemente il campione sul vetrino. Regola lo spessore della sbavatura per garantire la visibilità dei dettagli.
    4. Posizionare un vetrino coprioggetti sullo striscio, evitando bolle d'aria.
    5. Scansiona più di 10 campi visivi a basso ingrandimento (10x). Se vengono rilevate uova di parassiti o parassiti, passare all'ingrandimento elevato (40x) per un'osservazione morfologica dettagliata.
      NOTA: Si consiglia un esame a basso ingrandimento del carrello in una sequenza di "merlature" per ridurre al minimo il rischio di errori.
  2. Analizzatore Fecale Automatico (Figura 3)
    1. Accendere il computer e l'analizzatore, fare clic per avviare il software, inserire il nome utente e la password di accesso e attendere che lo strumento esegua un autocontrollo.
    2. Raccogliere le feci qualificate utilizzando l'apposita provetta per la raccolta dei campioni.
      NOTA: Le feci anormali fresche contenenti muco, pus o sangue del peso di circa 0,5 g sono il campione preferito.
    3. Posizionare la provetta di raccolta del campione nel supporto del campione dell'analizzatore, posizionare il rack del campione sull'ingresso automatico del campione e fare clic su Avvia per il primo test dopo l'autocontrollo.
      NOTA: I test successivi verranno rilevati ed eseguiti automaticamente dallo strumento. Il robot dello strumento fotograferà il campione per la documentazione.
    4. Aggiungere 5 mL di diluente alla provetta del campione, mescolare bene mediante miscelazione pneumatica e lasciare che il campione si depositi prima dell'analisi.
      NOTA: La provetta di raccolta dei campioni è rivestita con uno speciale filtro per rimuovere residui di non rilevanza patologica, come grandi quantità di fibre vegetali, semi e residui di cibo non digeriti.
    5. Lasciare che il campione fluisca nella cella di conteggio per l'analisi, dove l'analizzatore acquisirà immagini microscopiche ad alta risoluzione al microscopio e il software elaborerà e riconoscerà le immagini.
    6. Passa all'interfaccia dei risultati, controlla le immagini del test e invia il risultato al sistema di gestione delle informazioni di laboratorio (LIS) o stampale.
    7. Fare clic su Interrompi per terminare il test.
    8. Seleziona Svuota e spegni.
    9. Caricare la rastrelliera del liquido schiarente concentrato. Lo strumento si scaricherà e si spegnerà automaticamente.

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Figura 3: Flusso di lavoro del sistema di analisi fecale automatizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione metodologica

  1. Calcolo del tempo di rilevamento
    NOTA: I tempi di rilevamento sono stati calcolati registrando l'ora di inizio e di fine di ciascuna procedura di test. I risultati dei test sono stati confrontati analizzando la sensibilità e la specificità di ciascun metodo nel rilevare i parassiti.
    1. Metodo di microscopia diretta a striscio umido
      1. Per ogni campione fecale, misurare il tempo impiegato per raccogliere le feci delle dimensioni di un chicco di riso e distribuirle uniformemente su un vetrino.
      2. Misura il tempo impiegato per leggere i risultati per ogni partecipante.
      3. Aggiungi i tempi di tampone e lettura per ogni partecipante.
      4. Moltiplica la somma del passaggio 3.1.1.3 per il numero di partecipanti per ottenere il tempo totale del test per il metodo Direct Wet Smear Microscopy (T1).
      5. Dividere T1 dal passaggio 3.1.1.4 per il numero di campioni testati per ottenere il tempo medio di test per il metodo Direct Wet Strisci (t1).
    2. L'analizzatore fecale automatico (rapporto AI)
      NOTA: Il processo può essere eseguito da una sola persona.
      1. Misurare il tempo di test dell'analizzatore fecale automatico per ogni campione (T2).
      2. Dividi T2 per il numero di campioni testati per ottenere il tempo medio del test per l'analizzatore fecale automatico (AI Report) (t2).
    3. L'analizzatore fecale automatico (audit dell'utente)
      1. Misurare il tempo di test dell'analizzatore fecale automatico per ciascun campione (vedere il passaggio 3.1.2).
      2. Misurare il tempo di revisione manuale delle immagini per ogni campione. Avviare il timer (cronometro o timer digitale) non appena inizia la revisione delle immagini catturate dall'analizzatore fecale automatico da un campione. Esamina attentamente le immagini per identificare eventuali componenti o anomalie rilevanti. Arrestare il timer una volta completata la revisione per quel campione, annotare il tempo impiegato per ogni revisione del campione e inserire i dati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
      3. Aggiungi il tempo di test dell'analizzatore fecale automatico e il tempo di revisione manuale delle immagini per ogni campione.
      4. Moltiplicare la somma del passaggio 3.1.3.3 per il numero di partecipanti per ottenere il tempo totale del test per l'analizzatore fecale automatico (audit utente) (T3).
      5. Dividi T3 per il numero di campioni testati per ottenere il tempo medio di test per l'analizzatore fecale automatico (audit utente) (t3).
  2. Confronto dei risultati dei test
    NOTA: Le prestazioni del rapporto generato dall'intelligenza artificiale dell'analizzatore fecale automatico e i risultati dell'audit dell'utente sono stati valutati utilizzando il metodo dello striscio a umido diretto come punto di riferimento.
    1. Raccogli i risultati dal metodo di microscopia diretta a striscio umido, che fungerà da punto di riferimento.
    2. Raccogli i risultati dal report generato dall'intelligenza artificiale dell'analizzatore fecale automatico.
    3. Raccogli i risultati dell'audit utente dell'analizzatore fecale automatico.
  3. Calcola le metriche di valutazione.
    1. Considerare un campione come un vero positivo (TP) quando i risultati dell'analizzatore fecale automatico (rapporto AI o audit dell'utente) e il metodo di microscopia diretta a umido indicano entrambi la presenza dell'analita target.
    2. Considerare un campione come un Vero Negativo (TN) quando sia i risultati dell'analizzatore fecale automatico (rapporto AI o audit dell'utente) che il metodo della microscopia diretta a umido indicano l'assenza dell'analita target.
    3. Si considera un campione come falso positivo (FP) quando il rapporto AI o l'audit dell'utente dell'analizzatore fecale automatico indicano la presenza dell'analita target, ma il metodo Direct Wet Strisci Microscopy non ne conferma la presenza.
    4. Si considera un campione come falso negativo (FN) quando il rapporto AI o l'audit dell'utente dell'analizzatore fecale automatico indicano l'assenza dell'analita target, mentre il metodo di microscopia diretta a striscio umido ne rileva effettivamente la presenza.
    5. Calcolare la specificità come segue:
      Specificità= Veri Negativi (TN) / (Veri Negativi + Falsi Positivi)
    6. Calcolare la sensibilità come segue.
      Sensibilità= Veri Positivi (TP) / (Veri Positivi + Falsi Negativi)
    7. Calcolare il valore predittivo positivo (PPV) come segue:
      PPV = Veri positivi (TP) / (Veri positivi + Falsi positivi)
    8. Calcolare il valore predittivo negativo (VAN) come segue:
      NPV = Veri Negativi (TN) / (Veri Negativi + Falsi Negativi)
    9. Calcola il valore Kappa utilizzando un software statistico.
    10. Calcola il tasso di conformità come segue:
      Tasso di conformità = Accordi (sia l'intelligenza artificiale che il rapporto utente corrispondono al benchmark) / Campioni totali.
    11. Calcolare il tasso di rilevamento positivo come segue:
      Tasso di rilevamento positivo = Numero di positivi / Campioni totali.

4. Analizza i risultati

  1. Inserisci i dati in fogli di calcolo e analizzali statisticamente.
  2. Per i dati di conteggio, utilizzare i tassi e le proporzioni per la descrizione e confrontare i gruppi utilizzando il test del chi quadrato a quattro code accoppiato.
  3. Confronta i tempi medi di rilevamento tra i due metodi utilizzando il test T a campioni indipendenti.
  4. Valutare la coerenza nel rilevamento delle specie di parassiti tra le tecniche tramite l'accordo Kappa (κ).
  5. Considera P < 0,05 come statisticamente significativo.

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Risultati

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Confronto dei tempi di rilevamento tra i tre metodi di rilevamento
Il tempo medio di rilevamento è stato di 1,55 minuti per persona per campione per il metodo di microscopia diretta a striscio umido, 1,30 minuti per persona per campione per l'analizzatore fecale automatico (rapporto AI) e 1,47 minuti per persona per campione per l'analizzatore fecale automatico (audit dell'utente). Il metodo di microscopia diretta a striscio umido ha richiesto una durata 1,1 volte superiore rispetto all'analizzatore ...

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Discussione

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Le malattie parassitarie rappresentano un problema significativo per la salute pubblica globale12, in particolare nei paesi in via di sviluppo, dove portano a problemi di salute come malnutrizione, arresto della crescita, anemia e ostruzione biliare13, e sono anche collegate a uno sviluppo socio-economico e a un'istruzione inadeguati. I test fecali per i parassiti sono diventati una parte di routine della pratica clinica, con precisione, velocità ed efficienza come requisit...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (82002235, 82302571); Fondazione per la ricerca di base e applicata del Guangdong (2024A1515011037).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Software per analizzatore fecale automatico (FA280S)ORIENTERv.1.028(RecoV2.9.14)Il software del sistema di analizzatore fecale automatico (FA280S)
Fluido detergente concentratoORIENTERAdatto per la pulizia delle tubazioni
Copertura MARCAVELAProteggere il campione da danni e contaminazioni.
Cannuccia di plastica monousoNantong Lingke BiotechnologyCannuccia di plastica monouso utilizzata per l'aspirazione della soluzione fisiologica
salina FA280SORIENTERA022201035Analizzatore di feci completamente automatico
Fluido di lavaggioORIENTERQ/WWT-019-2021Tubazione di lavaggio dell'analizzatore di feci completamente automatico prodotto 
MicroscopioOLYMPUS3H51278Osservazione delle cellule
Vetrini perWS-7101Forniscono una superficie stabile e piana per montare i campioni per l'esame al microscopio.
Diluente del campioneORIENTERSichuan Rong Machinery 20150025Adatto per la diluizione di campioni di feci
Rack del campioneORIENTERRack di carico
Tubo del campioneORIENTERSichuan Rong Machinery 20200204Collettore fecale
Iniezione di cloeide di sodioGuangdong Daxiang Pharmaceutical Co.DiluizioneH14020786
Software statistico SPSSIBMSPSS Statistics 22.0Adatto per una varietà di attività di ricerca e analisi
Bastonedi legno Un bastoncino di legno monouso utilizzato per prelevare una quantità appropriata di campione fecale.
IN VETRO microscopio

Riferimenti

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