Quantificazione del comportamento di toelettatura di Drosophila melanogaster per la valutazione di fenotipi di toelettatura eccessivi

Summary

Il metodo qui presentato prevede l'annotazione manuale dei filmati acquisiti di Drosophila melanogaster per specifici comportamenti di toelettatura. Consente di quantificare sia il numero di attacchi di toelettatura che il tempo complessivo trascorso a toelettatura per valutare i fenotipi di auto-toelettatura atipici.

Abstract

I cambiamenti osservabili nella toelettatura stereotipata vengono applicati traslazionalmente negli organismi modello. Questi cambiamenti sono rappresentativi di patologie che suscitano deviazioni simili nel comportamento umano; ad esempio, l'eccessiva toelettatura agisce come proxy per comportamenti ossessivi e compulsivi presenti in condizioni come la sindrome di Tourette o il disturbo ossessivo-compulsivo. Il test di toelettatura presentato consente la valutazione di fenotipi anomali di auto-toelettatura in Drosophila melanogaster. Le mosche vengono registrate per un periodo di 10 minuti e queste registrazioni vengono osservate e annotate alla cieca per comportamenti di toelettatura precedentemente definiti. Le misure quantitative sia della frequenza degli incontri di toelettatura che del tempo trascorso a impegnarsi nell'auto-toelettatura possono essere ottenute annotando manualmente il filmato. Il test è relativamente economico, richiede pochi materiali che non siano già disponibili in ambienti di laboratorio ed è facilmente adattabile per soddisfare le esigenze specifiche di qualsiasi studio che mira a osservare la toelettatura. Inoltre, il basso livello di competenza necessario per eseguire il test, rispetto ai metodi automatizzati pesanti dell'informatica, rende il protocollo adatto a piccoli laboratori e studenti. Discutiamo in dettaglio i passaggi necessari per eseguire questo test e i suoi attuali limiti.

Introduction

La Drosophila melanogaster è un organismo modello ben consolidato negli studi comportamentali e neurobiologici, che fornisce informazioni sui meccanismi che guidano comportamenti umani analoghi. L'auto-toelettatura in questo organismo è un comportamento altamente regolato e ben definito, che segue schemi stereotipati che si distinguono facilmente l'uno dall'altro¹. I comportamenti di toelettatura separati esibiti dalla mosca possono generalmente essere classificati in base alla regione anatomica², più facilmente definita come posteriore o anteriore. La toelettatura della Drosophila si concentrerà inizialmente sulla regione anteriore e successivamente passerà all'estremità posteriore³. In condizioni tipiche, le mosche mostrano comportamenti di toelettatura per mantenere la pulizia (ad esempio, rimuovendo la polvere) e si verificano in risposta all'esposizione a stimoli esterni potenzialmente dannosi come i microbi patogeni⁴.

Le anomalie nel comportamento di toelettatura, in particolare la toelettatura ossessiva spontanea, sono state utilizzate in vari sistemi modello come indicatore di comportamento ossessivo e/o compulsivo. I risultati traslazionali che osservano comportamenti ossessivi di toelettatura in organismi come roditori, uccelli e cani hanno fornito informazioni sulle condizioni che suscitano comportamenti compulsivi simili negli esseri umani⁵. Questi includono condizioni come la tricotillomania, il disturbo ossessivo compulsivo e la sindrome di Tourette⁶. L'eccessivo comportamento di toelettatura è stato anche utilizzato come punto di riferimento nella valutazione dei fenotipi comportamentali in modelli di condizioni di sviluppo neurologico simili in Drosophila melanogaster. Comportamenti ossessivi di toelettatura sono stati osservati in modelli di mosca della sindrome dell'X fragile (FSX) e del disturbo dello spettro autistico (ASD) associato. L'eccesso di grooming spontaneo si verifica in presenza di mutazioni di dfmr1, l'ortologo del gene FMR1 associato all'ASD e FSX^. C'è inoltre un notevole cambiamento nella distribuzione della toelettatura tra le estremità posteriori e anteriori in questi mutanti⁸. Questi cambiamenti sono interpretati come il riflesso dei comportamenti ossessivi e compulsivi focalizzati sul corpo mostrati da alcuni pazienti con queste condizioni. Utilizzando il test di toelettatura qui descritto, abbiamo osservato comportamenti di toelettatura nei moscerini dopo un knockdown mediato da RNAi del gene Atg8a di Drosophila prodotto da driver GAL4 disponibili in commercio e linee UAS-RNAi⁹.

Questo metodo prevede l'annotazione manuale dei filmati ripresi dalle mosche per specifici comportamenti di toelettatura. Studi precedenti che mirano a valutare il comportamento di toelettatura, come quelli che utilizzano metodi indiretti come i coloranti, sebbene efficaci nel quantificare l'efficacia della toelettatura, non consentono di misurare la durata o la frequenza della toelettatura¹⁰. Questo test, tuttavia, consente di quantificare la frequenza e la durata della toelettatura della Drosophila , sia in generale che per regione anatomica. Il metodo qui descritto presenta alcuni vantaggi rispetto agli attuali metodi automatizzati, in quanto è facilmente modificabile e può essere condotto da individui privi di un background computazionale. Con l'attrezzatura richiesta, facilmente disponibile nella maggior parte dei laboratori, presentiamo un modo efficiente in termini di costi per valutare la presenza di un fenotipo auto-grooming eccessivo (vedi Tabella dei materiali). Ciò rende il metodo facilmente accessibile principalmente alle istituzioni universitarie e facilmente adattabile ad ambienti di formazione o laboratori didattici.

Protocol

NOTA: Nella Figura 1 viene presentata una panoramica del protocollo.

1. Preparazione per le riprese

1. Posizionare quattro piatti a tre pozzetti uno accanto all'altro su una superficie bianca, coprendo ciascuno con un vetrino.
2. Posiziona una fotocamera (qui, un sistema Raspberry Pi, ma qualsiasi fotocamera in grado di riprodurre video ad alta definizione è sufficiente) sopra i piatti.
   1. Verificare che tutti i piatti siano nell'inquadratura e a fuoco.
   2. Verificare che non vi siano riflessi sui vetrini che limiteranno la visibilità delle mosche nel piatto. Elimina l'abbagliamento regolando la posizione della piastra o attenuando le luci nello spazio di registrazione.
   3. Usa l'alta risoluzione (minimo 1920 x 1080 pixel) per visualizzare con precisione gli arti delle mosche.
3. Segna la posizione delle stoviglie e della telecamera sulla panca dove si sta svolgendo la registrazione.
   NOTA: Ciò limiterà il tempo impiegato per il passaggio 2 nell'uso futuro dell'apparecchio. L'esecuzione dei saggi nello stesso momento e nello stesso spazio limiterà la variabilità del comportamento in base a fattori che vanno oltre le manipolazioni intenzionali.
4. Anestetizzare leggermente le mosche di 4-9 giorni con il freddo su un blocco di ghiaccio coperto con parafilm e un tovagliolo di carta (l'anestesia con CO₂ avrà un impatto significativo sul comportamento).
   1. Picchiettare le mosche sul blocco e, una volta anestetizzate, spostare le mosche nelle camere di osservazione il più rapidamente possibile usando un pennello.
      NOTA: Questo trasferimento dovrebbe avvenire il più rapidamente possibile, poiché un'eccessiva esposizione all'anestesia di qualsiasi tipo può avere un impatto negativo sui moscerini.
5. Metti una singola mosca in ogni pozzo.
6. Consenti ai file di acclimatarsi al nuovo ambiente per 30 minuti dopo l'anestesia. Non toccare o disturbare i pozzetti contenenti mosche dopo questo punto, poiché ulteriori fattori di stress influenzeranno il comportamento.

2. Registrazione delle mosche

1. Dopo l'acclimatazione di 30 minuti, registra le mosche utilizzando una fotocamera.
2. Usa una fotocamera Raspberry Pi eseguita tramite PiSpy¹¹ per la raccolta dei dati comportamentali.
   NOTA: Il software è gratuito e disponibile su GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy) e un sistema Pi può essere facilmente configurato per meno di $ 300. Altre telecamere, se già disponibili, sono sufficienti per registrare filmati
3. Avvia una registrazione con Pi greco con il seguente flusso di comandi.
   1. Apri il terminale e digita cd PiSpy. Quindi, digita python3 PiSpy.py, inserisci la durata di registrazione desiderata e inserisci la frequenza fotogrammi desiderata. Selezionare la risoluzione desiderata e fare clic su Acquisizione rapida.
   2. Usa la funzione Anteprima fotocamera per assicurarti che le mosche siano a fuoco e sufficientemente visibili.
4. Registra le mosche per 10 minuti a una frequenza fotogrammi consigliata di 24 fps e salva il file (PiSpy salva automaticamente nella cartella dei video).

3. Analisi video (Figura 2)

1. Per analizzare il video, importare il file nel software Elan 6.8¹².
   NOTA: Questo software, sebbene originariamente sviluppato per il sego psicolinguistico per l'annotazione dettagliata dei video e l'analisi approfondita dei comportamenti di toelettatura
2. Assegna ogni riga come illustrato di seguito per annotare manualmente il metraggio delle persone.
   1. Eseguire questa operazione con il seguente flusso di comandi: Livello > Aggiungi nuovo livello > Digitare Posizione nel piatto in Nome livello > Aggiungi.
3. A seconda delle esigenze di uno studio, annotare e quantificare vari comportamenti specifici (toelettatura anteriore e posteriore, camminare, dormire e stare in piedi).
   1. Effettua annotazioni seguendo i passaggi seguenti.
      1. Fare doppio clic sul livello da annotare. Fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare il cursore lungo il livello selezionato per un periodo in cui viene mostrato un singolo attacco di toelettatura. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse, selezionare Nuova annotazione e fare doppio clic sul periodo di tempo appena evidenziato. Digitare l'abbreviazione del comportamento mostrato in quel momento.
   2. Osserva i video lentamente, scorrili con il mouse e annota. Ingrandisci un'area a mosche durante l'annotazione per evitare la falsa identificazione dei comportamenti. Questi potrebbero includere picchiettare il bordo del vetro con la mosca o spostare le gambe, che inizialmente potrebbe sembrare una toelettatura.
4. Una volta che il video è completamente annotato, ottieni una ripartizione di ciascun comportamento. Assicurati che la stessa abbreviazione o annotazione venga utilizzata in tutti i video per utilizzare questa funzione.
   NOTA: Elan 6.8 fornirà il numero di volte in cui si verifica un comportamento, la durata totale dei comportamenti e il tempo medio trascorso su ciascun comportamento.
   1. Definisci gli attacchi di toelettatura come 2 secondi di toelettatura ininterrotta. Identificare ogni comportamento osservato come segue. Definire i parametri per le regioni anatomiche prima della conduzione del test.
      1. Toelettatura anteriore: Identificare la toelettatura eseguita nella regione anteriore del corpo del moscerino come toelettatura anteriore.
         NOTA: Questo comportamento comporterà quasi sempre un movimento di sfregamento su una parte anteriore, come la testa o la proboscide, con le due zampe anteriori della mosca.
      2. Toelettatura posteriore: Identificare la toelettatura eseguita all'estremità antero-posteriore del corpo della mosca come toelettatura posteriore.
         NOTA: Inoltre, le ali sono state incluse nella regione posteriore per semplicità. Questo comportamento comporterà quasi sempre un movimento di sfregamento con la serie di zampe centrale e più posteriore al volo. Un buon indicatore che si sta verificando la toelettatura posteriore sarà che, a prima vista, la mosca potrebbe sembrare come se le mancassero le zampe più posteriori, come illustrato nella Figura 2D.

Results

Questo test produce dati quantitativi che misurano il tempo e la frequenza dei comportamenti di toelettatura da filmati annotati. Nella Figura 2 è illustrata un'immagine rappresentativa della configurazione e del modo in cui vengono definiti i comportamenti. Data la soggettività introdotta dall'analisi video, tutte le annotazioni dei video dovrebbero essere all'oscuro del ricercatore che esegue l'analisi.

Questo metodo è stato utilizzato per valutare il ruolo del ...

Discussion

Nel complesso, questo test, facilmente eseguibile ed economico, consente una solida caratterizzazione del comportamento di toelettatura di Drosophila melanogaster . Questa tecnica fornisce informazioni sulla frequenza, il tempo trascorso a impegnarsi e la distribuzione anatomica di un gran numero di comportamenti di toelettatura precedentemente identificati. Un buon indicatore che la toelettatura si verificherà o è in corso sono i cambiamenti nel posizionamento delle gambe, in p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scheda Micro SD da 16 GB	Adafruit	1294	Per l'uso nell'introduzione del sistema operativo
Display	Adafruit	3578	Qualsiasi display che può essere collegato tramite HDMI o cavo flessibile è sufficiente
Drosophila Atg8a-RNAi Linea UAS	Bloomington Stock Center	34340	Linea utilizzata nei dati rappresentativi
Drosophila Ok6 Driver	N/A	N/A	Linea utilizzata nei dati rappresentativi
Vetrini Fisher	Scientific	12-550-A3	Mantiene le mosche in contenimento
Dissipatori di calore	Adafruit		Previene il surriscaldamento del computer
Obiettivo	Adafruit	4563	Utilizzato solo con fotocamera HD
PiCamera	Adafruit	4561	La versione HD è stata utilizzata qui, ma una fotocamera standard può essere utilizzata con vincoli di budget
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	Computer PiSpy viene eseguito su
cavo Ribbion	Adafruit	1648	Per l'uso nel collegamento di componenti SB per fotocamera e display
Custodia	Adafruit	4301	Protegge il computer
Spot Plate	Fisher Scientific	S99406	Le versioni Pyrex erano già disponibili per il nostro uso, ma sono sufficienti anche piastre per colture cellulari o piastre spot in plastica
Treppiede	Best Buy	6355959	Per la sospensione e il posizionamento della fotocamera, qualsiasi apparecchio in grado di farlo è sufficiente
Alimentatore USB C	Adafruit	1995	Fornisce alimentazione al computer