Articolo metodologico

Determinazione di quattro componenti in un sistema di somministrazione di RNA di nanoparticelle lipidiche mediante cromatografia liquida combinata con rivelatore di diffusione della luce evaporativa

DOI:

10.3791/67711

⸱

30 maggio 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, stabiliamo un metodo di analisi quantitativa per quattro componenti in un sistema di somministrazione di RNA di nanoparticelle lipidiche (LNP) utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni combinata con un rivelatore di diffusione della luce evaporativa (ELSD). Il metodo ha una buona separazione, un'elevata sensibilità e un'elevata efficienza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un metodo per l'analisi dei componenti delle nanoparticelle lipidiche (LNP). L'LNP, che funge da vettore cardine per i farmaci a base di RNA, è costituito principalmente da colesterolo, PEG con modifiche, lipidi ionizzabili e lipidi helper. Questi componenti presentano una polarità debole, che porta a una forte ritenzione e difficoltà di separazione utilizzando la cromatografia in fase inversa, oltre a mancare di caratteristiche distinte di assorbimento dei raggi ultravioletti. Per affrontare questa sfida, un sistema di cromatografia liquida è stato accoppiato con un rivelatore a diffusione di luce evaporativa (ELSD). Regolando sistematicamente il tipo di colonna cromatografica e ottimizzando il programma di eluizione in gradiente della fase mobile, è stata ottenuta una separazione di base rapida e completa dei quattro componenti critici. L'utilizzo della più recente tecnologia ELSD ha migliorato significativamente la sensibilità di rilevamento e ampliato la gamma lineare del metodo. I risultati sperimentali hanno dimostrato che in un intervallo di concentrazione compreso tra 5 μg/mL e 250 μg/mL, i quattro componenti dell'LNP hanno mostrato un'eccellente linearità con coefficienti di correlazione tutti superiori a 0,999 e l'accuratezza variava dal 94,2% al 108,0%. Negli esperimenti di precisione, le deviazioni standard relative del tempo di ritenzione e dell'area di picco per una soluzione standard da 10 μg/mL erano inferiori allo 0,1% e al 2%, rispettivamente. Quando si utilizza questo metodo per analizzare diversi campioni di LNP, tutti i componenti vengono separati con successo e i rispettivi contenuti vengono quantificati accuratamente, evidenziando la robusta adattabilità di questo approccio analitico.

Introduzione

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La nanoparticella lipidica (LNP) è uno dei sistemi di consegna genica non virale più avanzati, utilizzato principalmente per la somministrazione di farmaci a base di acido nucleico, come oligonucleotidi antisenso, piccoli nucleotidi interferenti, mRNA, ecc. 1,2,3. L'LNP è generalmente composto da quattro componenti: lipidi ionizzabili, lipidi modificati con polietilenglicole (PEG), fosfolipidi e colesterolo. Il componente chiave sono i lipidi ionizzabili, che sono il fattore decisivo per l'efficienza della somministrazione di farmaci con acido nucleico. Gli altri tre componenti possono aumentare la stabilità dell'LNP e ridurre il riconoscimento del sistema immunitario 4,5,6.

I rapporti variabili dei quattro componenti nell'LNP possono avere un impatto significativo sul processo di autoassemblaggio delle nanoparticelle, influenzando proprietà come l'efficienza di incapsulamento dell'ingrediente farmaceutico attivo (API), la sua efficacia di somministrazione e il tasso di rilascio in vivo 7,8,9. Pertanto, è essenziale stabilire un metodo di analisi quantitativa per i componenti LNP, facilitando così la sintesi di un sistema di rilascio ottimale di LNP10,11.

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è una tecnica analitica contemporanea ampiamente impiegata nell'analisi farmaceutica ed è apprezzata per la sua elevata efficienza, sensibilità e capacità di automazione. L'HPLC comprende vari rivelatori, tra cui i rivelatori ultravioletti (UV) convenzionali, nonché rivelatori per uso generale come i rivelatori di indice di rifrazione (RID), i rivelatori di diffusione della luce evaporativa (ELSD), i rivelatori di aerosol caricati (CAD) e i rivelatori a radiofrequenza (RF) altamente selettivi, tra gli altri12.

Nel caso dell'analisi dei quattro componenti dell'LNP, che mancano di gruppi distinti che assorbono i raggi UV e quindi non producono alcuna risposta nei rivelatori UV, è stato preso in considerazione l'uso di rivelatori generici. Sebbene il RID sia una di queste opzioni, non è adatto per l'analisi del gradiente e offre una sensibilità relativamente inferiore rispetto agli altri due rivelatori generici; quindi, non è stato scelto12. Inoltre, sebbene i rivelatori CAD vantino un'elevata sensibilità, il loro costo proibitivo li rende meno attraenti12.

Di conseguenza, è stato scelto il rivelatore ELSD. Questo rivelatore è dotato di un'opzione distintiva della modalità di guadagno, la modalità "wide", che consente l'analisi simultanea di componenti ad alta concentrazione e in tracce, migliorando la sensibilità ed espandendo l'intervallo lineare.

Questo articolo utilizza un sistema HPLC accoppiato con ELSD, ottenendo una separazione efficiente e un'analisi quantitativa dei quattro componenti dell'LNP attraverso l'ottimizzazione delle colonne cromatografiche, l'eluizione in gradiente delle fasi mobili e altre condizioni13.

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Protocollo

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1. Preparazione dello strumento

  1. Configurazione dello strumento
    1. Configurare un sistema HPLC accoppiato a un ELSD.
  2. Installazione su colonna
    1. Installare la colonna cromatografica (C4-300; 150 mm × 4,6 mm I.D., 5 μm), seguendo la direzione della freccia sulla colonna, con un'estremità collegata all'uscita dell'autocampionatore e l'altra all'ingresso ELSD.
  3. Preparazione della fase mobile
    1. Preparare le fasi mobili: fase A, una soluzione acquosa TEAA da 10 mM (pH = 7,0) e fase B, una soluzione di metanolo TEAA da 10 mM (pH = 7,0).
    2. Per preparare la fase A, pesare accuratamente 1,01 g di trietilammina, scioglierla in 1000 ml di acqua, mescolare bene e regolare il pH a 7,0 con acido acetico.
    3. Per preparare la fase B, sciogliere 1,01 g di trietilammina in 1000 ml di metanolo, mescolare e regolare il pH a 7,0 con acido acetico.
  4. Modifica del metodo
    1. Accendere gli interruttori di alimentazione per ogni modulo dell'LC-ELSD e avviare il software LabSolutions . Quindi, apri la finestra Analisi in tempo reale .
    2. Fare clic su File e selezionare Nuovo per creare un nuovo file di metodo. Modificare il tempo di arresto LC nel metodo su 15 e fare clic su Applica a tutto il tempo di acquisizione.
    3. Quindi, fare clic su Pompa per modificare i parametri della pompa. Selezionare la modalità di analisi come Gradiente binario ad alta pressione (B.GE) e impostare la portata su 1,0 mL/min.
    4. Quindi, impostare la concentrazione iniziale della pompa B (%B) su 80% e modificare il gradiente di fase mobile: a 3 min, %B è 80%, a 4 min, %B è 85% da 5,5 min a 12 min, %B è 100%, a 12,1 min, %B ritorna all'80%.
    5. Successivamente, fai clic su Column Oven e imposta la temperatura del forno a 55 °C. Infine, fare clic su ELSD per modificare la temperatura del tubo di deriva a 40 °C. Salva il metodo.
      NOTA: Il riepilogo dei parametri è riportato nella Tabella 1.
  5. Avviare ed equilibrare lo strumento.
    1. Fare clic su Download e avvio per avviare ed equilibrare lo strumento.

2. Preparazione di soluzioni standard e campioni

  1. Preparazione di soluzioni standard
    1. Pesare con precisione 10,0 mg delle quattro sostanze standard che compongono l'LNP separatamente, sciogliere in 1 mL di metanolo e agitare fino a completa dissoluzione per ottenere soluzioni madre con una concentrazione di 10 mg/mL per ciascun componente.
    2. Utilizzando una pipetta, trasferire con precisione 100 μl di ciascuna delle quattro soluzioni madre in una fiala di campione, quindi aggiungere 600 μl di metanolo. Miscelare accuratamente per preparare una soluzione intermedia miscelata 1 con una concentrazione di 1000 μg/mL.
    3. Trasferire con precisione 20 μl di ciascuna delle quattro soluzioni madre in una fiala campione, quindi aggiungere 920 μl di metanolo. Miscelare accuratamente per preparare una soluzione intermedia miscelata 2 con una concentrazione di 200 μg/mL.
    4. Successivamente, preparare una serie di soluzioni standard a concentrazioni di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL e 250 μg/mL mediante diluizione seriale secondo la Tabella 2.
  2. Preparazione dei campioni
    1. Utilizzando una pipetta, trasferire accuratamente 100 μl di campione in una fiala di campione, quindi aggiungere 900 μl di metanolo e mescolare bene. A questo punto, assicurarsi che la concentrazione di LNP nel campione sia diluita di 10 volte e che l'LNP sia dissociato dal farmaco dell'acido nucleico.

3. Acquisizione dati

  1. Inserire le soluzioni standard e le soluzioni campione nell'autocampionatore del cromatografo liquido.
  2. Fare clic su Batch in tempo reale nella barra degli strumenti dell'assistente della finestra Analisi in tempo reale . Quindi, fare clic su Nuovo nel menu File per creare una nuova tabella batch.
  3. Nella tabella batch, inserire il Flaconcino#, il nome del vassoio, il file di dati e il volume di iniezione delle soluzioni standard e campione, quindi selezionare il file del metodo salvato nel passaggio 1.4. Fare clic su Salva file batch nel menu File per salvare il file batch.
  4. Attendere che la pressione del cromatografo liquido e la linea di base del cromatogramma siano stabili. Quindi, fai clic su Avvia batch in tempo reale nella barra degli strumenti dell'assistente per avviare l'acquisizione dei dati.

4. Analisi dei dati

  1. Stabilire le curve di calibrazione
    1. Apri la finestra del browser del software LabSolutions e trascina i dati della soluzione standard nella vista dei risultati quantitativi per stabilire una curva di calibrazione. Successivamente, modificare i parametri di elaborazione dei dati. Fare clic su Modifica nella vista Metodo.
    2. Nella finestra Parametri di integrazione , modificare il valore della pendenza in 10000. Quindi, nei Parametri di identificazione, modificare il metodo di identificazione in Banda e impostare la larghezza di banda predefinita su 0,1 min.
    3. Successivamente, modifica i parametri quantitativi. Modificare il metodo quantitativo in Standard esterno e impostare il # di Livello di calibrazione su 7. Selezionare il tipo di curva di calibrazione come Esponenziale. Quindi, modifica il composto.
    4. Inserire i nomi e le concentrazioni di soluzione standard dei quattro componenti LNP. Fare doppio clic sull'apice del picco per aggiornare i tempi di conservazione. Infine, fare clic su Visualizza per completare la modifica dei parametri di elaborazione dei dati.
    5. Modificare il tipo di campione nella vista Risultati quantitativi in Standard (punto di calcolo). In base alle concentrazioni, impostare i livelli della soluzione standard da 1 a 7. Una volta stabilite le curve di calibrazione, fare clic su File nella barra dei menu e salvare il file del metodo.
  2. Analisi quantitativa dei campioni
    1. Trascinare i dati dei campioni nella vista dei risultati quantitativi della finestra del browser, che visualizzerà i risultati della concentrazione dei quattro componenti LNP nei campioni.

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Risultati

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L'analisi della soluzione standard LNP utilizzando questo metodo ha raggiunto un grado di separazione maggiore di 1,5 per i quattro componenti, realizzando la separazione di base. Inoltre, non sono stati osservati residui nelle soluzioni standard ad alta concentrazione, come illustrato nella Figura 1. È stata stabilita una curva di calibrazione in un intervallo di concentrazione compreso tra 5 e 250 μg/mL, con coefficienti di correlazione tutti superiori a 0,999, indicando un ampio intervall...

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Discussione

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Tutti e quattro i componenti dell'LNP mostrano una polarità relativamente debole. Quando analizzati utilizzando una colonna C18, i composti target dimostrano una forte ritenzione all'interno della colonna, portando all'allargamento del picco dei fosfolipidi per i componenti fortemente trattenuti. Inoltre, dopo aver analizzato soluzioni ad alta concentrazione, si accumulano residui in testa alla colonna C18, che potrebbero compromettere l'accuratezza della quantificazione. Il cromatogramm...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo le aziende biofarmaceutiche per aver fornito i campioni di LNP per l'esperimento e ringraziamo Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd per aver fornito la colonna cromatografica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
BilanciaShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., LtdAP135W
ColonnaShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., LtdShimNex WP C4 (380-01235-74)
ELSDShimadzu (China) CO., LTDELSD-LT III (228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (China) CO., LTD
LCShimadzu (Cina) CO., LTDLC40D XR
MetanoloANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Pipetta-100 &; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-100
Pipetta-1000 & micro; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
Sistema di acqua ultrapuraMilliporeZIQ7000T0C
Vortex MixerANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

Riferimenti

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  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
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