Articolo metodologico

Visualizzazione delle dinamiche microbiche del ciclo del metano nelle zone umide costiere

DOI:

10.3791/67715

⸱

31 gennaio 2025

 ,  ,  , 
1School of Earth, Environmental and Marine Sciences, University of Texas - Rio Grande Valley

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo rileva i geni chiave del ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale e visualizza la loro distribuzione spaziale per migliorare la comprensione della regolazione del metano e dei suoi impatti ambientali in questi ecosistemi dinamici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le zone umide costiere sono la più grande fonte biotica di metano, dove i metanogeni convertono la materia organica in metano e i metanotrofi ossidano il metano, svolgendo così un ruolo fondamentale nella regolazione del ciclo del metano. Le zone umide del Texas meridionale, soggette a frequenti eventi meteorologici, livelli di salinità fluttuanti e attività antropiche dovute ai cambiamenti climatici, influenzano il ciclo del metano. Nonostante l'importanza ecologica di questi processi, il ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale rimane insufficientemente esplorato. Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato e ottimizzato un metodo per rilevare i geni correlati ai metanogeni e ai metanotrofi, tra cui mcrA come biomarcatore per i metanogeni e pmoA1, pmoA2 e mmoX come biomarcatori per i metanotrofi. Inoltre, questo studio mirava a visualizzare i modelli di distribuzione spaziale e temporale del metanogeno e dell'abbondanza di metanotropo utilizzando il software GIS (Geographic Information System) ArcGIS Pro. L'integrazione di queste tecniche molecolari con la visualizzazione geospaziale avanzata ha fornito informazioni critiche sulla distribuzione spaziale e temporale delle comunità di metanogeni e metanotrofi nelle zone umide del Texas meridionale. Pertanto, la metodologia stabilita in questo studio offre un solido quadro per mappare le dinamiche microbiche nelle zone umide, migliorando la nostra comprensione del ciclo del metano in condizioni ambientali variabili e supportando studi più ampi sui cambiamenti ecologici e ambientali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le zone umide costiere sono ecosistemi vitali che contribuiscono alla regolazione del clima, alla conservazione della biodiversità e alla gestione delle acque attraverso processi come il sequestro del carbonio, l'evapotraspirazione e le emissioni di metano (CH4)1. Questi ecosistemi, comprese le zone umide di acqua dolce e salata2, sono altamente produttivi e fungono da zone critiche per l'assorbimento di anidride carbonica (CO2) e catturano la materia organica dagli ambienti terrestri e marini 3,4. Le interazioni dinamiche all'interno di queste zone umide stimolano la produzione e il consumo microbico di CH4 5, posizionandole come una delle maggiori fonti naturali di CH46. Essendo il secondo gas serra più importante, il CH4 ha un potenziale di riscaldamento globale circa 27-30 volte superiore a quello del CO2 4,7,8,9, rendendo lo studio delle emissioni di CH 4 dalle zone umide costiere essenziale nell'era del cambiamento climatico. L'emissione di CH4 è influenzata da vari fattori ambientali, in particolare dalla salinità, che svolge un ruolo cruciale nei processi microbici10. Le zone umide d'acqua dolce contribuiscono in modo significativo al metano atmosferico a causa dei loro livelli di solfato più bassi, che facilita una maggiore produzione microbica di CH4, mentre le zone umide d'acqua salata tendono generalmente a emettere meno CH4 a causa di concentrazioni di solfato più elevate 11,12,13.

Le emissioni di CH4 dalle zone umide costiere sono generalmente controllate da due gruppi di microrganismi, noti come metanogeni e metanotrofi14. I metanogeni producono CH4 nei sedimenti anossici scomponendo substrati come formiato, acetato, idrogeno o composti metilati attraverso un processo noto come metanogenesi15. L'enzima importante in questa via è la metil-coenzima M reduttasi (MCR), in quanto catalizza la fase finale e limitante della metanogenesi 15,16,17. Il gene mcrA, che codifica per la subunità alfa di MCR, è un marcatore funzionale che può essere trovato in tutti gli archei metanogenici18. Inoltre, nelle zone umide costiere, la zona di transizione solfato-metano (SMTZ) si forma al di sopra della zona metanogenica, dove il metano che si diffonde verso l'alto e il solfato che si muove verso il basso convergono e si esauriscono19. All'interno di questa zona, gli archei metanotrofi anaerobici (ANME) ossidano il metano in anidride carbonica utilizzando l'enzima MCR, mentre i batteri solfato-riduttori (SRB) riducono il solfato in solfuro. Gli SRB superano i metanogeni per l'idrogeno e l'acetato, limitando la produzione di metano fino all'esaurimento del solfato16,17.

Al contrario, i batteri metanotrofici aerobici ossidano CH4 in ambienti aerobici20, utilizzando diverse forme di metano monoossigenasi (MMO). Questi includono il particolato metano monoossigenasi (pMMO), un enzima contenente rame incorporato nella membrana intracitoplasmatica, e la metano monoossigenasi solubile (sMMO), un enzima contenente ferro presente nel citoplasma. Tuttavia, per pMMO, ci sono tre operoni genici pmoCAB21; tra questi, il gene pmoA è il più conservativo per tutti i metanotrofi. Esistono due diversi geni biomarcatori per pmoA: pmoA1 e pmoA222. Inoltre, per una comprensione completa dei metanotrofi, il gene mmoX viene utilizzato come strumento in biologia molecolare per identificare i metanotrofi23 contenenti sMMO. Questa distinzione nelle vie metaboliche e nei requisiti ambientali dei metanogeni e dei metanotrofi aerobici evidenzia le complesse interazioni microbiche che regolano il ciclo del metano negli ecosistemi delle zone umide costiere.

La zona umida di Boca Chica (BC), un ambiente produttivo di acqua salata nel sud del Texas, subisce influenze di marea dal Golfo del Messico (GOM), portando a livelli di salinità superficiale variabili, soprattutto a causa della sua vicinanza alla Laguna Madre24 ipersalina. Questa azione di marea, alternata tra alte e basse maree, provoca fluttuazioni dei livelli di ossigeno25 che potrebbero alterare l'attività del metanogeno e del metanotrofio nei sedimenti26. Al contrario, le zone umide costiere d'acqua dolce sono considerate un hotspot significativo per i flussi CH4 27. Le zone umide costiere d'acqua dolce nel sud del Texas, tra cui Resaca Del Rancho Viejo (RV) e Lozano Banco (LB), distanti dagli effetti delle maree del GOM, hanno una gestione idrologica distinta. RV sperimenta flussi di impulsi integrati dall'acqua del fiume durante i bassi livelli dell'acqua, mentre LB funziona come un sistema di flusso offline senza tale integrazione. Inoltre, RV e LB mantengono livelli di salinità più bassi a causa di un elevato scarico di acqua dolce pompata artificialmente e del fatto di essere un lago oxbow. I diversi fattori ambientali possono influenzare in modo significativo il ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale. Tuttavia, il ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale rimane un'area che deve ancora essere indagata a fondo.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) e la PCR in tempo reale (chiamata anche PCR quantitativa [qPCR]) rappresentano tecniche fondamentali e ampiamente utilizzate per rilevare e quantificare l'abbondanza relativa di geni specifici in campioni ambientali. Queste tecniche amplificano specificamente regioni mirate del DNA per indicare la presenza e la quantità relativa di geni correlati al ciclo CH4, fornendo indicatori del potenziale ciclo del metano. Tuttavia, la disponibilità e l'efficacia dei set di primer per PCR potrebbero essere limitate da vari fattori inibitori nel DNA ambientale estratto, essendo influenzati dai tipi di ambienti28,29. Pertanto, questo studio ha stabilito principalmente un metodo PCR ottimale per rilevare la presenza di geni correlati al ciclo CH4 nelle zone umide costiere del Texas meridionale (Figura 1) e quindi ha visualizzato la loro abbondanza relativa quantificata in questi ecosistemi. I risultati di questo studio possono essere applicati ad altre regioni costiere per migliorare la comprensione del ciclo CH4 e delle dinamiche microbiche in diversi ecosistemi costieri.

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Protocollo

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1. Raccolta dei campioni

  1. Raccogli campioni di sedimenti utilizzando un campionatore a pinza per sedimenti o una pala.
    NOTA: I campioni sono stati raccolti da due stazioni di tre distinte zone umide costiere durante le stagioni fresche (ottobre-febbraio, la temperatura media è di 20 °C) e calde (aprile-giugno, la temperatura media è di 27 °C) del 2023 e del 2024. Un campionatore di sedimenti è stato utilizzato quando i campioni sono stati raccolti dalle zone umide costiere d'acqua dolce (Figura 2) e una pala è stata utilizzata per le zone umide costiere di acqua salata influenzate dalle maree.
  2. Abbassare prima il campionatore nel corpo idrico poco profondo e lasciarlo affondare sulla superficie del sedimento (entro i primi 50 cm) sotto il suo stesso peso, riducendo al minimo il disturbo alla struttura del sedimento, come mostrato nella Figura 2.
  3. Estrarlo dalla colonna d'acqua, dove la profondità era tipicamente compresa tra 60 cm e 215 cme 30, trasferire i campioni di sedimento in sacchetti con chiusura a zip e conservarli immediatamente in una ghiacciaia.
    NOTA: Pulire e lavare il campionatore a benna con acqua deionizzata (DI) prima di procedere alle stazioni successive.
  4. Conservare immediatamente tutti i campioni a -20 °C in laboratorio.
  5. In ogni sito di campionamento, misurare i parametri di qualità delle acque superficiali come la salinità e la temperatura in situ utilizzando un misuratore di qualità dell'acqua multiparametrico.
    NOTA: Le sonde sono state risciacquate con acqua deionizzata (acqua deionizzata) dopo l'uso in ciascuna stazione.

2. Estrazione del DNA genomico

  1. Scongelare i campioni a temperatura ambiente prima di iniziare la procedura per l'estrazione del DNA genomico.
  2. Trasferire circa 500 mg di campioni di sedimento in una provetta da 15 ml e centrifugare a 4.250 × g per 3 minuti per rimuovere tutta l'acqua.
  3. Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di estrazione del DNA per il terreno seguendo il protocollo31 del produttore con una piccola modifica e conservare immediatamente a -20 °C.
    NOTA: le modifiche sono state apportate per ridurre la ridondanza e rendere efficiente il flusso di lavoro.
    1. Aggiungere fino a 500 mg di campione di terreno in una provetta contenente perle di vetro/sfere di ceramica.
    2. Aggiungere 978 μl di tampone fosfato di sodio al campione nella provetta contenente il microsfera/sfera.
    3. Aggiungere 122 μl di soluzione tampone di lisi al campione nella provetta contenente il microsfone/sfera per solubilizzare i contaminanti esterni.
    4. Omogeneizzare con un omogeneizzatore a 5 volte il livello di velocità per 20 s e ripetere 2 volte.
      NOTA: In questo studio è stato utilizzato un omogeneizzatore per macina perline, motivo per cui la velocità è stata regolata.
    5. Centrifugare il composto per 10 minuti a 14.000 × g.
    6. Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga da 2,0 mL pulita.
    7. Aggiungere 250 μl di soluzione di precipitazione proteica (PPS) per separare gli acidi nucleici solubilizzati dai detriti cellulari e dalla matrice lisizzante. Mescolare capovolgendo il tubo 10 volte.
    8. Centrifugare a 14.000 × g per 5 min per far precipitare il pellet, rimuovendo i detriti cellulari e la matrice lisiante.
    9. Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulita da 15 mL.
    10. Aggiungere 1,0 mL della sospensione Binding Matrix al surnatante nella provetta da 15 mL.
      NOTA: Agitare la sospensione Binding Matrix per risospendere prima di aggiungerla.
    11. Consentire il legame del DNA alla matrice di legame posizionando le provette su un rotatore per 2 minuti.
    12. Posizionare tutte le provette su un rack e incubare per 3 minuti per consentire la sedimentazione della matrice legante.
    13. Dopo 3 minuti, scartare 750 μl e mescolare delicatamente il surnatante rimanente con il pellet utilizzando una pipetta.
    14. Trasferire 750 μl della miscela in un filtro SPIN e centrifugare a 14.000 × g per 1 minuto. Svuotare il tubo di raccolta e riutilizzarlo. Ripetere con il composto rimanente.
    15. Aggiungere 500 μl della soluzione di lavaggio preparata (con l'aggiunta della quantità appropriata di etanolo) per solubilizzare ulteriormente le impurità. Risospendere delicatamente il pellet utilizzando la forza del liquido dalla punta della pipetta.
    16. Centrifugare a 14.000 × g per 1 minuto per rimuovere le impurità. Svuotare il tubo di raccolta e riutilizzarlo.
    17. Centrifugare nuovamente a 14.000 × g per 2 minuti senza aggiungere nulla.
    18. Sostituire il tubo di raccolta con un tubo di raccolta nuovo e pulito e asciugare all'aria il filtro centrifugo per 5 minuti a temperatura ambiente.
    19. Aggiungere 50 μL di acqua priva di DNAsi (DES) e centrifugare a 14.000 × g per 1 minuto.
      NOTA: In questo protocollo, 50 μL di DES sono stati utilizzati per l'eluizione del DNA per garantire un recupero e una stabilità ottimali del DNA ambientale estratto (eDNA).

3. Quantificazione del DNA

  1. Aggiungere 1 μl di DNA estratto con 200 μl di colorante fluorescente in una provetta da 0,5 mL e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.
  2. Avvolgere immediatamente la provetta con un foglio di alluminio in modo che la luce non possa penetrare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  3. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro in modalità di concentrazione del DNA ONE seguendo il protocollo del produttore.

4. Rilevamento di 16S rRNA, pmoA1 , pmoA2 , mmoX e mcrA mediante PCR convenzionale

  1. Prima di eseguire la PCR convenzionale (cPCR), scongelare tutti i campioni e i reagenti in un secchiello per il ghiaccio.
  2. Diluire tutti i campioni di eDNA estratti a 10 ng/μL.
    NOTA: Un elenco di inneschi è riportato nella Tabella 1.
  3. Preparare una miscela di reazione cPCR da 25 μl per ciascun campione, inclusi 12,5 μl di 2x PCR Master mix, 0,5 μl di primer diretti e inversi (10 μM) (vedere la Tabella 1 per l'elenco dei primer), 1 μl di eDNA da 10 ng/μl e 10,5 μl di acqua priva di nucleasi.
    NOTA: Preparare la miscela master con un volume sufficiente per un campione aggiuntivo per ridurre al minimo gli errori di pipettaggio.
  4. Eseguire la reazione di cPCR seguendo il protocollo che consiste in una denaturazione iniziale a 95 °C per 2 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 45 s, estensione a 72 °C per 30 s e estensione finale a 72 °C per 5 m, con temperatura di ricottura variabile per diversi primer (vedere la Tabella 1 per le temperature di ricottura di diversi primer utilizzati per diversi geni).
    NOTA: Per il gene mcrA , i primer ML hanno mostrato la banda desiderata utilizzando una velocità di rampa lenta di 0,1 °C/s tra le fasi di ricottura ed estensione per i primi cinque cicli32.
  5. Visualizza i prodotti cPCR in un gel di agarosio prestato con bromuro di etidio (EtBr).
    NOTA: Utilizzare gel di agarosio al 2,5% per una scala da 50 bp e gel allo 0,9% per una scala da 1 kb. Utilizzare 1x tampone TAE per un gel di agarosio al 2,5% e 0.5x tampone TAE per un gel di agarosio allo 0.9%.

5. Rilevamento di pmoA1 , pmoA2 , mmoX e mcrA mediante PCR quantitativa in tempo reale

NOTA: I geni mirati al metanogeno e al metanotrofio come l'abbondanza di pmoA1, pmoA2, mmoX e mcrA sono stati osservati mediante qPCR utilizzando un sistema di PCR in tempo reale.

  1. Preparare gli standard per ciascun gene separatamente per ottenere la curva standard per ciascun gene.
    1. Amplificare il gene bersaglio con la cPCR, utilizzando i campioni che hanno prodotto la banda più luminosa durante l'elettroforesi su gel di ciascun gene. Seguire il metodo e i primer descritti nel paragrafo 4.
    2. Purificare i prodotti amplificati utilizzando un kit di estrazione su gel e misurare la concentrazione di DNA seguendo il metodo descritto nella sezione 3 e conservare a -20 °C.
      NOTA: Aliquotare gli standard purificati in provette separate per un ulteriore utilizzo.
    3. Calcola le copie dei geni dalla concentrazione di DNA misurata utilizzando il sito Web di calcolo del numero di copie per la qPCR.
    4. Diluire il numero di copie calcolato dello standard con acqua priva di nucleasi per preparare ogni standard, da 108 a 102 copie/μL, prima di eseguire la qPCR.
    5. Preparare la curva standard utilizzando tre repliche di ciascun numero di copie, incluso un controllo negativo (NTC, senza DNA stampo).
      NOTA: Il valore R2 di ciascuna curva standard era maggiore di 0,99.
  2. Preparare una miscela di reazione qPCR da 20 μl per tutti i campioni, gli standard e le NTC. Eseguire l'analisi qPCR in triplicati per tutti i campioni.
    1. Posizionare tutti i componenti della reazione, tra cui la master mix qPCR, i primer, l'acqua priva di nucleasi, gli standard e i campioni, su una griglia per il ghiaccio prima di iniziare.
    2. Preparare una miscela di reazione qPCR da 20 μl per ciascun campione, standard e NTC, contenente 10 μl di master mix SYBR Green, 0,5 μl di ogni primer diretto e inverso da 10 μM, 8 μl di acqua priva di nucleasi e 1 μl di DNA stampo da 10 ng/μl o acqua standard o ID, rispettivamente.
      NOTA: Utilizzare i set di primer che hanno dimostrato di produrre risultati ottimali per i geni pmoA1 e mcrA nella PCR convenzionale per qPCR (vedere la Tabella 1). Per migliorare l'accuratezza, eseguire ogni campione in triplice copia. I passaggi seguenti forniscono un metodo efficiente per la preparazione di campioni triplicati con un volume combinato di 60 μl per campione.
      1. Preparare la miscela di reazione per combinare la miscela master, i primer diretti e inversi per il gene specifico e l'acqua priva di nucleasi in una provetta da 2 mL, ad eccezione del DNA stampo.
        NOTA: Preparare il volume della miscela di reazione tenendo conto dell'errore di pipettaggio. Ad esempio, se sono presenti 24 campioni e 8 standard, calcolare il volume totale per 33 reazioni anziché 32 reazioni per ridurre al minimo gli errori di pipettaggio. In questo caso, il volume totale richiesto per le reazioni triplicate sarebbe il seguente: 990 μL di master mix (33 campioni x 3 repliche x 10 μL), 49,5 μL di primer diretti (33 campioni x 3 repliche x 0,5 μL), 49,5 μL di primer inversi (33 campioni x 3 repliche x 0,5 μL) e 792 μL di acqua priva di nucleasi (33 campioni x 3 repliche x 8 μL).
      2. Preparare le provette per PCR in base al numero di campioni e agli standard.
      3. Erogare 57 μl della miscela di reazione preparata in ciascuna provetta per PCR.
        NOTA: Per eseguire la qPCR per ciascun campione in triplicato, preparare un volume totale di miscela di reazione di 57 μl per campione (escluso DNA stampo, standard o acqua). Questo volume sarà diviso equamente in tre pozzetti per un campione, con 19 μl assegnati a ciascun pozzetto.
      4. Aggiungere 3 μL di DNA stampo, acqua standard o priva di nucleasi a ciascuna provetta e mescolare picchiettando delicatamente il fondo della provetta.
        NOTA: Il volume totale della miscela di reazione preparata per un campione sarebbe di 60 μl in ciascuna provetta.
    3. Aliquotare 20 μl della miscela di reazione preparata da ciascuna provetta nei pozzetti designati di una piastra qPCR a 96 pozzetti. Sigillare la piastra PCR con una pellicola sigillante PCR adesiva utilizzando un applicatore.
    4. Centrifugare la piastra sigillata a 1.000 × g per 1 minuto per garantire una miscelazione corretta per eliminare eventuali bolle all'interno dei pozzetti.
  3. Posizionare la piastra PCR nel termociclatore. Accendere la macchina qPCR e quindi aprire il software correlato per impostare il protocollo.
    1. Impostare il protocollo in base alle linee guida della miscela master qPCR. Utilizzare il seguente protocollo: 95 °C per 10 minuti, seguiti da 95 °C per 15 s e un passo di estensione a 72 °C per 30 s. Eseguire la fase di ricottura alla temperatura di ricottura specificata per i relativi inneschi nella Tabella 1 per 45 s. Condurre tutte le esecuzioni di qPCR per 35 cicli.
    2. Impostare la piastra qPCR a 96 pozzetti con standard e NTC nella stessa configurazione della piastra contenente il campione.
  4. Utilizzare il metodo della curva standard di quantificazione assoluta per quantificare il prodotto amplificato e il numero di copie geniche in ciascun campione33.

6. Visualizzazione dei geni del ciclo del metano nella mappa delle zone umide costiere del Texas meridionale

  1. Aprire il software GIS (Geographic Information System) ArcGIS Pro e salvare il file di progetto con il nome Area di studio nella cartella specificata sul computer.
  2. Clicca su Mappa in alto a sinistra | Mappa di base e selezionare Terreno con etichette come mappa di base.
  3. Fare clic su Localizza | Cerca e quando si apre la barra di ricerca, individua l'area di studio digitando il nome dell'area; L'area verrà visualizzata.
  4. Disegna l'area specifica utilizzando la georeferenziazione.
    1. Clicca su Visualizza | Riquadro del catalogo dal livello superiore.
    2. Fare doppio clic su Cartella dal catalogo | Nome file.
    3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file del geodatabase (.gdb) e quindi fare clic su Nuovo | Verranno visualizzati Classe entità geografiche e Crea classe di entità geografiche .
    4. Digitare la casella Nome e alias e fare clic su Fine in basso.
    5. Clicca su Visualizza | Contenuto. Il nome dell'alias verrà visualizzato nel riquadro dei contenuti.
    6. Fare clic su Modifica dal livello superiore | Creare. Verrà visualizzato il riquadro Crea funzionalità . Fare doppio clic sul riquadro Alias in Crea funzionalità per visualizzare Configura opzioni di feedback utensile .
    7. Seleziona Linee, quindi disegna le linee sulla mappa per creare un confine esterno dell'area di studio. Al termine, fai doppio clic sulla mappa.
  5. Riduci a icona il software GIS, quindi apri un foglio di calcolo. Digitare il nome del campione nella prima colonna, immettere la latitudine nella seconda colonna e la longitudine nella terza colonna. Utilizzare le quattro colonne successive per i dati qPCR di pmoA1, pmoA2, mmoX e mcrA.
  6. Salvare il file in formato CSV in una cartella specifica del computer.
  7. Aprire nuovamente il software GIS e fare clic su Aggiungi dati | Dati punto XY.
  8. Selezionare il file CSV dalla cartella del computer nella casella Tabella di input . Rinominare il nome del file nella classe di entità geografiche di output, quindi fare clic su Esegui per visualizzare i punti di campionamento sulla mappa.
  9. Clicca sulbarra di ricerca in alto e cerca Kriging.
  10. Selezionare il file della stazione di campionamento, quindi selezionare pmoA1.
  11. Fare clic sul pulsante Ambiente | selezionare la stazione di campionamento in layer e maschera | fare clic su Esegui.
  12. Seguire i protocolli menzionati nei passaggi 6.9, 6.10 e 6.11 per creare Kriging per pmoA2, mmoX e mcrA per tutta l'area di studio.
  13. Creare un layout della mappa.
    1. Fare clic su Inserisci dal livello superiore | Nuovo layout e selezionare ANSI - Orizzontale.
    2. Fare clic su Cornice mappa, selezionare la mappa con il Kriging e posizionare tutte le mappe nel layout disegnando un rettangolo. In questo modo la mappa sarà visibile nel layout.
    3. Seleziona la freccia nord e posizionala nel layout per indicare la direzione nord.
    4. Selezionare Barra scala per visualizzare la scala dell'area sulla mappa.
    5. Fare clic su Legenda per visualizzare le legende, quindi posizionarla nel layout.
    6. Fare clic su Griglia e selezionare una delle opzioni del reticolo nero. In questo modo verrà creata la griglia con latitudine e longitudine e visualizzata nel riquadro dei contenuti con l'etichetta Reticolo dell'etichetta orizzontale nera.
    7. Fare doppio clic su Reticolo orizzontale nero dell'etichetta, quindi selezionare Componenti. Fare clic su Ticks 1 e Grid e rimuovere questi componenti facendo clic sul segno di croce alla loro destra.
  14. Fai clic su Condividi dal livello superiore, quindi fai clic su Esporta layout. Selezionare il tipo di file come PDF, salvare il file sul computer utilizzando la casella Nome, impostare la risoluzione verticale su 500 DPI e fare clic su Esporta per creare il file PDF della mappa.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per comprendere la distribuzione e l'abbondanza dei geni correlati al ciclo CH4 (mcrA, pmoA1, pmoA2 e mmoX) nelle zone umide costiere del Texas meridionale, l'eDNA estratto da ciascun campione è stato analizzato mediante cPCR e qPCR. I primer universali per ciascun biomarcatore sono stati selezionati per eseguire la cPCR da studi precedenti (Tabella 1)22,34,35,36,37 e sono state apportate modifiche per ottimizzare le temperature e le concentrazioni di ricott...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le zone umide costiere sono riconosciute come fattori significativi per il metano atmosferico, un importante gas serra40. Sebbene ci siano stati studi sul flusso di metano e sui metanogeni nelle zone umide 41,42,43, poco si sa su come i metanotrofi operino in diversi ambienti o in varie pratiche di gestione, specialmente nelle zone umide con livelli d'acqua fluttuanti44.

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati ai membri di C-REAL per la loro assistenza nell'osservazione sul campo e nelle analisi di laboratorio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per PCR da 0,2 mLThermoFisher ScientificAB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
Provette per PCR da 0,5 mLPromegaE4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μ Punte a LThermoFisher Scientific05-408-187Fisherbrand SureGrip Punta per pipetta Rack o sistema di ricarica Punte Natural; 10μ L; | Fisher Scientific
Provetta da centrifuga da 15 mlThermoFisher Scientific14-959-53Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μ Punte a LThermoFisher Scientific05-408-190Fisherbrand SureGrip Punta per pipette Rack o sistema di ricarica Punte Natural; 200μ L; | Fisher Scientific
1000 μ Punte a LThermoFisher Scientific02-707-402https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kUsQ9Lu0YIq5i4vWege
17qPdtxIYZyvmJH1cDo
ARuwereO1V4GLz9UaA
lDREALw_wcB& ef_id=C
j0KCQiApNW6BhD5ARI
sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i
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