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Articolo metodologico

Consegna efficace e sicura del gene al rene di topo tramite iniezione lenta retrograda della pelvi renale di vettori virali adeno-associati

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DOI:

10.3791/67716

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1 agosto 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

In questo articolo

Sommario

Questo rapporto descrive in dettaglio il metodo di iniezione localizzato dei vettori AAV attraverso la pelvi renale per un trasferimento genico efficace e sicuro nel rene di topo.

Abstract

Lo sviluppo di strumenti e metodi efficaci in vivo per la consegna genica al rene è fondamentale per far progredire la ricerca renale di base e la terapia genica per le malattie renali. Inoltre, la crescente consapevolezza delle malattie renali monogeniche, guidata da test genetici avanzati, sottolinea il potenziale della terapia genica per trattare e persino curare malattie renali genetiche difficili da trattare. A questo proposito, i vettori di virus adeno-associati (AAV) hanno attirato una crescente attenzione come solida piattaforma per la consegna genica in vivo ; tuttavia, il metodo più efficace e sicuro per la somministrazione genica mediata da vettore AAV a ciascun tipo di cellula terapeuticamente rilevante nel rene non è stato ancora completamente stabilito. Qui, viene descritto in dettaglio il metodo di iniezione lenta della pelvi renale retrograda (RP) di vettori AAV e viene dimostrato il suo alto potenziale di trasduzione dei reni di topo quando utilizzato con capsidi AAV opportunamente selezionati. Inoltre, questo metodo si è dimostrato efficace non solo con i vettori AAV (CsCl AAV) purificati con ultracentrifugazione al cloruro di cesio standard, ma anche con i miniprep di vettori AAV (CU AAV) ultrafiltrati centrifugamente, che possono essere preparati rapidamente e semplicemente utilizzando tecniche che non richiedono competenze specialistiche sui vettori AAV. Ad esempio, questo studio dimostra che l'iniezione lenta di RP di entrambi i vettori CsCl e CU AAV-KP3 provoca una robusta trasduzione dei tubuli prossimali nel rene di topo senza danni tissutali apparenti, a differenza degli approcci idrodinamici precedentemente riportati che portano inevitabilmente a danni tissutali. Pertanto, questo studio evidenzia che l'iniezione lenta di RP retrograda di vettori selezionati derivati dal capside AAV è un metodo efficace e sicuro per la consegna genica al rene. Questo metodo sarà applicabile a un ampio spettro di ricerche sui reni, compresi gli studi di terapia genica. L'uso di miniprep vettoriali CU AAV aumenterà significativamente la produttività e migliorerà l'efficienza in termini di tempo e costi necessari per generare dati preliminari e ottenere informazioni cruciali.

Introduzione

Metodi efficaci e sicuri per la consegna di geni al rene in piccoli e grandi animali da esperimento offrono opportunità cruciali per far progredire la ricerca renale di base ed esplorare approcci terapeutici innovativi. L'istituzione di tali metodi è particolarmente rilevante per la terapia genica per varie malattie renali. I recenti progressi nei test genetici clinici hanno rivelato una prevalenza di malattie renali monogeniche più elevata di quanto stimato in precedenza, che colpisce circa il 30% dei pazienti con malattie renali croniche (CKD)1. La CKD è caratterizzata da un danno renale progressivo, che porta infine all'insufficienza renale in assenza di terapie modificanti la malattia veramente efficaci. L'emodialisi e il trapianto di rene sono trattamenti attualmente disponibili; tuttavia, hanno limitazioni che compromettono significativamente la qualità della vita dei pazienti con CKD2. Pertanto, la terapia genica, un potente approccio clinicamente testato per il trattamento delle malattie genetiche, ha raccolto un'attenzione significativa negli ultimi anni come una nuova strada per il trattamento efficace delle malattie renali genetiche che portano alla CKD 3,4,5,6. Questo approccio può affrontare direttamente le cause alla radice delle malattie e potenzialmente offrire una cura.

Nonostante i costanti progressi nel campo, la consegna genica al rene rimane una sfida significativa sia nella ricerca che nei contesti terapeutici. Colpire in modo efficiente le cellule renali con geni terapeutici è difficile a causa della struttura complessa dell'organo e delle barriere fisiologiche uniche, tra cui la barriera di filtrazione glomerulare, che è composta da cellule endoteliali glomerulari, la membrana basale glomerulare e i processi del piede podocitario. Sono state esplorate varie strategie per la consegna genica mirata ai reni, tra cui l'iniezione diretta della corteccia renale (RC) 7,8, l'iniezione dell'arteria renale (RA) 9,10,11, l'iniezione della vena renale (RV) 12,13,14, l'iniezione della pelvi renale (RP) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 e iniezione endovenosa (IV) 19,26,27,28,29,30 di vettori di consegna genica virale o non virale, nonché somministrazione di acido nucleico mediata da ultrasuoni e microbolle 31,32. Questi approcci hanno dimostrato efficienze di trasduzione variabili o risultati funzionali, spesso producendo risultati incoerenti che sono difficili da conciliare (rivisti nei riferimenti 3,33,34,35). Il rilascio di geni al rene è ancora poco sviluppato, rendendo difficile il confronto diretto tra sistemi vettoriali e metodologie. Tuttavia, i metodi di somministrazione localizzati, che facilitano la somministrazione di agenti altamente concentrati direttamente al rene, hanno generalmente ottenuto risultati migliori rispetto alla somministrazione endovenosa sistemica. Inoltre, i vettori di virus adeno-associati (AAV), con i loro robusti profili di sicurezza e la comprovata esperienza di traslazione clinica36,37, sono stati i più studiati e sono considerati la scelta principale per il trasferimento genico renale.

I sierotipi AAV comuni e i capsidi ingegnerizzati hanno dimostrato un'efficace trasduzione delle cellule mesangiali e mesenchimali nel rene dopo l'iniezione endovenosa nei topi 28,30,38. In particolare, studi recenti hanno dimostrato che la somministrazione endovenosa di AAV9 può trasdurre efficacemente i podociti in modelli murini di sindrome nefrosica e sindrome di Alport, sebbene questo effetto non sia osservato nel rene sano38,39, e che la somministrazione endoterapica endoterale ingegnerizzata di AAV2 può colpire esclusivamente le cellule endoteliali glomerulari sia nei reni sani che in quelli infiammati nei topi40. Storicamente, i tubuli renali sono stati difficili da trasdurre attraverso la via endovenosa. Tuttavia, è stato recentemente scoperto che l'iniezione di RP di capsidi AAV selezionati, come AAV-KP141, può raggiungere la trasduzione dei tubuli prossimali a livelli superiori di un ordine di grandezza rispetto a quelli raggiunti con il capside AAV938 di riferimento. Sebbene siano necessari ulteriori miglioramenti, questi progressi aprono nuove strade per la ricerca renale di base e la terapia genica, offrendo opportunità che prima erano irraggiungibili.

Nel presente articolo, l'iniezione lenta di RP retrograda di vettori AAV è descritta in dettaglio come un metodo efficace e sicuro per la consegna genica al rene di topo38. Come esempio rappresentativo di questa tecnica, AAV-KP3 è stato scelto come capside esemplare sulla base della scoperta che è uno dei sei capsidi (cioè AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 e AAV2.7m844) che hanno mostrato una maggiore trasduzione renale rispetto ad AAV9 dopo l'iniezione di RP nei topi38. In particolare, i tessuti renali iniettati con RP retrogrado lento non hanno mostrato alcun danno tissutale apparente rispetto a quelli trattati con approcci idrodinamici precedentemente riportati23,24. Inoltre, i vettori miniprep AAV45 rozzamente purificati mediante ultrafiltrazione centrifuga rapida e semplice (cioè vettori CU AAV) hanno raggiunto livelli di trasduzione renale circa il 70% di quelli ottenibili dalle preparazioni di vettori AAV purificati con l'ultracentrifugazione a gradiente standard di cloruro di cesio (CsCl) (cioè vettori CsCl AAV) quando somministrati allo stesso titolo del genoma del vettore. Pertanto, il metodo e le osservazioni qui presentate forniscono una risorsa preziosa e pratica per i ricercatori che cercano di migliorare la consegna genica al rene nei topi e negli animali potenzialmente più grandi.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Oregon Health & Science University (OHSU) e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per la cura degli animali dell'OHSU. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di otto settimane. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Produzione di vettori AAV mediante trasfezione plasmidica priva di adenovirus

  1. Coltura di 293 cellule di rene embrionale umano (HEK) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto glucosio (4,5 g/L) integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillina e streptomicina e 1 mM di L-glutammina, in un incubatore a 37 °C con il 5% di anidride carbonica (CO2).
  2. Il giorno -2 (48 ore prima della trasfezione), piastra 4 x 106 cellule HEK 293 per matraccio T225 in 40 mL del terreno di coltura come descritto nella fase 1.1. Questo raggiunge una confluenza del ~95% il giorno 0.
    NOTA: La scala di coltura può essere regolata in base all'applicazione. Per un miniprep AAV (fase 2), preparare un numero adeguato di matracci in base al titolo target e alla concentrazione del vettore, considerando che il processo di purificazione comporta tipicamente una perdita di materiale di circa il 50%. Per ottenere >6 x 1012 vg/mL di vettori AAV9 e AAV-KP3 per l'iniezione di RP nei topi alla dose di 3 x 1011 vg/topo in una soluzione vettoriale da 50 μL, si raccomandano almeno 2 fiasche. Per la produzione di vettori AAV su larga scala, come quella per i vettori AAV purificati con gradiente di densità CsCl (CsCl AAV), vengono generalmente utilizzati 25 o più flaconi.
  3. Giorno 0: Trasfezione del DNA plasmidico
    1. Preparazione per la trasfezione
      1. Assicurati che le celle abbiano raggiunto una confluenza del ~95%.
      2. Riscaldare il DMEM integrato con la miscela di penicillina e streptomicina all'1% e 1 mM di L-glutammina ma senza FBS (cioè terreno privo di siero) in un bagno d'acqua a 37 °C.
      3. Lasciare che la soluzione di polietilenimmina lineare (PEI) raggiunga la temperatura ambiente.
    2. Preparazione di una miscela di DNA plasmidico
      1. Miscelare i plasmidi (15 μg ciascuno di pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap e pHelper) in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza CaCl2 o MgCl2 in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL. La quantità totale di DNA è di 45 μg/matraccia.
        NOTA: I volumi della soluzione di DNA plasmidico possono essere ignorati se sono minimi. Tuttavia, si consiglia una regolazione del volume se il volume totale della soluzione è ≥225 μl. Le sequenze dei plasmidi utilizzati in questo studio sono disponibili nel File supplementare 1.
    3. Trasfezione PEI
      1. Aggiungere 90 μL di soluzione di PEI (1 mg/mL) a 1 mL di PBS e miscelare con la miscela di DNA plasmidico PBS (preparata come sopra) in una provetta di polipropilene da 50 mL. Il volume finale è di circa 2 mL (5% del volume del terreno di coltura).
      2. Agitare le provette per 5 s e farle girare brevemente con una centrifuga per raccogliere il liquido sul fondo delle provette.
    4. Conservare a temperatura ambiente per 15 minuti per formare complessi plasmidici DNA-PEI.
    5. Una volta completata l'incubazione di 15 minuti, aggiungere i 40 mL di terreno preriscaldato privo di siero preparato al punto 1.3.1.2 ai complessi plasmidi DNA-PEI. Il volume è di circa 42 ml.
    6. Sostituire il terreno di coltura del pallone T225 con complessi plasmidi DNA-PEI contenenti terreno privo di siero descritto al punto 1.3.4.
    7. Mantenere le cellule in questo mezzo di trasfezione fino al prelievo del giorno 5 (non è richiesto alcun cambio di terreno).
    8. Il giorno 2, osservare le cellule trasfettate con le proteine fluorescenti che esprimono il plasmide (ad esempio, pAAV-CAG-tdTomato) sotto un microscopio a fluorescenza invertito per valutare l'efficienza della trasfezione plasmidica.
      NOTA: Le condizioni sopra descritte in genere determinano un'efficienza di trasfezione superiore al 70%. Si possono osservare alcuni cambiamenti morfologici (ad esempio, allungamento cellulare), probabilmente dovuti all'ambiente privo di siero.
    9. Nei giorni da 3 a 5, continuare a coltivare le cellule trasfettate in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5%.
    10. Il giorno 5, raccogliere sia le cellule che il terreno contenente il virus in una provetta di polipropilene da 50 mL.
    11. Conservare i campioni a -80 °C fino al momento dell'uso.

2. Purificazione con ultrafiltrazione centrifuga (CU) di vettori AAV (AAV miniprep)

  1. Scongelare il campione congelato del passaggio 1.3.11 in un bagno d'acqua a 37 °C.
  2. Tenere da parte 1 mL di lisato grezzo per il saggio del DNA dot blot (usato come Frazione 1).
  3. Aggiungere 80 μL di cloruro di magnesio 1M (MgCl2, concentrazione finale di 2 mM), 160 μL di idrossido di sodio 0,1M (NaOH, concentrazione finale di 0,4 mM) e 16 μL di endonucleasi Serratia marcescens (concentrazione finale di 100 unità/mL) in una provetta da 50 mL. Incubare a 37 °C per 1 ora. Agitare il campione ogni 15 minuti durante l'incubazione.
  4. Raccogliere il campione trattato con endonucleasi Serratia marcescens in un flacone da centrifuga da 250 ml e centrifugare a 10.000 x g a 4 °C per 30 minuti.
  5. Trasferire il surnatante in una provetta in polipropilene da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL.
  6. Filtrare il surnatante per rimuovere i detriti utilizzando un filtro per siringa in PVDF da 0,45 μm. Tenere da parte 1 mL di campione filtrato da 0,45 μm per il saggio del DNA dot blot (utilizzato come frazione 2).
  7. Aggiungere 10 mL di acqua di grado molecolare a una provetta per ultrafiltrazione centrifuga con cut-off del peso molecolare (MWCO) da 100 kDa e centrifugare a 2.000 x g a 4 °C per 10 minuti. Rimuovere il flusso.
  8. Aggiungere 15 mL di sorbitolo al 5% in PBS alla provetta di ultrafiltrazione centrifuga e centrifugare a 2.000 x g a 4 °C per 10 minuti. Rimuovere il flusso.
  9. Aggiungere fino a 15 mL di campione filtrato da 0,45 μm come descritto al punto 2.6 e centrifugare a 2.000 x g a 4 °C per 15 minuti per la concentrazione fino a raggiungere il volume target di circa 500 μL. Tenere da parte 1 mL di flusso continuo per il saggio del DNA dot blot (utilizzato come frazione 3).
    NOTA: Prima di ogni centrifugazione, risospendere il retentato con una pipetta per interrompere il gradiente di concentrazione. Non toccare la membrana con il puntale della pipetta. Se il volume target non viene raggiunto dopo 15 minuti di centrifugazione, prolungare la centrifugazione secondo necessità regolando la durata in base al volume rimanente nella provetta.
  10. Ripetere il passaggio 2.9 fino a quando l'intero campione non viene filtrato, raggiungendo il volume target di circa 500 μL. Tenere da parte 1 mL di flusso continuo della prima e della seconda iterazione del passaggio 2.10 per il saggio DNA dot blot (utilizzato come Frazione 4 e Frazione 5).
    NOTA: Una singola provetta di ultrafiltrazione centrifuga può essere utilizzata per elaborare campioni ottenuti da due o più fiasche.
  11. Aggiungere 15 mL di sorbitolo al 5% in PBS e centrifugare a 2.000 x g a 4°C per 15 minuti fino a raggiungere il volume target di circa 500 μL. Tenere da parte 1 mL di flow-through per il saggio del DNA dot blot (utilizzato come frazione 6).
  12. Ripetere il passaggio 2.11 (utilizzato come frazione 7).
    NOTA: Se sono necessari titoli AAV più elevati per gli esperimenti a valle, il volume target finale può essere ulteriormente ridotto a 150 μl.
  13. Trasferire il vettore AAV ultrafiltrato in una provetta con tappo a vite da 2 mL con O-ring. Tenere da parte 10 μL di vettore AAV ultrafiltrato per il saggio del DNA dot blot (utilizzato come frazione 8).
  14. Determinare i titoli AAV mediante il test del DNA dot blot come descritto in precedenza46.
    NOTA: I vettori purificati con CU (CU AAV) contengono livelli più elevati di contaminazione da capside vuoto e impurità derivate dalla cellula ospite rispetto ai vettori purificati con CsCl (CsCl AAV). Questi fattori possono influenzare l'efficienza della trasduzione e le risposte immunitarie, richiedendo un'attenta considerazione nell'interpretazione dei dati.

3. Purificazione a gradiente di densità CsCl di vettori AAV

  1. Scongelare il campione congelato del passaggio 1.3.11 in un bagno d'acqua a 37 °C.
  2. Centrifugare a 10.000 x g a 4 °C per 30 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
  3. Raccogliere il surnatante e precipitare i vettori AAV nel surnatante aggiungendo polietilenglicole 8000 (PEG, concentrazione finale dell'8%) e cloruro di sodio (concentrazione finale di 500 mM).
  4. Incubare su ghiaccio per 3 ore.
  5. Centrifugare a 10.000 x g a 4 °C per 30 min per ottenere i pellet contenenti AAV.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet con 10 ml di tampone di risospensione contenente Sarkosyl (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Sarkosyl, pH 8,0).
  7. Trasferire la sospensione di pellet in una provetta di polipropilene da 15 mL e mantenerla a 4 °C per una notte.
  8. Il giorno seguente, trattare la sospensione in pellet con Serratia marcescens endonucleasi (concentrazione finale di 200 unità/mL) e MgCl2 (concentrazione finale di 2 mM).
  9. Incubare a 37 °C per 1h.
  10. Centrifugare a 10.000 x g a 4 °C per 30 min.
  11. Raccogliere il surnatante e aggiungere cloruro di cesio (CsCl, concentrazione finale dell'indice di rifrazione (RI) = 1,3710 +/- 0,0005) e EDTA (concentrazione finale di 20 mM).
  12. Caricare il campione in una provetta per ultracentrifuga da 29,9 mL e aggiungere la soluzione di topping (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, CsCl (RI = 1,3710 +/- 0,0005), pH 8,0) fino a riempirla.
  13. Centrifugare a 41.000 x g a 12 °C per 22 h.
  14. Praticare dei fori sul fondo e sul lato della provetta dell'ultracentrifuga per raccogliere un totale di 15 frazioni da 2 mL ciascuna.
  15. Utilizzare 10 μl di ciascuna frazione per controllare l'RI ed eseguire il test DNA dot blot46.
  16. Sulla base dei risultati del test RI e DNA dot blot, determinare le 5 migliori frazioni che contengono vettori AAV.
  17. Combina le migliori 5 frazioni (totale circa 10 ml) e regola l'RI a 1,3710 +/- 0,0005.
  18. Caricare il campione in una provetta per ultracentrifuga da 11,2 mL e aggiungere la soluzione di topping fino a riempirla.
  19. Centrifugare a 65.000 x g a 12 °C per 12 h.
  20. Praticare dei fori sul fondo e sul lato della provetta per ultracentrifuga da 11,2 mL per raccogliere un totale di 18 frazioni da 0,5 mL ciascuna.
  21. Utilizzare 10 μl di ciascuna frazione per controllare l'RI ed eseguire il test DNA dot blot46.
  22. Sulla base dei risultati del test RI e DNA dot blot, determinare le migliori 6 frazioni che contengono vettori AAV.
  23. Combinare le migliori 6 frazioni (per un totale di circa 3 ml) e caricarle in una cassetta per dialisi.
  24. Far galleggiare la cassetta per dialisi in 1,3 L di tampone per dialisi (tampone PBS integrato con tensioattivo non ionico allo 0,001%) con una barra di agitazione per 2 ore per rimuovere il CsCl.
  25. Ripetere il passaggio 3.24 due volte (totale 6 ore di dialisi).
  26. Trasferire la cassetta a 500 mL di sorbitolo al 5% in tampone PBS integrato con tensioattivo allo 0,001% per 2 ore per la sostituzione del tampone.
  27. Raccogliere il campione dalla cassetta per dialisi con una siringa e filtrare il campione raccolto utilizzando un filtro per siringa in PVDF da 0,22 μm.
  28. Titoli AAV determinati mediante un saggio quantitativo di dot blot46.

4. Valutazione della qualità delle preparazioni di vettori AAV mediante SDS-PAGE seguita da colorazione con argento

  1. Mescolare le preparazioni di vettori, 1 x 1010 vg per i vettori CsCl AAV e 1 x 109 e 1 x 1010 vg per i vettori CU AAV, con 6 tamponi Laemmli in un totale di 18 μl (preparazione del vettore: 6x Laemmli = 15:3) e riscaldarli a 100 °C per 5 minuti.
  2. Caricare le preparazioni vettoriali AAV trattate termicamente su un gel SDS-PAGE al 7,5% ed elettroforare i campioni a 20 mA utilizzando il tampone di corsa in gel Tris-glicina-SDS.
  3. Rimuovere il gel dalla cassetta del gel, sciacquarla con acqua ultrapura e macchiarla utilizzando un kit per la colorazione dell'argento secondo le istruzioni del produttore.
  4. Incubare il gel caricato con vettori CsCl AAV nella soluzione di sviluppo per 7 minuti, mentre incubare il gel caricato con vettori CU AAV per 2 minuti per evitare la saturazione del segnale.
    NOTA: Le preparazioni di vettori CU AAV contengono livelli più elevati di impurità proteiche rispetto ai vettori CsCl AAV. Pertanto, i gel caricati con vettori CsCl AAV e CU AAV sono stati separati dopo l'esecuzione del gel e colorati con argento separatamente per evitare la saturazione del segnale a causa dell'elevata sensibilità del metodo di colorazione.

5. Identificazione delle proteine AAV VP in preparazioni di vettori CU AAV mediante western blot

  1. Mescolare 1 x 109 vg di preparazioni vettoriali CU AAV con 6 tamponi Laemmli in un totale di 18 μl (preparazione vettoriale: 6x Laemmli = 15:3) e riscaldarli a 100 °C per 5 minuti.
  2. Caricare le preparazioni vettoriali AAV trattate termicamente su un gel SDS-PAGE al 7,5% ed elettroforare i campioni a 20 mA utilizzando il tampone di corsa in gel Tris-glicina-SDS.
  3. Elettrotrasferire le proteine nel gel su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF), attivata in metanolo, utilizzando un sistema di trasferimento semi-secco.
  4. Bloccare la membrana con latte scremato al 5% in 1x soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST) a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Incubare la membrana ostruita con una soluzione di anticorpi primari (anticorpo policlonale anti-VP di coniglio, diluito a 1:1000 con latte scremato al 5% in 1x TBST) a 4 °C per una notte.
  6. Lavare la membrana con 1x TBST per 10 minuti, 3 volte.
  7. Incubare la membrana con una soluzione di anticorpi secondari (anticorpo IgG di capra anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano, diluito a 1:5000 con latte scremato al 5% in 1x TBST) a temperatura ambiente per 1 ora.
  8. Lavare la membrana con 1x TBST per 10 minuti, 3 volte.
  9. Visualizzare i segnali sulla membrana utilizzando un sistema di imaging western blot.

6. Iniezione di pelvi renale (RP)

  1. Impostazione preoperatoria e anestesia
    1. Misurare il peso corporeo di ciascun topo in un becher di plastica su una bilancia con una precisione di 0,1 g.
    2. Somministrare meloxicam (5 mg/kg) per via sottocutanea in base al peso corporeo per fornire analgesia prechirurgica.
    3. Diluire la soluzione del vettore AAV a una concentrazione di 6,0 x 1012 vg/mL con il 5% di sorbitolo in PBS e mantenerla in ghiaccio.
      NOTA: Preparare 40 μL di soluzione AAV in più rispetto al volume totale di iniezione (50 μL x numero di topi da iniettare) per tenere conto dello spazio morto in una siringa di vetro a tenuta di gas e in una provetta in polietilene PE-10.
    4. Piegare e rompere solo la punta dell'ago da un ago da 30 G utilizzando un portaaghi.
    5. Sotto uno stereomicroscopio, collegare la punta dell'ago da 30 G, 15 cm di tubo in PE-10, un ago da 30 G e una siringa di vetro a tenuta di gas in questo ordine dalla punta (Figura 1D).
    6. Posizionare la siringa di vetro a tenuta di gas collegata su una pompa siringa per infusione.
    7. Aspirare 90 μl di soluzione vettoriale AAV preparata al punto 6.1.3 nella siringa di vetro a tenuta di gas utilizzando una pompa per siringa per infusione.
    8. Impostare la modalità di infusione della pompa a siringa come segue: il volume target di 50 μl e una portata di 50 μl/min.
    9. Posizionare un topo in una camera di plastica riempita con isoflurano al 4% erogato in ossigeno al 100% a una velocità di flusso da 1,5 a 3,0 L/min fino a quando non è completamente anestetizzato.
    10. Posizionare il muso del topo in un cono nasale con flusso di isoflurano dall'1,5% al 3,0%. Monitorare la profondità dell'anestesia mediante il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi durante tutta la procedura chirurgica.
    11. Coprire gli occhi con un unguento oftalmico utilizzando un applicatore con punta di cotone per prevenire l'essiccazione corneale.
    12. Rimuovere il pelo dal lato posteriore sinistro del mouse con un depilatorio utilizzando un applicatore con punta di cotone.
      NOTA: La crema depilatoria deve essere completamente rimossa tramite risciacquo per evitare irritazioni cutanee.
    13. Posizionare il mouse in posizione laterale su un termoforo a circuito chiuso collegato a una pompa per terapia del calore per mantenere la temperatura corporea a 37 °C (non è necessario fissarlo con nastro adesivo).
    14. Disinfettare l'area rasata con tre applicazioni alternate di iodio povidone ed etanolo al 70% utilizzando un applicatore con punta di cotone con un movimento circolare a partire dal sito di incisione.
    15. Copri il topo con un telo chirurgico sterile.
  2. Iniezione di RP al rene sinistro
    1. Pizzicare la pelle con una pinza per tessuti e praticare un'incisione di circa 1 cm sullo strato cutaneo con le forbici chirurgiche a livello dell'angolo costovertebrale nella posizione del rene sinistro.
    2. Dopo aver praticato un'incisione cutanea, tagliare lo strato muscolare della stessa lunghezza.
      NOTA: Se la lunghezza dell'incisione è troppo corta, il rene non può essere esposto e, invece, la milza, che è di dimensioni più piccole, può essere esposta accidentalmente. D'altra parte, se la lunghezza dell'incisione è troppo lunga, il rene non sarà tenuto in posizione dall'incisione stessa e scivolerà continuamente nell'addome attraverso l'incisione.
    3. Premere delicatamente sull'addome con le dita, senza toccare direttamente il rene, in modo che il rene sia esposto attraverso il sito di incisione (Figura 1A).
    4. Rimuovere minimamente il grasso circostante in modo che la pelvi renale sia visibile come una piccola area bianca.
    5. Innanzitutto, bloccare l'uretere con una clip per microvasi di tipo dritto, quindi l'arteria renale e la vena renale insieme a una clip per micro vasi di tipo curvo.
      NOTA: Il colore del rene diventa rosso scuro, confermando il successo del blocco del flusso sanguigno in entrata e in uscita dal rene (Figura 1B).
    6. Inserire l'ago da 30 G collegato alla pompa a siringa a circa 3 mm nella cavità pelvica con una pinza curva e iniziare un'iniezione di 50 μL di soluzione vettoriale AAV utilizzando una pompa a siringa per infusione a una velocità di flusso di 50 μL/min per 1 minuto (Figura 1C).
    7. Tenere l'ago e la pinza per 5 minuti per aumentare l'esposizione del rene iniettato al vettore AAV.
      NOTA: Il tempo di permanenza appropriato può variare e dipende dai capsidi AAV. È stato dimostrato che un tempo di permanenza di 5 minuti è sufficiente per la trasduzione con il vettore AAV-KP1 o AAV-KP3.
    8. Una volta completata l'incubazione di 5 minuti, rimuovere i pinze.
      NOTA: Il colore dei reni cambia immediatamente da rosso scuro a rosso sangue, confermando il ripristino del flusso sanguigno nel rene.
    9. Estrarre l'ago per iniezione con cautela e lentamente, posizionando contemporaneamente un applicatore con punta di cotone sul sito di iniezione con pressione. Assicurarsi che non vi siano sanguinamenti dal sito di iniezione. Non è necessario applicare un cerotto emostatico.
    10. Riposizionare delicatamente il rene nella cavità peritoneale.
    11. Sutura lo strato muscolare con sutura assorbibile 6-0 e la pelle con sutura monofilamento 5-0.
    12. Somministrare 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi per il supporto dei liquidi.
    13. Sostituire la punta dell'ago da 30 G usata con una appena preparata, eliminare l'ago da 30 G usato secondo le linee guida dell'istituto per la gestione dei rifiuti chimici pericolosi e caricare 50 μl della soluzione vettoriale AAV utilizzando una pompa a siringa per infusione per la somministrazione al topo successivo.
    14. Ripetere i passaggi 6.2.12-6.2.13 per tutti i mouse del gruppo, ad eccezione dell'ultimo, per il quale non è richiesto il passaggio 6.2.13.
    15. Dopo aver completato tutte le iniezioni pianificate, eliminare gli aghi e i tubi di polietilene contaminati secondo le linee guida dell'istituto per la gestione dei rifiuti chimici pericolosi.
  3. Monitoraggio e cura postoperatoria
    1. Somministrare meloxicam (5 mg/kg) per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi per l'analgesia post-chirurgica 24 ore e 48 ore dopo l'iniezione di RP.
    2. Somministrare 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi per il supporto dei liquidi 24 ore dopo l'iniezione di RP.
    3. Monitorare il peso corporeo e l'aspetto generale dei topi iniettati ogni giorno per 1 settimana dopo l'intervento. Se si verifica una perdita di peso corporeo del 10%, somministrare 1 ml di soluzione salina per via sottocutanea nella schiena dei topi tre volte a settimana per una settimana. Se non si osserva alcun miglioramento, i topi affetti vengono soppressi.

7. Prelievo di tessuti e criosezione

  1. Preparazione della soluzione di fissazione e crioprotezione.
    1. 0,2 M di tampone fosfato (totale 1 L)
      1. Preparare 800 ml di acqua ultrapura in un becher di vetro da 1 L.
      2. Aggiungere alla soluzione 6,4 g di sodio fosfato monobasico (NaH2PO4) e 21,8 g di sodio fosfato bibasico (Na2HPO4).
      3. Regolare il pH a 7,4 con acido cloridrico.
      4. Riempire con acqua ultrapura fino a 1 L.
      5. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
    2. Soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% (totale 40 ml)
      1. Miscelare 10 mL di PFA al 16%, 20 mL di tampone fosfato 0,2M preparato al punto 7.1.1 e 10 mL di acqua ultrapura.
      2. Aliquotare 10 mL in una provetta di polipropilene da 15 mL.
        NOTA: Preparare una soluzione di PFA al 4% appena prima dell'uso per la fissazione della perfusione.
    3. Soluzione di saccarosio al 30% (totale 40 ml).
      1. Mescolare 30 ml di PBS con 12 g di saccarosio.
      2. Dopo aver sciolto completamente, riempire con PBS fino a 40 ml.
  2. Fissazione della perfusione e raccolta dei tessuti.
    ATTENZIONE: La fissazione della perfusione deve essere eseguita in una cappa aspirante poiché la soluzione di PFA al 4% è una potente sostanza chimica dannosa se inalata.
    1. Anestetizzare il topo con isoflurano, metterlo in posizione supina e confermare la completa assenza di reattività pizzicando delicatamente le estremità.
    2. Una volta che il topo è anestetizzato, praticare un'incisione con le forbici chirurgiche dall'addome caudale allo xifoide. Quindi, praticare due incisioni laterali lungo entrambi i lati dello sterno e ritrarre la parete toracica anteriormente per esporre il cuore e i vasi principali.
    3. Aprire l'atrio destro tramite dissezione brusca per decomprimere il sistema circolatorio. Inserire un ago a farfalla da 25 G nel ventricolo sinistro e infondere 50 ml di PBS a una velocità di circa 10 ml/min, dirigendo il flusso verso l'aorta ascendente.
      NOTA: Il dissanguamento è importante per ottenere immagini di immunofluorescenza (IF) di alta qualità perché il sangue mostra autofluorescenza. Per garantire la completa rimozione del sangue, in questo studio sono stati utilizzati 50 ml di PBS, sebbene 20-30 ml siano comunemente usati.
    4. Inffondere 20 mL di soluzione di PFA al 4% preparata al punto 7.1.2 alla stessa velocità, assicurandosi che non venga introdotta aria durante il cambio delle soluzioni.
    5. Raccogliere i tessuti e mantenerli a 4 °C per una notte in una provetta di polipropilene da 15 ml riempita con una soluzione di PFA al 4% per la post-fissazione. Quando la proteina fluorescente è espressa nel tessuto raccolto, coprire la provetta con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
  3. Crioinclusione
    1. Trasferire il tessuto in una provetta di polipropilene da 15 mL riempita con una soluzione di saccarosio al 30% preparata al punto 7.1.3 per la crioprotezione.
    2. Conservare a 4 °C fino a quando i tessuti non affondano completamente sul fondo delle provette.
    3. Trasferire il tessuto in un criomold di plastica con una pinza standard.
    4. Posizionare il composto OCT sul tessuto assicurandosi che il tessuto sia orientato correttamente e a filo con il fondo del criostampo.
    5. Riempire la parte superiore con il composto OCT. Rimuovere eventuali bolle con un puntale per pipetta.
    6. Mettere il criomold di plastica in un bagno criogenico contenente 2-metilbutano, raffreddato con ghiaccio secco tritato in un secchiello per il ghiaccio, fino a quando il composto OCT non è completamente congelato (il composto OCT diventerà bianco).
    7. Conservare i blocchi di tessuto a -80 °C fino al momento dell'uso.
  4. Criosezione
    1. Trasferire i blocchi di tessuto congelati in un microtomo criostato a -20 °C prima del sezionamento e lasciare che la temperatura dei blocchi di tessuto congelati si equilibri.
    2. Sezionare ogni blocco di tessuto congelato nello spessore desiderato (tipicamente 5 μm) utilizzando il microtomo criostato. Posizionare le sezioni di tessuto su un vetrino da microscopio per la colorazione in immunofluorescenza.
    3. Le sezioni possono essere conservate a -80 °C per un uso successivo.

8. Colorazione in immunofluorescenza

  1. Asciugare i vetrini congelati a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Isolare la sezione con una penna bloccante liquidi e asciugare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  3. Reidratare le sezioni con 150 μL di PBS per 10 min.
  4. Posizionare i vetrini su una superficie piana e aggiungere sui vetrini 150 μl di albumina sierica bovina (BSA) all'1% diluita con PBS per sezione. Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti per bloccare.
  5. Aggiungere 150 μl di soluzione anticorpale primaria (anticorpo anti-Wilms Tumor 1 (WT1), diluito a 1:100 con BSA all'1%; anticorpo anti-cotrasportatore Na-K-2Cl 2 (NKCC2), diluito a 1:100 con BSA all'1%; o anticorpo anti-acquaporina 2 (AQP2), diluito a 1:100 con BSA all'1%) e incubare a 4 °C per una notte in una camera umida.
  6. Lavare le sezioni con PBS a temperatura ambiente per 5 minuti, 3 volte.
  7. Aggiungere 150 μl di anticorpo secondario (anticorpo anti-coniglio IgG Alexa Fluor 647, diluito a 1:500 con l'1% di BSA) e la lectina di Lotus tetragonolobus (LTL)-fluoresceina (diluita a 1:200 con l'1% di BSA) e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti.
  8. Lavare le sezioni con PBS a temperatura ambiente per 5 min.
  9. Posizionare i vetrini su una superficie piana e aggiungere 150 μl di Hoechst 33342 (diluito a 1:10.000 con PBS) per la colorazione nucleare. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, al riparo dalla luce.
  10. Lavare le sezioni con PBS a temperatura ambiente per 5 min.
  11. Montare i vetrini con 20 μl di mezzo di montaggio e un vetro di copertura. Conservare i vetrini al buio a 4 °C fino a quando non viene eseguita l'imaging.

9. Estrazione del DNA dal tessuto

  1. Estrazione del DNA dai tessuti utilizzando un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).
    1. Trasferire il tessuto in una provetta di ceramica e aggiungere 400 μL di tampone di estrazione del DNA (100 mM di NaCl, 20 mM di EDTA, 1% di SDS e 50 mM di Tris-HCl, pH 8,0).
    2. Omogeneizzare il tessuto a una velocità di 5 m/s per 20 s in 3 cicli utilizzando un omogeneizzatore.
    3. Centrifugare a 2.000 x g a temperatura ambiente per 2 min.
    4. Raccogliere 200 μl di surnatante utilizzando una pipetta P200 e aggiungere 10 μl di soluzione di proteinasi K (concentrazione finale di 1 mg/mL).
    5. Miscelare a vortice per 15 s e incubare a 55 °C per 1 ora.
    6. Aggiungere 200 μl di tampone di lisi dal kit di estrazione del DNA.
    7. Miscelare a vortice per 15 s e incubare a 55 °C per 15 min.
    8. Aggiungere 250 μl di etanolo al 100%.
    9. Mescolare a vortice per 15 s e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    10. Applicare il lisato sulla colonna di centrifuga per l'estrazione del DNA.
    11. Centrifugare a 6.000 x g a temperatura ambiente per 1 min.
    12. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL. Aggiungere 500 μl del primo tampone di lavaggio del kit di estrazione del DNA.
    13. Centrifugare a 6.000 x g a temperatura ambiente per 1 min.
    14. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta. Aggiungere 500 μl del secondo tampone di lavaggio dal kit di estrazione del DNA.
    15. Centrifugare a 6.000 x g a temperatura ambiente per 1 min.
    16. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL. Aggiungere 500 μl di etanolo al 100%.
    17. Centrifugare a 6.000 x g a temperatura ambiente per 1 min.
    18. Posizionare la colonna centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL e centrifugare a 20.000 x g a temperatura ambiente per 3 minuti.
      NOTA: Questo passaggio garantisce la completa essiccazione della membrana della colonna di rotazione, poiché il trascinamento dell'etanolo nell'eluato può interferire con le applicazioni a valle.
    19. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 35 μl di tampone di eluizione dal kit di estrazione del DNA alla colonna di rotazione.
      NOTA: Il volume dell'eluato recuperato è in genere inferiore di circa 5 μl rispetto al volume del tampone di eluizione inizialmente applicato alla colonna.
    20. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    21. Centrifugare a 20.000 x g a temperatura ambiente per 1 min.
    22. Misurare la concentrazione di DNA.
  2. Quantificazione del numero di copie del genoma vettoriale mediante PCR quantitativa (qPCR)
    1. Diluire il DNA estratto preparato al punto 9.1 a una concentrazione di 25 ng/μL con acqua di grado molecolare.
    2. Progettare una coppia di primer qPCR per la quantificazione del genoma vettoriale (in questo studio è stato utilizzato tdTomato) e una coppia di primer qPCR per il gene di riferimento del topo che verrà utilizzata per quantificare i genomi diploidi nei campioni di DNA estratti (il gene agouti del topo è stato utilizzato in questo studio).
      NOTA: Le sequenze di primer utilizzate in questo studio sono le seguenti;
      tdTomato in avanti: 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdTomato al rovescio: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      mouse agouti avanti: 5'-GGCGTGGTGGGGTTGG-3'
      mouse agouti inverso: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. Per una reazione qPCR da 25 μl, mescolare 4 μl di campione di DNA diluito nella fase 9.2.1 (per un totale di 100 ng di DNA in una miscela di reazione da 25 μl), 12,5 μl di tampone di reazione qPCR 2x, 0,5 μl di primi diretti e inversi da 20 μM preparati nella fase 9.2.2 (concentrazione finale di 400 nM di ciascun primer), e 7,5 μL di acqua di grado molecolare.
    4. Misurare la concentrazione di DNA degli standard plasmidici per la qPCR quattro volte e determinare il valore medio della concentrazione di DNA.
      NOTA: In questo studio sono stati utilizzati il plasmide circolare superavvolto pAAV-CAG-tdTomato e un plasmide circolare superavvolto contenente la sequenza bersaglio PCR derivata dal gene agouti del topo sono stati utilizzati rispettivamente per la quantificazione e la normalizzazione del genoma del vettore.
    5. Preparare una serie di diluizioni seriali 1:10 di standard di DNA plasmidico che coprono un intervallo dinamico di 106.
      NOTA: Ogni campione e standard deve essere analizzato almeno in duplicato.
    6. Eseguire la qPCR utilizzando le seguenti condizioni di cicli termici: una fase iniziale di attivazione del calore a 95 °C per 10 minuti, seguita da 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s e ricottura/estensione a 60 °C per 30 s.
    7. Dopo aver completato la reazione qPCR e ottenuto i valori del numero di copie a doppio filamento (ds) dei genomi vettori e del gene di riferimento del topo nei campioni, determinare il numero di copie del genoma del vettore ds per equivalente genomico diploide (ds-vg/dge) normalizzando il numero di copie del genoma del vettore ds al numero di copie del gene di riferimento in ciascun campione in base a curve standard generate da concentrazioni note sia del genoma del vettore che del gene di riferimento.
      NOTA: Ds-vg/dge può essere determinato sulla base della seguente approssimazione che 100 ng di DNA genomico di topo rappresentano 16.900 cellule di topo diploidi (2N) (cioè 5,92 pg di DNA per cellula di topo diploide).

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

H.N. riceve una royalty sulle tecnologie relative all'AAV concesse in licenza da Takara Bio Inc. e Capsigen Inc., funge da consulente per aziende biotecnologiche, è co-fondatore di Capsigen Inc. e detiene azioni di Capsigen Inc. e Sphere Gene Therapeutics.

Ringraziamenti

Ringraziamo Guangping Gao e James M. Wilson per averci fornito il plasmide helper di AAV9 e Katja Pekrun e Mark A. Kay per il plasmide helper di AAV-KP3.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 μm PVDF syringe filterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1,5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific05-408-129
15 mL polypropylene tubeCorning352097
16% paraformaldeide (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifuge bottleFisher Scientific055641S24
2F Silicone tubingSai Infusion TechnologiesSIL-2-50
25G butterfly needleMedex Supply26708
2-metilbutaneMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaction bufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G needleBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropylene tubeCorning430291
5-0 monofilament sutureEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sutureEthiconJ489G
7,5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 μL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tubeMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibodyAbcamab199975A marker for collecting duct cells
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antibody		StressMarq BiosciencesSPC-401A marker for thick ascending limb
cells
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
antibody		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibodyAbcamab89901A marker for podocytes
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylene, 29,9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugal ultrafiltration tubeMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Ceramic bead tubeFisher Scientific15-340-154
Cesium chlorideSigma-AldrichC3032-1KG
Clamp applying forcepsFine Science Tools00071-14
Closed-loop heat padStryker Medical8002-062-012
Cotton-tipped applicatorPuritan806-WC
Cover glassFisher Scientific12-541B
Cryostat microtomeTanner ScientificTN50
Curved forcepsFine Science Tools11052-10
Curved-type micro vessel clipKleinert-Kutz65145Clamp for the renal artery and renal
vein
Dialysis cassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extraction kitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
high glucose		Corning15-013-CVDMEM-high glucose (4,5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal bovine serum (FBS)VWR89510-186
Gas-tight glass syringeHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
Heat therapy pumpKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenizerFisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
cells		Agilent240073
Ice bucketFisher Scientific07-210-104
Infusion syringe pumpHarvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Liquid blocker penTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2A marker for proximal tubules
Magnesium chloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgesic
Microscope glass slideFisher Scientific12-550-15
Mounting mediumSouthernBiotech0100-01
Needle holderFine Science Tools12501-13
OCT compoundSakura Finetek4583
Ophthalmic ointmentBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethylene tubeBD427401Inner diameter: 0,28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific10010-049
Plastic cryomoldSakura Finetek4566
Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant
(10%)		Fisher Scientific24-040-032
Polyethylene Glycol 8000Fisher ScientificBP233-1
Polyethylenimine (PEI)Polysciences23966
Povidone iodineRicca

Riferimenti

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