I disturbi della laminopatia spesso portano a cambiamenti nell'involucro nucleare, che possono causare blebbing e perdite nucleari. Questo studio presenta un metodo di immunofluorescenza per visualizzare la lamina nucleare insieme al DNA a doppio filamento (dsDNA), fornendo un mezzo per valutare la struttura e l'integrità nucleare nelle cellule di mammifero.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Rilevamento del blebbing nucleare e della perdita di DNA nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
La lamina nucleare è una rete di filamenti sottostanti la membrana nucleare, composta da lamine e proteine associate alla lamina. Svolge un ruolo fondamentale nell'architettura nucleare, nel posizionamento dei pori nucleari, nella regolazione dell'espressione genica, nell'organizzazione della cromatina, nella replicazione del DNA e nella riparazione del DNA. Le mutazioni nei geni coinvolti nell'espressione o nell'elaborazione post-traduzionale delle proteine della lamina provocano malattie genetiche note come laminopatie. In particolare, le mutazioni nei geni LMNA o ZMPSTE24 possono portare all'accumulo di forme di lamina A non completamente elaborate che conservano i gruppi farnesil e metile, che sono assenti nella lamina A completamente processata. Queste proteine della lamina A non completamente elaborate si localizzano nella membrana nucleare interna invece che nella lamina nucleare, dove risiede la lamina A matura. Le proteine della lamina mal localizzate interrompono profondamente la funzione e la struttura nucleare, spesso provocando il blebbing nucleare. Nei casi più gravi, può verificarsi una rottura nucleare, che causa una perdita di compartimentazione e la fuoriuscita di DNA genomico nel citosol. La struttura nucleare anomala e la perdita di compartimentazione possono essere identificate attraverso l'immunofluorescenza indiretta (IF) su cellule fissate. Questo studio delinea un tale metodo, impiegando anticorpi specifici contro una proteina della lamina e il DNA a doppio filamento (dsDNA) per visualizzare simultaneamente l'involucro nucleare e il DNA. Questo approccio consente una rapida valutazione dell'integrità strutturale nucleare e della potenziale fuoriuscita di DNA nucleare nel citosol.
Introduzione
La lamina nucleare è una rete di filamenti che sta alla base della membrana nucleare ed è costituita da proteine chiamate lamine. La lamina nucleare svolge un ruolo essenziale nell'architettura nucleare, nel posizionamento dei pori nucleari, nella regolazione dell'espressione genica, nell'organizzazione della cromatina, nella replicazione del DNA e nella riparazione del DNA 1,2,3. Le mutazioni nei geni che svolgono un ruolo nell'espressione delle proteine della lamina portano a malattie genetiche chiamate laminopatie3.
La de....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione dei materiali
- Autoclavare in autoclave almeno dieci vetrini coprioggetti quadrati da 22 mm x 22 mm e pinze prima di placcare le celle sui vetrini.
2. Preparazione delle soluzioni
- Terreni integrati: Preparare 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 unità/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina.
- Tampone di diluizione degli anticorpi (....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Questo studio introduce un metodo IF per visualizzare la lamina nucleare in combinazione con il DNA a doppio filamento (dsDNA). Una volta eseguita l'IF, le immagini acquisite possono essere esaminate alla ricerca di segni di blebbing nucleare e perdita di DNA.
Figura 2: Blebbing nucleare nelle cellule HeLa C.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo presentato contiene diversi passaggi critici, il più importante dei quali è il trattamento delle cellule fissate con anticorpi primari e secondari. Garantire l'uso di un anticorpo primario di buona qualità contro il bersaglio di interesse con un anticorpo secondario corrispondente corretto con fluorofori all'interno dell'intervallo del microscopio utilizzato produrrà risultati ottimali19. La qualità dell'anticorpo può influire notevolmente sui risult.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Aging grant R03AG064525 ad ASW. Vorremmo ringraziare il Dr. Jason A. Stewart per l'aiuto nel tutoraggio tecnico e il laboratorio Hui Chen per aver fornito il microscopio utilizzato. Ringraziamo anche Fabio Martinon per le linee cellulari HeLa utilizzate in questi esperimenti.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini coprioggetti quadrati da 22 mm | Propper Manufacturing Company | M8710 | Qualsiasi dimensione o forma può essere utilizzata purché possa essere fissata a un vetrino da microscopio standard. |
| 36,5% Formaldeide | Sigma Aldrich | F8775 | Reagente di fissazione. |
| 75 cm 2 Palloni | Corning | 430725U | Per colture cellulari. |
| Siero bovino Albinum (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | Tampone di diluizione degli anticorpi. |
| DMEM con 1 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio | Corning | 10-014-CV | Per colture cellulari. |
| Etanolo (200 Proof) | Decon Laboratories | 2701 | Per la disidratazione dei campioni prima del montaggio, diluito per ottenere concentrazioni multiple. |
| EVOS FL Microscopio digitale a fluorescenza invertita | Fisher Scientific | 12-563-460 | Imaging. |
| Gelatina di pesce | Sigma Aldrich | G7041 | Tampone di diluizione degli anticorpi. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Mezzo di montaggio per prevenire il fotosbiancamento. |
| Parafilm (4 pollici) | Fisher Scientific | 13-374-12 | Qualsiasi dimensione può essere sostituita, purché i vetrini coprioggetti utilizzati possano adattarsi. |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15-140-122 | Per colture cellulari. |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | N/A | N/A | Prodotto e sterilizzato in laboratorio per colture e soluzioni tissutali. |
| Siero fetale bovino premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Per colture cellulari. |
| Vetrini per microscopio Superfrost Premium | Fisher Scientific | 12-544-7 | È possibile utilizzare qualsiasi vetrino per microscopio standard. |
| Piastre a fondo piatto a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale | Falcon | 353046 | per la coltura cellulare. |
| TritonX-100 | Thermofisher Scientific | A16046. AP | Per il lavaggio. |
| Tripsina-EDTA (0,5%) | Gibco | 15-400-054 | Per colture cellulari. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | 9005-64-5 | Reagente per permeazione cellulare. |
Riferimenti
- Navarro, C. L., et al. New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update. Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).
- Dittmer, T. A., Misteli, T. The lamin protein fami....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
