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Articolo metodologico

Rilevamento del blebbing nucleare e della perdita di DNA nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza

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DOI:

10.3791/67719

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17 gennaio 2025

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

I disturbi della laminopatia spesso portano a cambiamenti nell'involucro nucleare, che possono causare blebbing e perdite nucleari. Questo studio presenta un metodo di immunofluorescenza per visualizzare la lamina nucleare insieme al DNA a doppio filamento (dsDNA), fornendo un mezzo per valutare la struttura e l'integrità nucleare nelle cellule di mammifero.

Abstract

La lamina nucleare è una rete di filamenti sottostanti la membrana nucleare, composta da lamine e proteine associate alla lamina. Svolge un ruolo fondamentale nell'architettura nucleare, nel posizionamento dei pori nucleari, nella regolazione dell'espressione genica, nell'organizzazione della cromatina, nella replicazione del DNA e nella riparazione del DNA. Le mutazioni nei geni coinvolti nell'espressione o nell'elaborazione post-traduzionale delle proteine della lamina provocano malattie genetiche note come laminopatie. In particolare, le mutazioni nei geni LMNA o ZMPSTE24 possono portare all'accumulo di forme di lamina A non completamente elaborate che conservano i gruppi farnesil e metile, che sono assenti nella lamina A completamente processata. Queste proteine della lamina A non completamente elaborate si localizzano nella membrana nucleare interna invece che nella lamina nucleare, dove risiede la lamina A matura. Le proteine della lamina mal localizzate interrompono profondamente la funzione e la struttura nucleare, spesso provocando il blebbing nucleare. Nei casi più gravi, può verificarsi una rottura nucleare, che causa una perdita di compartimentazione e la fuoriuscita di DNA genomico nel citosol. La struttura nucleare anomala e la perdita di compartimentazione possono essere identificate attraverso l'immunofluorescenza indiretta (IF) su cellule fissate. Questo studio delinea un tale metodo, impiegando anticorpi specifici contro una proteina della lamina e il DNA a doppio filamento (dsDNA) per visualizzare simultaneamente l'involucro nucleare e il DNA. Questo approccio consente una rapida valutazione dell'integrità strutturale nucleare e della potenziale fuoriuscita di DNA nucleare nel citosol.

Introduzione

La lamina nucleare è una rete di filamenti che sta alla base della membrana nucleare ed è costituita da proteine chiamate lamine. La lamina nucleare svolge un ruolo essenziale nell'architettura nucleare, nel posizionamento dei pori nucleari, nella regolazione dell'espressione genica, nell'organizzazione della cromatina, nella replicazione del DNA e nella riparazione del DNA 1,2,3. Le mutazioni nei geni che svolgono un ruolo nell'espressione delle proteine della lamina portano a malattie genetiche chiamate laminopatie3.

La dermopatia restrittiva (RD) è una grave malattia della laminopatia prevalentemente causata da mutazioni eterozigoti composte che creano codoni di terminazione prematura nel gene ZMPSTE24 4, portando all'assenza della metalloproteasi ZMPSTE24. Questa laminopatia è caratterizzata da ritardo della crescita intrauterina, pelle tesa e rigida, bocca di piccole dimensioni, capelli sottili e difetti di mineralizzazione ossea1. I pazienti con RD di solito non superano la prima settimana di vita a causa dell'insufficienza polmonare1. Altri due disturbi della laminopatia noti come sindrome di Hutchinson-Gilford Progeria atipica (AT-HGPS) e displasia mandibuloacrale di tipo B (MAD-B) comportano una ridotta espressione ZMPSTE24 e sono associati a una ridotta durata della vita e mostrano somiglianze con i disturbi dell'invecchiamento precoce5. La proteasi ZMPSTE24 che viene influenzata in queste laminopatie è vitale nella modifica post-traduzionale della lamina A, che è un componente critico della lamina nucleare. ZMPSTE24 carenza provoca l'accumulo di una forma farnesilata non completamente elaborata di lamina A, nota come prelamina A2.

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Figura 1: Elaborazione della lamina A in condizioni normali vs. Cellule RD. Via di elaborazione della lamina A nelle cellule normali (a sinistra) e elaborazione alterata della lamina A nelle cellule RD o carenti di ZMPSTE (a destra). Sono indicati i gruppi farnesil (Fa) e metile (Me). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come si vede nella Figura 1, nel normale processo della lamina A, un gruppo farnesilico (lipidico) è attaccato a un residuo di cisteina vicino al C-terminale, seguito dalla scissione proteolitica di tre amminoacidi C-terminali 3,6. Il residuo di cisteina viene quindi metilato. Queste due modifiche consentono alla prelamina A di essere indirizzata alla membrana nucleare interna2. ZMPSTE24 quindi esegue una reazione di scissione in cui gli ultimi 15 amminoacidi C-terminali, insieme ai gruppi farnesil e metilico, vengono rimossi per produrre la proteina matura della lamina A, che viene consegnata alla lamina nucleare 6,7,8. Nella RD, AT-HGPS e MAD-B, la fase finale del processamento non avviene in modo efficace poiché la ZMPSTE24 metalloproteinasi è carente o non completamente funzionante 8,9. Ciò si traduce nell'accumulo di prelamina A, che rimane permanentemente farnesilata e metilata9. Questi ultimi gruppi fanno sì che la prelamina A si attacchi alla membrana nucleare interna invece di localizzarsi nella lamina nucleare, dove la lamina A matura dovrebbe infine risiedere, come si vede nella Figura 1. Pertanto, la carenza di ZMPSTE ha effetti profondi su una varietà di funzioni nucleari, insieme alla struttura nucleare10,11,12,13,14,15. Queste alterazioni della struttura nucleare possono includere il blebbing nucleare e persino la rottura nucleare che può provocare la fuoriuscita di DNA nel citosol e l'ingresso di citosol nel nucleo. I nuclei di forma aberrante sono infatti un segno distintivo dei disturbi della laminopatia, insieme a numerosi altri fenotipi causati da un difetto del trattamento della prelamina A16,17. I difetti nella lamina nucleare portano a una moltitudine di impatti dannosi, tra cui l'errata localizzazione del controllo di qualità delle proteine nucleari e delle proteine di riparazione del DNA nel nucleoplasma, che, a sua volta, si traduce in numerosi difetti nella funzione nucleare18. È importante disporre di una tecnica semplice che possa aiutare a identificare e monitorare questi segni distintivi delle laminopatie per facilitare la ricerca sullo sviluppo di approcci terapeutici volti a migliorare i fenotipi della laminopatia. Per i topi con laminopatie, è stato dimostrato che l'eliminazione del blebbing nucleare è correlata con l'eliminazione generalizzata dei fenotipi di laminopatia16. Una tecnica che consente il monitoraggio dell'integrità nucleare nelle cellule umane potrebbe migliorare lo studio di potenziali trattamenti per eliminare o migliorare significativamente i fenotipi della malattia.

L'immunofluorescenza indiretta (IF) è una tecnica sensibile e ampiamente utilizzata che utilizza sia un anticorpo primario non marcato che un anticorpo secondario marcato con fluoroforo che riconosce l'anticorpo primario per rilevare un bersaglio di interesse19. I metodi IF possono fornire un potente mezzo per visualizzare specifici componenti e strutture intracellulari. È anche possibile che più di una molecola di anticorpo secondario possa interagire con l'anticorpo primario, con conseguente amplificazione del segnale19. L'IF indiretta è una tecnica versatile che consente anche la rilevazione di più anticorpi primari con un insieme relativamente piccolo di anticorpi secondari poiché gli anticorpi secondari vengono sollevati contro il dominio Fc dell'anticorpo primario, che è conservato all'interno della specie19.

Questo articolo descrive un metodo indiretto (IF) per valutare il blebbing nucleare e la perdita di DNA in cellule carenti di ZMPSTE24, utilizzando anticorpi contro il DNA a doppio filamento (dsDNA) e la lamina B1 per rilevare rispettivamente il DNA e la lamina nucleare. Per dimostrare l'utilità di questo approccio, la procedura è stata applicata a una linea cellulare HeLa con espressione ZMPSTE24 knocked-out, nonché a una linea cellulare HeLa che esprime ZMPSTE24, e sono stati confrontati i risultati per le due linee cellulari.

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Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei materiali

  1. Autoclavare in autoclave almeno dieci vetrini coprioggetti quadrati da 22 mm x 22 mm e pinze prima di placcare le celle sui vetrini.

2. Preparazione delle soluzioni

  1. Terreni integrati: Preparare 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 unità/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina.
  2. Tampone di diluizione degli anticorpi (ADB): sciogliere 2 g di albumina sierica bovina (BSA) e 1 g di gelatina di pesce in 80 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Portare a 100 ml con PBS una volta che BSA e gelatina di pesce sono sciolti.
  3. 1x PBS-Tween (PBS-T): Preparare 500 ml di PBS e 0,5 ml di Tween. Porre a bagnomaria a 37 °C fino a quando Tween può essere facilmente miscelato nella soluzione.

3. Crescita delle cellule desiderate

NOTA: Le cellule HeLa sono state coltivate in questo protocollo per confluire all'interno di un pallone T75.

  1. Spruzzare sei vetrini coprioggetti con etanolo al 70% e lasciarli asciugare all'aria su un panno privo di lanugine. Posizionare i vetrini coprioggetti in una piastra sterile a 6 pozzetti utilizzando una pinza, un vetrino coprioggetti per pozzetto.
  2. Aggiungere 2 mL di DMEM integrato a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
  3. Aspirare i terreni dalle cellule e lavare le cellule aggiungendo 15 mL di PBS al pallone, agitando delicatamente. Aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA (tripsina).
    1. Rivestire le cellule con tripsina e rimettere il matraccio in un incubatore umidificato a 37 °C e CO2 al 5% per 2 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dal pallone.
  4. Aggiungere 8 mL di DMEM integrato al pallone per raccogliere le cellule tripsinizzate. Pipettare su e giù un paio di volte per separare le cellule agglomeranti. Raccogliere la sospensione cellulare nel pallone e metterla in una provetta di polistirene da 15 mL.
  5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  6. Aggiungere 500.000 cellule, goccia a goccia, direttamente su ciascuno dei vetrini coprioggetti nella piastra a 6 pozzetti. Lasciare crescere le cellule durante la notte a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore umidificato.

4. Fissazione cellulare e permeabilizzazione

  1. Preparare la soluzione di formaldeide al 4% fresca prima dell'uso: aggiungere 2 ml di soluzione di formaldeide al 37,5% in 18 ml di PBS. Mescolare accuratamente.
  2. Preparare la soluzione di permeabilizzazione fresca prima dell'uso: aggiungere 100 μL di Triton-X in 20 mL di PBS. Lasciare incubare in un bagnomaria a 37 °C per alcuni minuti fino a quando il Triton-X non si dissolve nella soluzione. Mescolare accuratamente.
  3. Aspirare il terreno nei pozzetti della piastra. Lavare le celle una volta con 2 ml di PBS. Aspirare tutto il PBS dai pozzi.
  4. Aggiungere 2 mL di soluzione di formaldeide al 4% in ogni pozzetto. Lasciare riposare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare completamente il 4% di formaldeide dai pozzetti.
  5. Lavare le celle 3 volte con 2 mL di PBS. Rimuovere completamente il PBS dai pozzetti dopo ogni lavaggio.
  6. Aggiungere 2 mL di soluzione di permeabilizzazione a ciascun pozzetto. Lasciare riposare per 10 minuti a RT. Aspirare completamente la soluzione di permeabilizzazione.
  7. Lavare le celle 3 volte con 2 mL di PBS. Aspirare completamente il PBS dopo i primi due lavaggi, lasciando il PBS nei pozzetti dopo il terzo lavaggio.
    NOTA: Le cellule possono essere conservate nell'ultimo lavaggio PBS a 4 °C per alcune settimane dopo questa fase, assicurandosi che la piastra sia sigillata con un film di paraffina per evitare l'evaporazione del liquido. Se la procedura può essere continuata, questo passaggio può essere saltato.

5. Colorazione in immunofluorescenza

  1. Rimuovi tutto il PBS dai pozzi. Bloccare le cellule aggiungendo 2 mL di ADB a ciascun pozzetto e incubare a RT, oscillando per 30 minuti.
  2. Verso la fine del tempo di blocco di 30 minuti, miscelare la diluizione dell'anticorpo primario in ADB (diluizione 1:1.000 sia per gli anticorpi Lamina B1 che per gli anticorpi dsDNA, Tabella 1). Sono necessari 75 μL per ogni vetrino coprioggetti, quindi 600 μL di ADB, 0,6 μL di anticorpo primario della lamina B e 0,6 μL di anticorpo dsDNA devono essere miscelati per sei vetrini. Vortice accuratamente.
  3. Rimuovere l'ADB dai pozzetti. Su una superficie piana, fissare con del nastro adesivo un pezzo di pellicola di paraffina sufficientemente grande da stendere tutti i vetrini coprioggetti in lavorazione.
  4. Per ogni vetrino coprioggetti, aggiungere 75 μl di diluizione dell'anticorpo primario sul film di paraffina, assicurandosi che non vengano pipettate bolle nell'ADB. Quindi, posizionare il vetrino coprioggetti con la cellula rivolta verso il basso sulla gocciolina di ADB usando una pinza.
  5. Coprire i vetrini coprioggetti in incubazione con il coperchio della piastra a pozzetti e lasciare incubare per 1 ora a RT.
  6. Rimuovere i vetrini coprioggetti dalla pellicola di paraffina usando una pinza e riposizionare i vetrini coprioggetti nella piastra a 6 pozzetti, con il lato della cella rivolto verso l'alto.
  7. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 2 ml di PBS-T, facendo oscillare per 3-5 minuti ogni volta. Rimuovere tutto il PBS-T dai pozzetti dopo ogni lavaggio.
  8. Durante l'ultimo lavaggio, preparare la diluizione dell'anticorpo secondario (1:1.000 per entrambi i rispettivi anticorpi secondari, Tabella 1). Sono necessari 75 μl per ogni vetrino coprioggetti, pertanto 600 μl di ADB e 0,6 μl di entrambi gli anticorpi secondari marcati con Alexa Fluor devono essere miscelati per sei vetrini. Vortice accuratamente. Coprire il più possibile la diluizione dell'anticorpo secondario dalla luce.
AnticorpoFonteSocietàRiferimento
Anticorpo marcatore dsDNA (HYB331-01)Monoclonale di topoSanta CruzSC-58749
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo IgG di capra (H+L), Alexa Fluor Plus 488CapraThermoFisherCodice: A32723
Anticorpo secondario anti-topo IgG di capra (H+L) altamente adsorbito, Alexa Fluor Plus 405CapraInvitrogenCodice A31553
Anticorpo policlonale della lamina B1ConiglioProteintech12987-1-AP
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio di capra IgG (H+L), Alexa Fluor 594CapraInvitrogenCodice A11037

Tabella 1: Anticorpi. Elenco di tutti gli anticorpi utilizzati in questo protocollo.

  1. Rimuovere tutti i PBS-T dall'ultimo lavaggio. Incubare i vetrini coprioggetti nella diluizione secondaria dell'anticorpo su pellicola di paraffina, come nella fase 5, per 30 minuti a RT. Proteggere dalla luce per questa fase e per tutte le fasi rimanenti. Una piccola scatola può essere utilizzata per schermare la luce. Assicurati di lavorare rapidamente quando necessario per aggiungere o rimuovere soluzioni dai pozzetti.
  2. Rimuovere i vetrini coprioggetti dalla pellicola di paraffina usando una pinza e riposizionare i vetrini coprioggetti nella piastra a 6 pozzetti, con la cella rivolta verso l'alto.
  3. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 2 ml di PBS-T. Rimuovere tutto il PBS-T dai pozzetti dopo ogni lavaggio.
  4. Disidratare i vetrini con una serie di etanolo (70%, 90%, 100%). Inizia aggiungendo 2 ml di etanolo al 70% a ciascun pozzetto. Lasciare riposare per 1-2 minuti e rimuovere tutto l'etanolo dai pozzetti. Ripetere con le percentuali di etanolo rimanenti.
  5. Rimuovere i vetrini coprioggetti dai pozzetti usando una pinza e lasciarli asciugare all'aria, al riparo dalla luce, su un panno privo di lanugine.
  6. Montare il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso il basso sui vetrini del microscopio utilizzando 20 μl di terreno di montaggio per vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare per una notte, al riparo dalla luce.

6. Acquisizione delle immagini

  1. Prima dell'imaging, rivestire i bordi dei vetrini coprioggetto con un sottile strato di smalto trasparente (qualsiasi marca o tipo sarà sufficiente). Lasciare asciugare all'aria, al riparo dalla luce.
    NOTA: Le istruzioni per l'uso di un microscopio per l'imaging variano a seconda del microscopio utilizzato. La risoluzione della fotocamera del microscopio utilizzato qui è di 1280 x 960 pixel. Una risoluzione simile o migliore sarà sufficiente.
  2. Prima di mettere un vetrino sul tavolino del microscopio, è necessario regolare le impostazioni di salvataggio dei file. Accendi il microscopio e inserisci un'unità USB. Regolare le impostazioni di salvataggio all'interno delle impostazioni del microscopio e assicurarsi che tutti i canali (GFP e RFP) vengano salvati separatamente e che le immagini vengano inviate nella posizione corretta sull'unità USB.
    NOTA: Creare una cartella sull'unità USB e assegnare a ciascun vetrino coprioggetto il proprio nome per riferimento futuro.
  3. Prima dell'imaging, spruzzare una salvietta priva di lanugine con etanolo al 70% e pulire delicatamente il retro dei vetrini. Pulire delicatamente la parte anteriore delle diapositive, assicurandosi che venga esercitata una pressione minima.
  4. Posizionare un vetrino pulito sul microscopio, i vetrini coprioggetti rivolti verso il basso. Coprire con la scatola dello schermo luminoso.
  5. Utilizzando una lente dell'obiettivo 40x, utilizzare il canale appropriato (RFP per l'anticorpo della lamina B1 qui impiegato) per localizzare i nuclei sullo schermo del microscopio. Regola l'intensità della luce a circa il 50% per iniziare.
  6. Per verificare la presenza di aree sovrasature, selezionare l'opzione Colore disattivato e assicurarsi che nessuna area del vetrino coprioggetti abbia un segnale rosso nell'impostazione in bianco e nero. Se c'è molto segnale rosso, abbassare l'intensità della luce fino a quando non viene visualizzato il segnale rosso minimo.
    NOTA: Un segnale rosso indica una sovrasaturazione. Se i nuclei appaiono appena visibili, aumentare l'intensità con incrementi del 10% fino a raggiungere un'intensità appropriata senza sovrasaturazione.
  7. Controllare tutti gli altri vetrini coprioggetti con la stessa intensità per assicurarsi che non siano eccessivamente saturi. Controllare tutti i vetrini coprioggetti con l'altro canale utilizzando lo stesso processo di cui sopra (GFP per l'anticorpo dsDNA utilizzato qui).
  8. Registra le intensità della luce per ogni canale. Assicurarsi che tutte le intensità luminose per ciascun canale siano mantenute costanti durante il processo di imaging.
  9. Immagine di ogni vetrino coprioggetti singolarmente. Inizia con il primo canale, metti a fuoco i nuclei e cattura l'immagine.
  10. Cambia con cautela i canali e riporta le celle a fuoco. Una volta messa a fuoco, cattura l'immagine.
  11. Dopo aver acquisito le immagini nei canali necessari (GFP e RFP), selezionare Sovrapponi per osservare l'immagine unita e assicurarsi che la diapositiva non si sia mossa durante lo scatto. Se i canali non si sovrappongono, ripetere il canale necessario fino a quando le immagini non si allineano.
  12. Salva l'immagine facendo clic sull'icona dell'unità flash . Spostarsi in un punto diverso del vetrino coprioggetti per continuare l'imaging.
    NOTA: Assicurarsi che ogni volta venga visualizzata un'area diversa del vetrino coprioggetti per evitare di catturare ripetutamente la stessa regione. Si consiglia di iniziare l'imaging nell'angolo in alto a sinistra del vetrino coprioggetti e di muoversi a "S" per garantire una copertura completa senza duplicazioni.

7. Analisi dei dati

  1. I dati ottenuti con questo metodo sono visivi. Esamina le immagini alla ricerca di segni di perdita di DNA o blebbing nucleare. Esempi di blebbing e perdite sono mostrati nella sezione dei risultati rappresentativi.

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Risultati

Questo studio introduce un metodo IF per visualizzare la lamina nucleare in combinazione con il DNA a doppio filamento (dsDNA). Una volta eseguita l'IF, le immagini acquisite possono essere esaminate alla ricerca di segni di blebbing nucleare e perdita di DNA.

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Figura 2: Blebbing nucleare nelle cellule HeLa C...

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Discussione

Il protocollo presentato contiene diversi passaggi critici, il più importante dei quali è il trattamento delle cellule fissate con anticorpi primari e secondari. Garantire l'uso di un anticorpo primario di buona qualità contro il bersaglio di interesse con un anticorpo secondario corrispondente corretto con fluorofori all'interno dell'intervallo del microscopio utilizzato produrrà risultati ottimali19. La qualità dell'anticorpo può influire notevolmente sui risult...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Aging grant R03AG064525 ad ASW. Vorremmo ringraziare il Dr. Jason A. Stewart per l'aiuto nel tutoraggio tecnico e il laboratorio Hui Chen per aver fornito il microscopio utilizzato. Ringraziamo anche Fabio Martinon per le linee cellulari HeLa utilizzate in questi esperimenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetrini coprioggetti quadrati da 22 mmPropper Manufacturing CompanyM8710Qualsiasi dimensione o forma può essere utilizzata purché possa essere fissata a un vetrino da microscopio standard.
36,5% FormaldeideSigma AldrichF8775Reagente di fissazione.
75 cm 2 PalloniCorning430725UPer colture cellulari.
Siero bovino Albinum (BSA)Fisher Scientific9048-46-8Tampone di diluizione degli anticorpi.
DMEM con 1 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodioCorning10-014-CVPer colture cellulari.
Etanolo (200 Proof)Decon Laboratories2701Per la disidratazione dei campioni prima del montaggio, diluito per ottenere concentrazioni multiple.
EVOS FL Microscopio digitale a fluorescenza invertitaFisher Scientific12-563-460Imaging.
Gelatina di pesceSigma AldrichG7041Tampone di diluizione degli anticorpi.
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Mezzo di montaggio per prevenire il fotosbiancamento.
Parafilm (4 pollici)Fisher Scientific13-374-12Qualsiasi dimensione può essere sostituita, purché i vetrini coprioggetti utilizzati possano adattarsi.
Penicillina-StreptomicinaGibco15-140-122Per colture cellulari.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)N/AN/AProdotto e sterilizzato in laboratorio per colture e soluzioni tissutali.
Siero fetale bovino premium (FBS)Atlanta BiologicalsS11150Per colture cellulari.
Vetrini per microscopio Superfrost PremiumFisher Scientific12-544-7È possibile utilizzare qualsiasi vetrino per microscopio standard.
Piastre a fondo piatto a 6 pozzetti trattate con coltura tissutaleFalcon353046per la coltura cellulare.
TritonX-100Thermofisher ScientificA16046. APPer il lavaggio.
Tripsina-EDTA (0,5%)Gibco15-400-054Per colture cellulari.
Tween 20Fisher Scientific9005-64-5Reagente per permeazione cellulare.

Riferimenti

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Ristampe e permessi

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Rilevamento del blebbing nucleare e della perdita di DNA nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza
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