Il modello di lesione del midollo osseo murino è uno strumento utile per studiare l'osteogenesi postnatale attraverso l'ossificazione intramembranosa. Questo protocollo chirurgico semplificato descrive la procedura di ablazione del midollo osseo per la valutazione a valle della formazione di nuovo osso e delle risposte cellulari dopo la lesione.
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Articolo metodologico
Metodologia migliorata per lo studio dell'osteogenesi postnatale tramite ossificazione intramembranosa in un modello di lesione del midollo osseo murino
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Le lesioni delle ossa lunghe guariscono attraverso le vie di formazione dell'osso endocondrale o intramembranoso. A differenza della via endocondrale che richiede un modello di cartilagine, il processo di ossificazione intramembranosa comporta la conversione diretta delle cellule staminali scheletriche e progenitrici (SSPC) in osteoblasti che formano l'osso. Esistono metodi chirurgici limitati per modellare questo processo nei topi sperimentali. Qui, abbiamo migliorato un modello di lesione del midollo osseo nei topi per facilitare lo studio della riparazione ossea attraverso l'ossificazione intramembranosa e per valutare i regolatori postnatali dell'osteogenesi. Questo metodo è altamente riproducibile e di facile utilizzo e consente la valutazione temporale della formazione di nuovo osso in un breve periodo (3-7 giorni dopo l'infortunio) utilizzando la micro-tomografia computerizzata (μCT) e l'istologia della sezione congelata. Inoltre, i contributi degli SSPC e degli osteoblasti maturi possono essere facilmente valutati utilizzando una combinazione di topi reporter fluorescenti e questo modello di lesione del midollo osseo intramembranoso. In contesti clinici, la formazione di osso intramembranoso è rilevante per la guarigione di difetti critici di dimensioni, fratture stabilizzate, difetti corticali, traumi da resezioni tumorali e sostituzioni articolari.
Introduzione
Le lesioni delle ossa lunghe guariscono attraverso la via di formazione dell'osso endocondrale o intramembranoso. A differenza della via endocondrale, che richiede un passaggio precursore della cartilagine, la riparazione ossea tramite ossificazione intramembranosa comporta la conversione diretta delle cellule staminali scheletriche e progenitrici (SSPCS) in osteoblasti che formano l'osso1. Clinicamente, questo processo è rilevante per la guarigione ossea in una varietà di contesti, tra cui difetti di dimensioni critiche, fratture stabilizzate, difetti corticali, osteogenesi da distrazione, traumi da resezioni tumorali e osteointegrazione di impianti di sostituzione articolare 2,3. È interessante notare che, negli studi su pazienti con fratture delle ossa lunghe, il 66%-82% presentava fratture scomposte, che richiedevano dispositivi di fissazione per stabilizzare l'osso 4,5. Queste ossa rigidamente stabilizzate guariscono principalmente attraverso l'ossificazione intramembranosa poiché le estremità ossee rotte entrano in contatto diretto tra loro 6,7. Tuttavia, la regolazione meccanicistica della rigenerazione ossea intramembranosa rimane relativamente poco studiata rispetto alla formazione ossea attraverso le vie endocondrali. Le terapie approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) per aumentare la guarigione ossea sono ostacolate da un'efficacia clinica limitata e da costi elevati e sono associate a effetti avversi significativi8.
L'ablazione meccanica del midollo osseo fornisce un modello prezioso per lo studio della formazione ossea intramembranosa. Questo semplice modello di lesione consente di studiare la rigenerazione ossea nel midollo osseo senza interrompere l'osso corticale. Dopo l'ablazione del midollo osseo, il processo di guarigione prevede fasi distinte ma sovrapposte. La fase iniziale si verifica nei primi 1-5 giorni e prevede la formazione di coaguli e l'infiammazione, in cui le cellule infiammatorie e le citochine iniziano la guarigione. Dal 3° al 14° giorno, la seconda fase è caratterizzata dalla rigenerazione, che comprende la neovascolarizzazione, la migrazione e la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC), la differenziazione osteoblastica e la formazione di ossa intrecciate. La fase finale di rimodellamento inizia circa 10 giorni dopo l'intervento, con il tessuto osseo in fase di maturazione e ristrutturazione fino a quando il midollo non è completamente ripristinato entro il giorno 569. Questa rapida sequenza temporale di guarigione rende il modello di ablazione del midollo osseo ideale per studiare le risposte precoci di riparazione ossea, in particolare durante i periodi critici dell'infiammazione, del reclutamento delle cellule progenitrici e della differenziazione degli osteoblasti. Utilizzando tecniche come l'istologia, la citometria a flusso e l'analisi quantitativa μCT, è possibile valutare le risposte cellulari e la formazione ossea nelle prime fasi di riparazione. Utilizzando le tecniche sopra menzionate, il modello di ablazione del midollo osseo può fornire informazioni sui meccanismi di rigenerazione ossea intramembranosa e aiutare a identificare i bersagli terapeutici chiave per migliorare la guarigione ossea.
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Protocollo
Le seguenti procedure sono state eseguite con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Connecticut Health Center. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in condizioni sterili, come indicato dalle linee guida del National Institutes of Health (NIH). Il dolore e il rischio di infezioni sono stati gestiti con analgesici e antisettici adeguati per garantire un esito positivo.
1. Preparazione dell'area chirurgica e degli strumenti
- Prepara la sala operatoria disinfettando le superfici di lavoro con un detergente disinfettante di livello clinico.
NOTA: Il chirurgo deve indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), inclusi guanti sterili monouso, cuffia per capelli, camice e maschera. - Preparare un termoforo coperto con un tampone chirurgico sterile. Raccogli e sistema tutti gli strumenti e i reagenti sterili (Tabella dei materiali) con un comodo accesso.
2. Anestesia preoperatoria
- Pesare tutti i topi prima dell'intervento chirurgico. Calcolare i volumi di analgesico da utilizzare in base alla formulazione disponibile di buprenorfina.
- Assemblare un'unità di anestesia animale all'interno dello spazio di lavoro sterile, che include una camera di induzione e un gruppo cono-naso. Impostare l'emissione di ossigeno a 2 L min-1 e l'isoflurano all'1,5-3% (v/v) a seconda dell'età e del peso del topo.
- Una volta che il topo è sedato, rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posizionarlo su un tampone chirurgico sterile in posizione supina. Applicare lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi. Posiziona il cono del naso sopra la testa. Verificare che il topo sia adeguatamente anestetizzato pizzicando delicatamente la punta. Assicurarsi che non vi sia alcuna risposta riflessa degli arti posteriori prima di procedere.
- Prima dell'intervento chirurgico, rimuovere brevemente il topo dal cono nasale per iniettare la dose totale di buprenorfina a rilascio prolungato per via sottocutanea; La dose totale è di 3,25 mg/kg.
3. Descrizione della procedura chirurgica
NOTA: Questa procedura chirurgica utilizza topi maschi e femmine C57BL/6 di età compresa tra 10 settimane e 24 settimane. La procedura può essere eseguita su topi di età compresa tra 6 settimane e 33 settimane e su vari ceppi consanguinei, come dimostrato da altri10,11. I topi più giovani possono richiedere aghi di lunghezza inferiore, mentre i topi più anziani o più grandi possono richiedere un ago più lungo.
- Riempire una siringa da 3 ml dotata di un ago da 26 G con soluzione fisiologica sterile. Mettilo da parte.
- Rimuovere il pelo dall'arto posteriore su cui verrà eseguita la procedura con tosatrici elettriche o a batteria (lama #40) e rimuovere il pelo sciolto dal campo chirurgico. Utilizzando applicatori sterili con punta in cotone, trattare il sito chirurgico con uno scrub a base di iodio (10% di iodio povidone), seguito da alcol isopropilico al 70%. Strofinare il sito chirurgico partendo dal centro del ginocchio e facendo una spazzata circolare verso l'esterno. Lasciare asciugare il sito. Ripeti i passaggi di scrub 3 volte.
- Posizionare il mouse sulla schiena e flettere il ginocchio della gamba operativa. Tenere la gamba del topo nella mano non dominante in modo che il ginocchio sia piegato sul dito medio, il secondo dito poggi sul femore e il pollice poggi sulla tibia.
- Fai una piccola incisione orizzontale poco profonda appena sotto la rotula usando un bisturi.
NOTA: Questo passaggio migliora la visualizzazione del sito di inserimento. Con l'esperienza, questo passaggio può essere saltato. - Individua lo spazio articolare posizionando l'ago orizzontalmente sul ginocchio piegato e tastando lo spazio tra il femore e la tibia. Utilizzando questo sito anatomico per guidare, prendi un ago da 25 G e fora manualmente (ruotando l'ago e applicando contemporaneamente una pressione moderata sull'ago) nel femore distale dal ginocchio verso il lato prossimale. Inserire l'ago attraverso o intorno alla rotula.
- Radiografare il topo per assicurarsi che l'ago sia stato posizionato in modo appropriato nella cavità midollare, il più vicino possibile al centro (Figura 1).
- Rimuovere l'ago da 25 G e inserire immediatamente un ago da 26 G nello stesso foro all'interno della cavità midollare. Alesare i lati della cavità midollare con un movimento circolare almeno 5 volte fino a quando non risulta liscia. Mantenere costante il numero di movimenti di alesatura tra ciascun mouse.
NOTA: I passaggi 3.5 e 3.7 possono causare lesioni da ago al chirurgo se non maneggiati con cura. - Rimuovere l'ago da 26 G e sostituire l'ago da 26 G collegato alla siringa di soluzione fisiologica. Sciacquare la cavità fino a quando il riflusso non diventa limpido. Ciò richiede in genere 1,5-2 ml di soluzione fisiologica. Rimuovere la siringa e l'ago e smaltirli in modo sicuro in un contenitore appuntito.
NOTA: Non ci deve essere resistenza quando si spinge il fluido. In tal caso, reinserire l'ago per assicurarsi che si trovi all'interno della cavità. Potrebbe essere necessario estrarre l'ago a metà. - Chiudere la ferita cutanea utilizzando una sutura adesiva topica.
4. Assistenza postoperatoria
- Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, somministrare la restante metà dose di buprenorfina a rilascio prolungato utilizzando il dosaggio del passaggio 2.4.
NOTA: La buprenorfina a rilascio prolungato fornisce sollievo dal dolore fino a 72 ore. - Monitora gli animali sul termoforo per segni di respirazione normale e senza ostacoli fino al risveglio dall'intervento chirurgico. Una volta deambulanti, riporta i topi nella loro gabbia.
- Continua a monitorare i topi una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per assicurarti che stiano guarendo correttamente e abbiano piena mobilità, osservando i segni di dolore.
5. Elaborazione delle ossa per la scansione e l'analisi μCT
- Eutanasia dei topi secondo il metodo di eutanasia umana regolato e approvato dall'IACUC o da altre politiche istituzionali applicabili. In questo caso, è stato utilizzato il metodo di eutanasia primaria di inalazione di CO2 , seguito da un metodo secondario di lussazione cervicale.
- Raccogli i femori staccando la pelle intorno agli arti posteriori e rimuovendo l'intero arto all'altezza dell'articolazione dell'anca.
- Inserire ogni arto tra due spugne in una cassetta di inclusione. Trasferire le ossa nelle loro cassette in una soluzione di formalina al 10% e fissarle a 4 °C per 5-7 giorni, considerando l'età e le dimensioni del topo.
NOTA: Sia la sovrafissazione che la sottofissazione determinano una scarsa risoluzione del midollo. - Dopo il fissaggio, lavare le cassette in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti 3 volte.
- Rimuovere gli arti dalle cassette e tagliare via i muscoli usando un bisturi, se necessario.
NOTA: A seconda delle applicazioni a valle, una manipolazione brusca può distruggere lo strato periostale dell'osso. - Separare il femore al ginocchio tagliando con cura i legamenti usando piccole forbici chirurgiche o un bisturi.
NOTA: Le tibie possono essere utilizzate per altre applicazioni o scartate. - Trasferire i femori in provette coniche da 1,7 mL o 15 mL in una soluzione di etanolo al 70%. Le ossa possono rimanere in etanolo al 70% a 4 °C fino al momento della scansione μCT.
- Scansiona e valuta i femori per i parametri trabecolari, producendo dati qualitativi e quantitativi.
6. Lavorazione di ossa per il sezionamento congelato e l'istologia
NOTA: Le ossa possono essere lavorate per il sezionamento congelato e l'istologia dopo essere state sottoposte a scansione μCT. La scansione non influisce sulla marcatura fluorescente o sulla successiva colorazione degli anticorpi.
- Trasferire le ossa da etanolo al 70% a PBS e lavare 3 volte, 5 minuti per lavaggio.
- Incubare in una serie di soluzioni di saccarosio dal 10%, 20% al 30% in PBS a 4 °C per una notte ad ogni concentrazione. Conservare le ossa in saccarosio al 30% per un massimo di 5 giorni a 4 °C o in questa soluzione a -20 °C per 6-12 mesi fino al momento dell'inclusione.
NOTA: L'uso di un gradiente di saccarosio si traduce in una migliore penetrazione nei tessuti. Dopo il passaggio 6.1, le ossa possono essere poste direttamente in una soluzione di saccarosio al 30% durante la notte. - Incorporare le ossa in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzando stampi per crioinclusione. Conservare a -80 °C fino al momento della sezionamento.
- Sezionare le ossa incorporate utilizzando il metodo del nastro criografico con temperatura del criostato impostata tra -24 °C e -26 °C.
- Far aderire le sezioni del criofilm a un vetrino adesivo utilizzando un adesivo ottico e polimerizzarlo fino a indurirlo utilizzando un reticolante ultravioletto (UV).
7. Elaborazione per citometria a flusso
NOTA: Questo protocollo è compatibile con una varietà di anticorpi. Per caratterizzare le cellule staminali scheletriche e le cellule progenitrici, si raccomanda di raggruppare 3-4 ossa insieme poiché si tratta di popolazioni cellulari rare nel midollo osseo.
- Preparare i terreni di colorazione (FSM) per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Per ottenere 1000 mL di soluzione di FSM, combinare: 100 mL di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), 10 mL di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), 20 mL di siero fetale bovino (FBS), 870 mL di dd H2O. Far passare la soluzione FSM attraverso un filtro da 0,2 μm.
- Prima di prelevare il tessuto, riempire le piastre di Petri con 4-5 ml di PBS sterile senza calcio e magnesio.
- Preparare il mezzo di digestione
- Per ogni 4-6 femori, preparare una miscela per la digestione in 10 mL di PBS contenente 0,005 g di collagenasi P e 0,02 g di ialuronidasi. Mescolare con un leggero vortice e passare la miscela attraverso un filtro da 0,22 μm.
- Prelevare le ossa il giorno 3 post-operatorio come descritto al passaggio 5.2. Rimuovere tutti i muscoli e il tessuto connettivo con una lama di bisturi.
- Riempire una capsula di Petri con 5 ml di terreno di digestione. Metti 4-6 ossa nel mezzo di digestione. Tritare finemente ogni osso, facendo il primo taglio longitudinalmente e lateralmente.
- Trasferire il tessuto in una provetta a fondo tondo da 14 ml e sigillare con parafilm. Copri tubi in foglio di alluminio.
- Agitare a 37 °C per 20 minuti mantenendo il tubo orizzontalmente sullo shaker.
- Rimuovere il tubo dallo shaker. Le celle saranno raggruppate sul fondo. Raccogliere delicatamente il materiale digerito senza disturbare le cellule sul fondo e passare il digestato attraverso un filtro da 70 μm. Raccogliere il filtrato in una nuova provetta da 50 mL contenente 10 mL di FSM freddo e tenerlo in ghiaccio.
- Alle cellule, aggiungere i restanti 5 ml della miscela per la digestione. Sigillare nuovamente con parafilm e coprire con un foglio di alluminio. Agitare il tubo come descritto sopra. Ripetere i passaggi 7.7-7.8.
- Dopo l'incubazione di 20 minuti a 37 °C, trasferire il digestato nella stessa provetta contenente il digestato della fase 7.8, passando attraverso un filtro da 70 μm con altri 10 mL di FSM.
- Centrifugare la sospensione a 274 x g a 4 °C. Aspirare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare. Staccare il pellet picchiettando delicatamente il tubo.
NOTA: La forza centrifuga (g) si basa su un raggio del rotore di 170 mm. Si prega di controllare il raggio del rotore e regolare la velocità di conseguenza. - Per eseguire la lisi dei globuli rossi, aggiungere 1 mL di tampone lisano ammonio-cloruro-potassio (ACK). Mantenere tutti i reagenti e le cellule sul ghiaccio.
- Incubare le cellule in ACK per circa 5 minuti a RT. Non superare i 5 minuti per evitare di lisi eccessivamente le cellule.
- Aggiungere 9 ml di FSM. Centrifugare a 274 x g per 5 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante. Rompere il pellet della cella rastrellando delicatamente la provetta su una rastrelliera.
- Aggiungere 10 mL di FSM (volume per 4 ossa, può essere regolato in base al numero di ossa combinate) e risospendere.
- Prelevare un'aliquota di ciascun campione e aggiungere ioduro di propidio (PI) secondo le istruzioni del produttore. Conta le cellule vive e totali con un contatore di cellule.
- Procedere con la colorazione degli anticorpi dei campioni utilizzando i marcatori desiderati per l'analisi della citometria a flusso 12,13,14.
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Risultati
Il successo della procedura di ablazione meccanica del midollo osseo (BM) è stato convalidato dall'imaging a raggi X, mentre l'ago 26G è stato inserito nella cavità midollare (Figura 2A). Quando l'imaging a raggi X ha indicato che l'ago è stato inserito con un'angolazione impropria o è penetrato attraverso l'osso, l'ago è stato reinserito con l'angolazione corretta e ri-immagine per confermare il posizionamento accurato. Quando non è stato possibile raggiungere una posizione di successo, l'a...
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Discussione
L'obiettivo era quello di stabilire un metodo affidabile e riproducibile per studiare i processi molecolari e cellulari che regolano la riparazione ossea, concentrandosi sulla conversione diretta delle cellule staminali scheletriche e progenitrici (SSPC) in osteoblasti che depositano l'osso nello spazio/cavità del midollo osseo. Il metodo di ablazione meccanica del midollo osseo qui descritto è un protocollo ottimizzato e convalidato per l'ablazione del midollo osseo mediante lesione mec...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni da segnalare.
Ringraziamenti
Il finanziamento è stato fornito da NIH/NIDCR R01-DE030716-01 e NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 ad AS, NIH/NIAMS R01AR080131 a RG e UConn REP Convergence Grant a RG e AS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di formalina al 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Ago ipodermico | Ait Tite / Fisher Scientific | 14-817-239; ref #NEZ25058 | |
| 26 G 1/2 "Aghi ipodermici monouso Exel | International / Fisher Scientific | 14-840-83; ref #26402 | Qualsiasi ago da 26 G può essere sostituito, deve essere staccabile dalla siringa |
| Siringa sterile da 3 ml | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 14-955-457 | |
| AB Tampone sterile | McKesson/ Fisher Scientific NC0593755 | In alternativa è possibile utilizzare tamponi assorbenti autoclavabili | |
| Acido acetico, Millipore glaciale | Sigma | AX0073 | Deve essere diluito all'1% |
| tampone lisanti di ammonio-cloruro-potassio (ACK) | Gibco / Thermo Fisher Scientific | A1049201 | Utilizzato per la lisi dei globuli rossi in preparazione alla citometria a flusso |
| Camera di induzione per anestesia 2 L | VetEquip | 941444 | |
| soluzione di betadine (providone-iodio) | Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Iniezione di buprenorfina HCL 0,3 mg/mL | Generico / Covetrus | 59122 | Deve ottenere la licenza DEA statale e federale per l'acquisto di sostanza controllata |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 206700-1MG | |
| Collagenasi P | Roche | 11249002001 | Utilizzato per digerire le ossa |
| Cotton Swab e applicatori Fisherbrand | / Fisher Scientific | 22-363-172 | |
| Criofilm Tipo II C(10), Sezione da 3,5 cm | Lab, Giappone | CFS 105 | |
| DAPI Soluzione colorante | Abcam | ab228549 | |
| Bilancia digitale per grammi | Toprime / Amazon | B06X6LW4V9 | Può utilizzare qualsiasi bilancia di marca per pesare i topi |
| Pinze da dissezione. | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 08-953E; 08-953F | |
| Forbici da dissezione | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 08-940 | |
| Endure Lame per criostati/microtomi a basso profilo | Tanner Scientific | TNR315LP | |
| Ethiqa XR Buprenorfina a rilascio prolungato 1,3 mg/mL | Ethiqa XR/ Cevetrus | 72117 | Deve ottenere la licenza DEA statale e federale per l'acquisto di sostanze controllate |
| Fast Green, 0,2% | Scienze della miscroscopia elettronica EMS | 50-319-57 | |
| Calore del siero fetale bovino | inattivato Gibco/ Thermo Fisher Scientific | A5256801 | Utilizzato per realizzare i mezzi di colorazione FACS (FSM) |
| Soluzione di montaggio Fluoromount-G | Biotecnologie del Sud | 0100-01 | |
| GLUSEAL Adesivo topico per la pelle | AD Chirurgico | GLU-550 | |
| Capra anti-Coniglio Alexa 647 | Thermo Fisher | A21244 | Diluizione 1:300 |
| salina bilanciata di Hanks (HBSS) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific 14065056 | Utilizzato per realizzare FACS Staining Media (FSM) | |
| Pad riscaldante (grande) | Boncare/ Amazon | B0CLHSWXSX | Può utilizzare qualsiasi marca di termoforo, rimuovere il rivestimento in tessuto... |
| Ematossilina | MilliporeSigma/ Fisher Scientific | M1051740500 | |
| Ialuronidasi | MilliporeSigma | HX0514 | Utilizzato per la digestione dell'osso |
| Isoflurano Sistema di anestesia animale | VetEquip | 901810 | |
| KUBTEC Parametro 2D Cabinet Sistema a raggi X | Soluzioni OncoMed | N/A È | possibile utilizzare qualsiasi sistema di imaging a cabina a raggi X |
| Microcentrifuga Tubi | Corning/ Thomas Scientific | 8600A52 | |
| Vetro di copertura del microscopio, 18 mm x 18 mm, # 1 Spessore | Globe Scientific | 1414-10 | |
| N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano acido solfonico HEPES (1M) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 156300-80 | Utilizzato per realizzare FACS Staining Media (FSM) |
| Adesivo ottico Norland NO61 | Edmund Optical | 37-322 | Utilizzato per far aderire sezioni di criofilm a un vetrino |
| Anticorpo monoclonale di coniglio Osterix | Abcam | ab209484 | Diluizione 1:500 |
| Peroxigard Disinfettante pronto all'uso in un solo passaggio | Virox Technologies | 29101 | Può essere sostituito con qualsiasi altro disinfettante di grado clinico/di laboratorio |
| Ioduro di propidio (PI) | Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific | P1304MP | Colorazione fluorescente nucleare utilizzata per rilevare le cellule morte per il conteggio della vitalità |
| Trimmer elettrico ricaricabile | Wahl/ Amazon | B001FWXKUE | È possibile utilizzare qualsiasi clipper, un trimmer di dimensioni più piccole renderà più facile radere gli animali più piccoli |
| Cono nasale per roditori | VetEquip | 921609 | |
| Safranin O, puro all'85%, certificato | Fisher Scientific | AC419211000 | |
| Seal'N Freeze Cryotray Stampi quadrati Scienze | della miscroscopia elettronica EMS | 62642-01 | Utilizzato per l'incorporamento, è possibile utilizzare altri stampi per l'incorporamento. Questo modello specifico ha uno stampo più profondo e un coperchio per sigillare il blocco. |
| Nitrato d'argento | Sigma Aldrich | S6506 | Nitrato d'argento per colorazione von Kossa |
| Soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 10010023 | In alternativa, è possibile utilizzare PBS appena preparato, filtrato e sterilizzato in autoclave |
| Bisturi standard sterili | Integra Miltex/ Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| Bisturi | standard steriliIntegra Miltex/ Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| Saccarosio in polvere 1 KG | Thermo Fisher Scientific | 036508-A1 | |
| Vetrini per miscroscopio Superfrost Plus | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 1255015 | Vetrini adesivi |
| Sure-Tek Lavorazione dei tessuti/ Inclusione di casette | Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific | 22-048-141 | |
| Tessuto più temperatura di taglio ottimale O.C.T Compound Fisher | Scientific | 23-730-571 | |
| Spugne per tessuti | Epredia/ Fisher Scientific | 84-53 | Le spugne per tessuti proteggono i tessuti dal trattamento eccessivo |
| Toluidina Blue | Fisher Scientific | AC348600050 |
Riferimenti
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