Articolo metodologico

Metodologia migliorata per lo studio dell'osteogenesi postnatale tramite ossificazione intramembranosa in un modello di lesione del midollo osseo murino

DOI:

10.3791/67727

⸱

7 febbraio 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il modello di lesione del midollo osseo murino è uno strumento utile per studiare l'osteogenesi postnatale attraverso l'ossificazione intramembranosa. Questo protocollo chirurgico semplificato descrive la procedura di ablazione del midollo osseo per la valutazione a valle della formazione di nuovo osso e delle risposte cellulari dopo la lesione.

Abstract

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Le lesioni delle ossa lunghe guariscono attraverso le vie di formazione dell'osso endocondrale o intramembranoso. A differenza della via endocondrale che richiede un modello di cartilagine, il processo di ossificazione intramembranosa comporta la conversione diretta delle cellule staminali scheletriche e progenitrici (SSPC) in osteoblasti che formano l'osso. Esistono metodi chirurgici limitati per modellare questo processo nei topi sperimentali. Qui, abbiamo migliorato un modello di lesione del midollo osseo nei topi per facilitare lo studio della riparazione ossea attraverso l'ossificazione intramembranosa e per valutare i regolatori postnatali dell'osteogenesi. Questo metodo è altamente riproducibile e di facile utilizzo e consente la valutazione temporale della formazione di nuovo osso in un breve periodo (3-7 giorni dopo l'infortunio) utilizzando la micro-tomografia computerizzata (μCT) e l'istologia della sezione congelata. Inoltre, i contributi degli SSPC e degli osteoblasti maturi possono essere facilmente valutati utilizzando una combinazione di topi reporter fluorescenti e questo modello di lesione del midollo osseo intramembranoso. In contesti clinici, la formazione di osso intramembranoso è rilevante per la guarigione di difetti critici di dimensioni, fratture stabilizzate, difetti corticali, traumi da resezioni tumorali e sostituzioni articolari.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le lesioni delle ossa lunghe guariscono attraverso la via di formazione dell'osso endocondrale o intramembranoso. A differenza della via endocondrale, che richiede un passaggio precursore della cartilagine, la riparazione ossea tramite ossificazione intramembranosa comporta la conversione diretta delle cellule staminali scheletriche e progenitrici (SSPCS) in osteoblasti che formano l'osso1. Clinicamente, questo processo è rilevante per la guarigione ossea in una varietà di contesti, tra cui difetti di dimensioni critiche, fratture stabilizzate, difetti corticali, osteogenesi da distrazione, traumi da resezioni tumorali e osteointegrazione di impianti di sostituzione articolare 2,3. È interessante notare che, negli studi su pazienti con fratture delle ossa lunghe, il 66%-82% presentava fratture scomposte, che richiedevano dispositivi di fissazione per stabilizzare l'osso 4,5. Queste ossa rigidamente stabilizzate guariscono principalmente attraverso l'ossificazione intramembranosa poiché le estremità ossee rotte entrano in contatto diretto tra loro 6,7. Tuttavia, la regolazione meccanicistica della rigenerazione ossea intramembranosa rimane relativamente poco studiata rispetto alla formazione ossea attraverso le vie endocondrali. Le terapie approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) per aumentare la guarigione ossea sono ostacolate da un'efficacia clinica limitata e da costi elevati e sono associate a effetti avversi significativi8.

L'ablazione meccanica del midollo osseo fornisce un modello prezioso per lo studio della formazione ossea intramembranosa. Questo semplice modello di lesione consente di studiare la rigenerazione ossea nel midollo osseo senza interrompere l'osso corticale. Dopo l'ablazione del midollo osseo, il processo di guarigione prevede fasi distinte ma sovrapposte. La fase iniziale si verifica nei primi 1-5 giorni e prevede la formazione di coaguli e l'infiammazione, in cui le cellule infiammatorie e le citochine iniziano la guarigione. Dal 3° al 14° giorno, la seconda fase è caratterizzata dalla rigenerazione, che comprende la neovascolarizzazione, la migrazione e la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC), la differenziazione osteoblastica e la formazione di ossa intrecciate. La fase finale di rimodellamento inizia circa 10 giorni dopo l'intervento, con il tessuto osseo in fase di maturazione e ristrutturazione fino a quando il midollo non è completamente ripristinato entro il giorno 569. Questa rapida sequenza temporale di guarigione rende il modello di ablazione del midollo osseo ideale per studiare le risposte precoci di riparazione ossea, in particolare durante i periodi critici dell'infiammazione, del reclutamento delle cellule progenitrici e della differenziazione degli osteoblasti. Utilizzando tecniche come l'istologia, la citometria a flusso e l'analisi quantitativa μCT, è possibile valutare le risposte cellulari e la formazione ossea nelle prime fasi di riparazione. Utilizzando le tecniche sopra menzionate, il modello di ablazione del midollo osseo può fornire informazioni sui meccanismi di rigenerazione ossea intramembranosa e aiutare a identificare i bersagli terapeutici chiave per migliorare la guarigione ossea.

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Protocollo

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Le seguenti procedure sono state eseguite con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Connecticut Health Center. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in condizioni sterili, come indicato dalle linee guida del National Institutes of Health (NIH). Il dolore e il rischio di infezioni sono stati gestiti con analgesici e antisettici adeguati per garantire un esito positivo.

1. Preparazione dell'area chirurgica e degli strumenti

  1. Prepara la sala operatoria disinfettando le superfici di lavoro con un detergente disinfettante di livello clinico.
    NOTA: Il chirurgo deve indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), inclusi guanti sterili monouso, cuffia per capelli, camice e maschera.
  2. Preparare un termoforo coperto con un tampone chirurgico sterile. Raccogli e sistema tutti gli strumenti e i reagenti sterili (Tabella dei materiali) con un comodo accesso.

2. Anestesia preoperatoria

  1. Pesare tutti i topi prima dell'intervento chirurgico. Calcolare i volumi di analgesico da utilizzare in base alla formulazione disponibile di buprenorfina.
  2. Assemblare un'unità di anestesia animale all'interno dello spazio di lavoro sterile, che include una camera di induzione e un gruppo cono-naso. Impostare l'emissione di ossigeno a 2 L min-1 e l'isoflurano all'1,5-3% (v/v) a seconda dell'età e del peso del topo.
  3. Una volta che il topo è sedato, rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posizionarlo su un tampone chirurgico sterile in posizione supina. Applicare lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi. Posiziona il cono del naso sopra la testa. Verificare che il topo sia adeguatamente anestetizzato pizzicando delicatamente la punta. Assicurarsi che non vi sia alcuna risposta riflessa degli arti posteriori prima di procedere.
  4. Prima dell'intervento chirurgico, rimuovere brevemente il topo dal cono nasale per iniettare la dose totale di buprenorfina a rilascio prolungato per via sottocutanea; La dose totale è di 3,25 mg/kg.

3. Descrizione della procedura chirurgica

NOTA: Questa procedura chirurgica utilizza topi maschi e femmine C57BL/6 di età compresa tra 10 settimane e 24 settimane. La procedura può essere eseguita su topi di età compresa tra 6 settimane e 33 settimane e su vari ceppi consanguinei, come dimostrato da altri10,11. I topi più giovani possono richiedere aghi di lunghezza inferiore, mentre i topi più anziani o più grandi possono richiedere un ago più lungo.

  1. Riempire una siringa da 3 ml dotata di un ago da 26 G con soluzione fisiologica sterile. Mettilo da parte.
  2. Rimuovere il pelo dall'arto posteriore su cui verrà eseguita la procedura con tosatrici elettriche o a batteria (lama #40) e rimuovere il pelo sciolto dal campo chirurgico. Utilizzando applicatori sterili con punta in cotone, trattare il sito chirurgico con uno scrub a base di iodio (10% di iodio povidone), seguito da alcol isopropilico al 70%. Strofinare il sito chirurgico partendo dal centro del ginocchio e facendo una spazzata circolare verso l'esterno. Lasciare asciugare il sito. Ripeti i passaggi di scrub 3 volte.
  3. Posizionare il mouse sulla schiena e flettere il ginocchio della gamba operativa. Tenere la gamba del topo nella mano non dominante in modo che il ginocchio sia piegato sul dito medio, il secondo dito poggi sul femore e il pollice poggi sulla tibia.
  4. Fai una piccola incisione orizzontale poco profonda appena sotto la rotula usando un bisturi.
    NOTA: Questo passaggio migliora la visualizzazione del sito di inserimento. Con l'esperienza, questo passaggio può essere saltato.
  5. Individua lo spazio articolare posizionando l'ago orizzontalmente sul ginocchio piegato e tastando lo spazio tra il femore e la tibia. Utilizzando questo sito anatomico per guidare, prendi un ago da 25 G e fora manualmente (ruotando l'ago e applicando contemporaneamente una pressione moderata sull'ago) nel femore distale dal ginocchio verso il lato prossimale. Inserire l'ago attraverso o intorno alla rotula.
  6. Radiografare il topo per assicurarsi che l'ago sia stato posizionato in modo appropriato nella cavità midollare, il più vicino possibile al centro (Figura 1).
  7. Rimuovere l'ago da 25 G e inserire immediatamente un ago da 26 G nello stesso foro all'interno della cavità midollare. Alesare i lati della cavità midollare con un movimento circolare almeno 5 volte fino a quando non risulta liscia. Mantenere costante il numero di movimenti di alesatura tra ciascun mouse.
    NOTA: I passaggi 3.5 e 3.7 possono causare lesioni da ago al chirurgo se non maneggiati con cura.
  8. Rimuovere l'ago da 26 G e sostituire l'ago da 26 G collegato alla siringa di soluzione fisiologica. Sciacquare la cavità fino a quando il riflusso non diventa limpido. Ciò richiede in genere 1,5-2 ml di soluzione fisiologica. Rimuovere la siringa e l'ago e smaltirli in modo sicuro in un contenitore appuntito.
    NOTA: Non ci deve essere resistenza quando si spinge il fluido. In tal caso, reinserire l'ago per assicurarsi che si trovi all'interno della cavità. Potrebbe essere necessario estrarre l'ago a metà.
  9. Chiudere la ferita cutanea utilizzando una sutura adesiva topica.

4. Assistenza postoperatoria

  1. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, somministrare la restante metà dose di buprenorfina a rilascio prolungato utilizzando il dosaggio del passaggio 2.4.
    NOTA: La buprenorfina a rilascio prolungato fornisce sollievo dal dolore fino a 72 ore.
  2. Monitora gli animali sul termoforo per segni di respirazione normale e senza ostacoli fino al risveglio dall'intervento chirurgico. Una volta deambulanti, riporta i topi nella loro gabbia.
  3. Continua a monitorare i topi una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per assicurarti che stiano guarendo correttamente e abbiano piena mobilità, osservando i segni di dolore.

5. Elaborazione delle ossa per la scansione e l'analisi μCT

  1. Eutanasia dei topi secondo il metodo di eutanasia umana regolato e approvato dall'IACUC o da altre politiche istituzionali applicabili. In questo caso, è stato utilizzato il metodo di eutanasia primaria di inalazione di CO2 , seguito da un metodo secondario di lussazione cervicale.
  2. Raccogli i femori staccando la pelle intorno agli arti posteriori e rimuovendo l'intero arto all'altezza dell'articolazione dell'anca.
  3. Inserire ogni arto tra due spugne in una cassetta di inclusione. Trasferire le ossa nelle loro cassette in una soluzione di formalina al 10% e fissarle a 4 °C per 5-7 giorni, considerando l'età e le dimensioni del topo.
    NOTA: Sia la sovrafissazione che la sottofissazione determinano una scarsa risoluzione del midollo.
  4. Dopo il fissaggio, lavare le cassette in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti 3 volte.
  5. Rimuovere gli arti dalle cassette e tagliare via i muscoli usando un bisturi, se necessario.
    NOTA: A seconda delle applicazioni a valle, una manipolazione brusca può distruggere lo strato periostale dell'osso.
  6. Separare il femore al ginocchio tagliando con cura i legamenti usando piccole forbici chirurgiche o un bisturi.
    NOTA: Le tibie possono essere utilizzate per altre applicazioni o scartate.
  7. Trasferire i femori in provette coniche da 1,7 mL o 15 mL in una soluzione di etanolo al 70%. Le ossa possono rimanere in etanolo al 70% a 4 °C fino al momento della scansione μCT.
  8. Scansiona e valuta i femori per i parametri trabecolari, producendo dati qualitativi e quantitativi.

6. Lavorazione di ossa per il sezionamento congelato e l'istologia

NOTA: Le ossa possono essere lavorate per il sezionamento congelato e l'istologia dopo essere state sottoposte a scansione μCT. La scansione non influisce sulla marcatura fluorescente o sulla successiva colorazione degli anticorpi.

  1. Trasferire le ossa da etanolo al 70% a PBS e lavare 3 volte, 5 minuti per lavaggio.
  2. Incubare in una serie di soluzioni di saccarosio dal 10%, 20% al 30% in PBS a 4 °C per una notte ad ogni concentrazione. Conservare le ossa in saccarosio al 30% per un massimo di 5 giorni a 4 °C o in questa soluzione a -20 °C per 6-12 mesi fino al momento dell'inclusione.
    NOTA: L'uso di un gradiente di saccarosio si traduce in una migliore penetrazione nei tessuti. Dopo il passaggio 6.1, le ossa possono essere poste direttamente in una soluzione di saccarosio al 30% durante la notte.
  3. Incorporare le ossa in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzando stampi per crioinclusione. Conservare a -80 °C fino al momento della sezionamento.
  4. Sezionare le ossa incorporate utilizzando il metodo del nastro criografico con temperatura del criostato impostata tra -24 °C e -26 °C.
  5. Far aderire le sezioni del criofilm a un vetrino adesivo utilizzando un adesivo ottico e polimerizzarlo fino a indurirlo utilizzando un reticolante ultravioletto (UV).

7. Elaborazione per citometria a flusso

NOTA: Questo protocollo è compatibile con una varietà di anticorpi. Per caratterizzare le cellule staminali scheletriche e le cellule progenitrici, si raccomanda di raggruppare 3-4 ossa insieme poiché si tratta di popolazioni cellulari rare nel midollo osseo.

  1. Preparare i terreni di colorazione (FSM) per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Per ottenere 1000 mL di soluzione di FSM, combinare: 100 mL di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), 10 mL di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), 20 mL di siero fetale bovino (FBS), 870 mL di dd H2O. Far passare la soluzione FSM attraverso un filtro da 0,2 μm.
  2. Prima di prelevare il tessuto, riempire le piastre di Petri con 4-5 ml di PBS sterile senza calcio e magnesio.
  3. Preparare il mezzo di digestione
    1. Per ogni 4-6 femori, preparare una miscela per la digestione in 10 mL di PBS contenente 0,005 g di collagenasi P e 0,02 g di ialuronidasi. Mescolare con un leggero vortice e passare la miscela attraverso un filtro da 0,22 μm.
  4. Prelevare le ossa il giorno 3 post-operatorio come descritto al passaggio 5.2. Rimuovere tutti i muscoli e il tessuto connettivo con una lama di bisturi.
  5. Riempire una capsula di Petri con 5 ml di terreno di digestione. Metti 4-6 ossa nel mezzo di digestione. Tritare finemente ogni osso, facendo il primo taglio longitudinalmente e lateralmente.
  6. Trasferire il tessuto in una provetta a fondo tondo da 14 ml e sigillare con parafilm. Copri tubi in foglio di alluminio.
  7. Agitare a 37 °C per 20 minuti mantenendo il tubo orizzontalmente sullo shaker.
  8. Rimuovere il tubo dallo shaker. Le celle saranno raggruppate sul fondo. Raccogliere delicatamente il materiale digerito senza disturbare le cellule sul fondo e passare il digestato attraverso un filtro da 70 μm. Raccogliere il filtrato in una nuova provetta da 50 mL contenente 10 mL di FSM freddo e tenerlo in ghiaccio.
  9. Alle cellule, aggiungere i restanti 5 ml della miscela per la digestione. Sigillare nuovamente con parafilm e coprire con un foglio di alluminio. Agitare il tubo come descritto sopra. Ripetere i passaggi 7.7-7.8.
  10. Dopo l'incubazione di 20 minuti a 37 °C, trasferire il digestato nella stessa provetta contenente il digestato della fase 7.8, passando attraverso un filtro da 70 μm con altri 10 mL di FSM.
  11. Centrifugare la sospensione a 274 x g a 4 °C. Aspirare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare. Staccare il pellet picchiettando delicatamente il tubo.
    NOTA: La forza centrifuga (g) si basa su un raggio del rotore di 170 mm. Si prega di controllare il raggio del rotore e regolare la velocità di conseguenza.
  12. Per eseguire la lisi dei globuli rossi, aggiungere 1 mL di tampone lisano ammonio-cloruro-potassio (ACK). Mantenere tutti i reagenti e le cellule sul ghiaccio.
  13. Incubare le cellule in ACK per circa 5 minuti a RT. Non superare i 5 minuti per evitare di lisi eccessivamente le cellule.
  14. Aggiungere 9 ml di FSM. Centrifugare a 274 x g per 5 min a 4 °C.
  15. Aspirare il surnatante. Rompere il pellet della cella rastrellando delicatamente la provetta su una rastrelliera.
  16. Aggiungere 10 mL di FSM (volume per 4 ossa, può essere regolato in base al numero di ossa combinate) e risospendere.
  17. Prelevare un'aliquota di ciascun campione e aggiungere ioduro di propidio (PI) secondo le istruzioni del produttore. Conta le cellule vive e totali con un contatore di cellule.
  18. Procedere con la colorazione degli anticorpi dei campioni utilizzando i marcatori desiderati per l'analisi della citometria a flusso 12,13,14.

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Risultati

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Il successo della procedura di ablazione meccanica del midollo osseo (BM) è stato convalidato dall'imaging a raggi X, mentre l'ago 26G è stato inserito nella cavità midollare (Figura 2A). Quando l'imaging a raggi X ha indicato che l'ago è stato inserito con un'angolazione impropria o è penetrato attraverso l'osso, l'ago è stato reinserito con l'angolazione corretta e ri-immagine per confermare il posizionamento accurato. Quando non è stato possibile raggiungere una posizione di successo, l'a...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo era quello di stabilire un metodo affidabile e riproducibile per studiare i processi molecolari e cellulari che regolano la riparazione ossea, concentrandosi sulla conversione diretta delle cellule staminali scheletriche e progenitrici (SSPC) in osteoblasti che depositano l'osso nello spazio/cavità del midollo osseo. Il metodo di ablazione meccanica del midollo osseo qui descritto è un protocollo ottimizzato e convalidato per l'ablazione del midollo osseo mediante lesione mec...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno divulgazioni da segnalare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il finanziamento è stato fornito da NIH/NIDCR R01-DE030716-01 e NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 ad AS, NIH/NIAMS R01AR080131 a RG e UConn REP Convergence Grant a RG e AS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di formalina al 10% Sigma-AldrichHT501128
25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Ago ipodermicoAit Tite / Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2 "Aghi ipodermici monouso ExelInternational / Fisher Scientific14-840-83; ref #26402Qualsiasi ago da 26 G può essere sostituito, deve essere staccabile dalla siringa 
Siringa sterile da 3 mlFisherbrand/ Fisher Scientific 14-955-457
AB Tampone sterileMcKesson/ Fisher Scientific NC0593755In alternativa è possibile utilizzare tamponi assorbenti autoclavabili 
Acido acetico, Millipore glacialeSigmaAX0073Deve essere diluito all'1%
tampone lisanti di ammonio-cloruro-potassio (ACK)Gibco / Thermo Fisher Scientific A1049201Utilizzato per la lisi dei globuli rossi in preparazione alla citometria a flusso 
Camera di induzione per anestesia 2 LVetEquip941444
soluzione di betadine (providone-iodio) Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher ScientificNC0158124
Iniezione di buprenorfina HCL 0,3 mg/mL Generico / Covetrus59122Deve ottenere la licenza DEA statale e federale per l'acquisto di sostanza controllata
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
Collagenasi PRoche11249002001Utilizzato per digerire le ossa
Cotton Swab e applicatori Fisherbrand/ Fisher Scientific 22-363-172
Criofilm Tipo II C(10), Sezione da 3,5 cmLab, GiapponeCFS 105
DAPI Soluzione colorante Abcamab228549
Bilancia digitale per grammiToprime / AmazonB06X6LW4V9Può utilizzare qualsiasi bilancia di marca per pesare i topi
Pinze da dissezione.Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Forbici da dissezione Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-940
Endure Lame per criostati/microtomi a basso profiloTanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Buprenorfina a rilascio prolungato 1,3 mg/mLEthiqa XR/ Cevetrus72117Deve ottenere la licenza DEA statale e federale per l'acquisto di sostanze controllate
Fast Green, 0,2%Scienze della miscroscopia elettronica EMS50-319-57
Calore del siero fetale bovino inattivato Gibco/ Thermo Fisher Scientific A5256801Utilizzato per realizzare i mezzi di colorazione FACS (FSM)
Soluzione di montaggio Fluoromount-G Biotecnologie del Sud 0100-01
GLUSEAL Adesivo topico per la pelle AD Chirurgico GLU-550
Capra anti-Coniglio Alexa 647Thermo FisherA21244Diluizione 1:300
salina bilanciata di Hanks (HBSS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific 14065056Utilizzato per realizzare FACS Staining Media (FSM)
Pad riscaldante (grande)Boncare/ AmazonB0CLHSWXSXPuò utilizzare qualsiasi marca di termoforo, rimuovere il rivestimento in tessuto...
EmatossilinaMilliporeSigma/ Fisher ScientificM1051740500
IaluronidasiMilliporeSigmaHX0514Utilizzato per la digestione dell'osso
Isoflurano Sistema di anestesia animaleVetEquip901810
KUBTEC Parametro 2D Cabinet Sistema a raggi XSoluzioni OncoMedN/A Èpossibile utilizzare qualsiasi sistema di imaging a cabina a raggi X
Microcentrifuga TubiCorning/ Thomas Scientific 8600A52
Vetro di copertura del microscopio, 18 mm x 18 mm, # 1 SpessoreGlobe Scientific1414-10
N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano acido solfonico HEPES (1M) Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80Utilizzato per realizzare FACS Staining Media (FSM)
Adesivo ottico Norland NO61Edmund Optical37-322Utilizzato per far aderire sezioni di criofilm a un vetrino 
Anticorpo monoclonale di coniglio Osterix Abcamab209484Diluizione 1:500
Peroxigard Disinfettante pronto all'uso in un solo passaggioVirox Technologies29101Può essere sostituito con qualsiasi altro disinfettante di grado clinico/di laboratorio
Ioduro di propidio (PI) Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific P1304MPColorazione fluorescente nucleare utilizzata per rilevare le cellule morte per il conteggio della vitalità
Trimmer elettrico ricaricabileWahl/ AmazonB001FWXKUEÈ possibile utilizzare qualsiasi clipper, un trimmer di dimensioni più piccole renderà più facile radere gli animali più piccoli
Cono nasale per roditoriVetEquip921609
Safranin O, puro all'85%, certificatoFisher ScientificAC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Stampi quadrati Scienzedella miscroscopia elettronica EMS62642-01Utilizzato per l'incorporamento, è possibile utilizzare altri stampi per l'incorporamento. Questo modello specifico ha uno stampo più profondo e un coperchio per sigillare il blocco.
Nitrato d'argentoSigma AldrichS6506Nitrato d'argento per colorazione von Kossa
Soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023In alternativa, è possibile utilizzare PBS appena preparato, filtrato e sterilizzato in autoclave
Bisturi standard steriliIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Bisturistandard steriliIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Saccarosio in polvere 1 KGThermo Fisher Scientific036508-A1
Vetrini per miscroscopio Superfrost PlusFisherbrand/ Fisher Scientific 1255015Vetrini adesivi
Sure-Tek Lavorazione dei tessuti/ Inclusione di casetteFisherbrand Histosette/ Fisher Scientific22-048-141
Tessuto più temperatura di taglio ottimale O.C.T Compound FisherScientific23-730-571
Spugne per tessutiEpredia/ Fisher Scientific84-53Le spugne per tessuti proteggono i tessuti dal trattamento eccessivo 
Toluidina BlueFisher ScientificAC348600050
di Soluzione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

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