La Typha latifolia, che si propaga principalmente asessualmente attraverso i rizomi, pone sfide di raccolta a causa del suo esteso apparato radicale. Questo articolo presenta un metodo per coltivare T. latifolia da seme, facilitando la coltivazione in laboratorio e offrendo il potenziale per la crescita sterile delle piante e il bioaumento microbico precoce.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Metodo ottimizzato per la coltivazione e la biopotenziazione microbica di Typha latifolia (tifa)
In questo articolo
Sommario
Abstract
La Typha latifolia, più comunemente nota come tifa a foglia larga o giunco comune, ha un areale di distribuzione globale e domina gli ecosistemi delle zone umide del Nord America. Mentre diverse specie di tifa sono spesso considerate invasive in Nord America, T. latifolia è considerata la specie autoctona della regione e si trova in tutto il continente come specie Typha dominante. Storicamente, il Typha ha svolto varie funzioni, dalle fonti di cibo ai materiali da costruzione. Più recentemente, T. latifolia è emersa come una specie di spicco per aiutare gli sforzi di biorisanamento. Con il crescente interesse per lo sviluppo di sistemi di trattamento delle zone umide artificiali (CWTS) per la bonifica dei contaminanti, sono necessarie tecniche riproducibili per coltivare la tifa in un ambiente di laboratorio. Il lavoro qui presentato ha esaminato e testato vari parametri di crescita per la coltivazione di successo di T. latifolia da seme. La germinazione di successo delle specie di Typha comporta la scarificazione (rottura del rivestimento del seme), che è stata ottenuta utilizzando tecniche meccaniche per la produzione su larga scala. È stato dimostrato che l'insediamento precoce dei semi favorisce condizioni di bassa crescita dei nutrienti per la prima settimana, seguita dall'introduzione di fertilizzanti nelle settimane successive per migliorare la sopravvivenza post-trapianto. Per il bioaumento microbico del sistema vegetale, i risultati hanno mostrato che l'immersione dei semi nell'inoculo porta a una colonizzazione più estesa del tessuto radicale e alla persistenza batterica a lungo termine. Per migliorare il successo della colonizzazione dei microrganismi è stata utilizzata una tecnica di sterilizzazione delle sementi ottimizzata che utilizza una combinazione di candeggina e detergente. I vasi di crescita, sia sterili che non sterili, progettati in questo studio supportano la crescita a lungo termine di T. latifolia in varie condizioni.
Introduzione
Come tecnologia efficiente in termini di costi ed energia, i sistemi di trattamento delle zone umide costruite (CWTS) hanno guadagnato una notevole popolarità per la bonifica dei contaminanti ambientali 1,2,3. CWTS utilizza processi fisici, chimici e biologici per rimuovere, trasformare o stabilizzare i contaminanti. Mentre i processi fisici e chimici coinvolti nel turnover chimico sono stati ben caratterizzati sin dalla genesi della CWTS, l'impatto della vegetazione è rimasto in gran parte enigmatico2. Negli ultimi anni, c'è stata una maggiore attenzione alla comprensione dei meccanismi con cui le piante trasformano i contaminanti organici e inorganici di potenziale preoccupazione nelle acque reflue 2,4,5. Tuttavia, studi meccanicistici come questi si basano sulla capacità di coltivare un gran numero di macrofite e favorire la crescita dal seme per garantire che ogni pianta sia allo stesso stadio di crescita e sviluppo.
I CWTS in Nord America sono spesso stabiliti utilizzando la vegetazione nativa delle zone umide naturali della regione, come le specie Typha, Scirpus, Juncus e Phragmites 6,7. La scelta della vegetazione dipende anche dalla zona umida costruita utilizzata, che può variare in profondità, flusso d'acqua, approvvigionamento del substrato e approvvigionamento idrico (con o senza ricircolo)2. Infine, il clima influenza anche la vegetazione delle zone umide, con climi più freddi che favoriscono le piante sommerse a causa della loro maggiore adattabilità8. Le specie di Typha sono di particolare interesse nelle zone umide profonde e costruite a flusso superficiale grazie alla loro capacità di colonizzare rapidamente un ambiente e di adattarsi a diverse condizioni ambientali 9,10.
Una recente revisione dei risultati ha riportato che, su 87 test di fitotossicità utilizzando specie di Typha , solo 15 studi hanno iniziato le piante di prova da seme e, di questi, solo uno studio ha esaminato la crescita in piante mature11. Questa sottorappresentazione della sperimentazione sulla tifa da seme indica una lacuna nella letteratura riguardante i protocolli volti a descrivere la coltivazione della tifa per studi di laboratorio. I protocolli qui delineati mirano a colmare questa lacuna presentando un protocollo approfondito per la crescita della Typha latifolia dal seme alla pianta matura in condizioni sterili e non sterili. Inoltre, questo articolo discute una tecnica per il bioaumento batterico delle specie di tifa allo stadio di seme, in cui l'inoculazione precoce può aiutare a mantenere la persistenza a lungo termine dei microbi rizo- ed endo-fitici introdotti.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Scarificazione dei semi
- I semi di tifa provengono da una zona umida a Calgary, AB, Canada, nell'autunno del 2023 (51.11312° N, 114.39381° W). Raccogli l'infiorescenza della tifa in autunno e conservala in un sacchetto di carta al buio fino all'uso. Se ancora sul gambo, raccogli l'infiorescenza in primavera, ma il recupero del seme sarà diminuito.
- Usando le cesoie da giardino, taglia il gambo della pianta a ~2 cm dalla base dell'infiorescenza. Staccare i semi dall'infiorescenza e metterli in un frullatore da laboratorio fino a quando il volume del frullatore non è pieno per circa un quarto. Si tratta di circa 250 ml di semi non compattati.
- Riempi il frullatore con 500 ml di acqua di rubinetto. Mantenere uno spazio di testa di 10 cm nel frullatore. Frullare a velocità medio-bassa per 20 s e trasferire immediatamente in un bicchiere capiente da 1 L. La soluzione risultante dovrebbe essere viscosa.
- Trasferire circa 100 ml di questo fango di acqua di semi nel frullatore e riempire il frullatore con 400-600 ml di acqua di rubinetto fresca. Frullare a velocità medio-alta per 20 s e trasferire immediatamente in un bicchiere fresco da 1 L.
- Riempire il becher con acqua di rubinetto fino a 800 ml e lasciarlo riposare per almeno 60 s. I semi di tifa scarificati e vitali affonderanno sul fondo del becher e il pennacchio e il becco (vedi Figura 1 per una descrizione della struttura del seme di tifa) galleggeranno verso l'alto. Raccogli il fango nella parte superiore del bicchiere e versa lentamente l'acqua dal bicchiere senza disturbare i semi sul fondo. Trasferire i semi in un becher da 100 ml.
- Ripetere il processo di miscelazione sul resto del fango di tifa dal passaggio 1.5.
- Posizionare il bicchiere contenente i semi su un piatto mescolatore e centrifugare a velocità media per 1 ora. Dopo 1 ora raccogliere il materiale vegetale che galleggia nella parte superiore del becher.
- Versare i semi in un imbuto Büchner con carta da filtro attaccata a un aspirapolvere per asciugare i semi durante la notte. I semi secchi possono essere conservati a -20 °C in provette coniche di polipropilene da 15 mL.
2. Germinazione con tecnica non sterile
- Preparare piastre di media Murashige e Skoog (MS) a metà forza con l'1% di phytoagar12.
- Metti circa 1 ml di semi secchi in una provetta conica di polipropilene da 15 ml e riempila con 10 ml di acqua di rubinetto. Ruotare su un agitatore orbitale a bassa velocità per 24 ore per indurre la germinazione.
- Rimuovere l'acqua in eccesso in modo che rimangano 3 ml nella provetta conica in polipropilene da 15 mL.
- Tagliare la punta di una punta per pipette in plastica da 1000 μl per aumentare la dimensione del foro e pipettare energicamente la soluzione di semi per sospendere i semi all'interno della punta della pipetta.
- Mettere i semi e l'acqua sulle piastre di agar MS a metà forza. Agitare il piatto per distribuire uniformemente i semi.
- Avvolgere le piastre in pellicola sigillante da laboratorio e posizionarle in una camera di crescita con un ciclo luce-buio di 16 ore/8 ore a 23 °C e 70% di umidità. Incubare le piastre per 1 settimana (fino a 2 settimane) per indurre la germinazione dei semi.
3. Germinazione con tecnica sterile
NOTA: Sono stati testati e confrontati diversi protocolli di sterilizzazione delle sementi. La tecnica che ha prodotto i più alti tassi di germinazione producendo semi completamente sterilizzati è stata modificata da un precedente protocollo13 ed è descritta qui.
- Preparare piastre di media MS a metà forza con l'1% di phytoagar12.
- Mettere un volume di circa 1 mL di semi in una provetta conica di polipropilene da 15 mL e riempire con 10 mL di ddH2O. Porre su un agitatore orbitale a velocità medio-alta per 10 min.
- Rimuovere l'acqua e aggiungere 5 mL di una soluzione di polisorbato 20 allo 0,1% (preparata in ddH2O sterile) alla provetta conica in polipropilene da 15 mL. Porre su uno shaker orbitale a velocità medio-alta per 10 min.
- Rimuovere la soluzione e aggiungere 5 mL di candeggina commerciale al 30% e una soluzione di polisorbato 20 allo 0,025% (preparata in ddH2O sterile) alla provetta conica in polipropilene da 15 mL. Agitare a velocità medio-alta per 30 min.
- Togliere la soluzione e sostituirla con ddH2O. Agitare a velocità medio-alta per 5 min. Ripetere per un totale di 3 risciacqui con acqua.
- Riempire la provetta conica in polipropilene da 15 mL con ddH2O sterile e ruotare a bassa velocità per 24 ore per indurre la germinazione. Dopo 24 ore, rimuovere l'acqua in eccesso in modo che rimangano 3 ml nella provetta di plastica.
- Tagliare asetticamente la punta di una punta di plastica da 1000 μl e pipettare energicamente per sospendere i semi all'interno della punta.
- Piastra i semi e il liquido su piastre di agar MS a metà forza. Agitare il piatto per distribuire uniformemente i semi.
- Avvolgere le piastre in una pellicola sigillante da laboratorio e metterle in una camera di crescita con un ciclo luce-buio di 16 ore/8 ore a 23 °C e 70% di umidità. Lasciare le piastre per 1 settimana (fino a 2 settimane) per consentire la germinazione.
4. Inoculazione dei semi con batteri selezionati
- Per inoculare i semi di tifa, segui prima il protocollo di germinazione dei semi sterili sopra fino al passaggio 3.6 per produrre semi sterili. Rimuovere il risciacquo finale con acqua dalla provetta conica in polipropilene da 15 ml come descritto al punto 3.6 sopra.
- Utilizzando colture microbiche coltivate durante la notte inoculate da un singolo isolato o comunità, misurare l'OD600 e normalizzare a un valore di assorbanza di 1,0 diluendo nel terreno di coltura. Incubare le colture per un periodo di tempo più lungo se non si raggiunge un OD600 di 1,0.
NOTA: Qui, le colture sono state stabilite da una Luteimonas sp. isolata da radici di piante nel nord dell'Alberta e coniugata per esprimere una proteina fluorescente DsRed per la visualizzazione microscopica. - Centrifugare 1 mL di coltura a 9300 x g per 2 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione salina tamponata con 1 fosfato. Centrifugare a 9300 x g per 2 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di ddH2O sterile.
- In una provetta conica di polipropilene da 15 mL, agitare circa 1 mL di semi a bassa velocità per 24 ore in 10 mL di una diluizione 1:10 dell'inoculo preparato con tensioattivo organosiliconico allo 0,025%.
- Segui il resto del protocollo di germinazione dei semi sterili a partire dal passaggio 3.8.
5. Crescita non sterile della tifa sul terreno
- Riempi i vasi con terriccio a basso contenuto di sostanza organica a tua scelta, lasciando 1 cm di spazio dalla parte superiore del vaso. Pre-inumidisci il terreno con acqua di rubinetto e fai dei buchi di 1 cm nel terreno.
- Usando una pinzetta, rimuovi delicatamente le piantine germinate per 1 settimana dalle piastre di agar MS coltivate come descritto nel passaggio 3 sopra, facendo attenzione a non danneggiare le radici. Posiziona delicatamente una piantina in ogni buco del terreno e coprila con la terra.
- Metti i vasi in un vassoio e riempili con acqua del rubinetto fino al livello del terreno. Per ogni 10 vasi, aggiungere 100 ml di fertilizzante 0,5% 20/20/20 NPK.
- A ogni serie di dieci vasi, aggiungi il fertilizzante come segue: settimana 2 - 100 ml di fertilizzante allo 0,5%, settimana 3 - 100 ml di fertilizzante all'1,0%, settimana 4 - 100 ml di fertilizzante all'1,0%.
- Dopo 4 settimane, interrompere la concimazione settimanale e concimare solo una volta al mese con 100 ml di soluzione fertilizzante all'1,0%. A 4 settimane, trapiantare in vasi più grandi, se necessario. A questo punto le piante sono meno sensibili al tipo di terreno, quindi usa qualsiasi miscela.
- Continua a trapiantare le tife man mano che diventano troppo grandi per il loro contenitore. Rimuovere il fogliame morto con le cesoie. Fertilizzare le tife una volta al mese.
- Per gli esperimenti, trapiantare le piantine in un piccolo vaso che, una volta posizionato sul fondo di una scatola vuota di puntali per pipette, è ancorato ai lati della scatola. Ciò consente un corretto allagamento del suolo, imitando così le condizioni delle zone umide. Se si conducono esperimenti su tife più vecchie, modificare in modo simile in modo che il vaso possa essere quasi completamente immerso nell'acqua.
6. Crescita sterile della piantina
- Design della camera di crescita della piantina
NOTA: L'assemblaggio di ogni unità della camera di crescita delle piantine richiede due scatole di coltura, una siringa con punta luer lock, un filtro sterile monouso da 0,2 μm e silicone resistente al calore. Vedere la Figura 2 per una rappresentazione visiva della configurazione della camera.- Rimuovi i coperchi dalle scatole delle colture e usa un trapano a mano per creare fori di 3,5 cm di diametro al centro dei coperchi. Utilizzare silicone resistente al calore per incollare insieme la parte superiore dei due coperchi.
- Praticare un foro delle dimensioni della punta della siringa (~ 1 cm di diametro) nell'angolo inferiore di una delle scatole di coltura. Tagliare la punta di una siringa e gettare il corpo della siringa.
- Utilizzare silicone resistente al calore per fissare la punta della siringa nella scatola di coltura con il filo Luer lock all'esterno della scatola.
- Lasciare indurire il silicone almeno 24 ore prima dell'uso.
- Crescita sterile nel suolo
- Segui il protocollo di germinazione dei semi sterili descritto nel passaggio 3 per ottenere semi sterili.
- Riempi l'unità della camera di crescita sterile con terriccio a scelta, bagnato con acqua di rubinetto.
- Autoclavare in autoclave con un ciclo di 20 minuti di liquido, coprendo la punta del blocco dell'esca con un foglio di alluminio. Dopo 24 ore, autoclavare nuovamente il sistema con un ciclo di liquidi di 20 minuti. Eseguire tutti i passaggi successivi in una cappa a flusso laminare.
- Collegare un'unità filtro da 0,2 μm all'attacco Luer lock sulla camera di crescita (Figura 2). Apri la camera di crescita e aggiungi 500 μL di fertilizzante sterilizzato con filtro all'1% 20/20/20 al terreno. Mescola il terreno con una spatola sterile. Mentre mescoli il terreno, aggiungi ddH2O sterile per assicurarti che sia adeguatamente idratato senza sovrasaturazione.
- Usa una lama di rasoio sterile per tagliare in quarti l'agar MS da piastre contenenti piantine di 1 settimana. Usa una spatola sterile per stendere il pezzo di agar sul terreno.
- Posizionare l'unità della camera di crescita in un incubatore per la crescita delle piante con un ciclo giorno-notte di 16 ore/8 ore a 23 °C e 70% di umidità.
- Crescita sterile in soluzione idroponica
- Seguire il protocollo di germinazione sterile descritto nel passaggio 3 per ottenere semi sterili.
- Autoclavare in autoclave una scatola di puntali per pipette e un agar MS a metà forza con un ciclo liquido di 20 minuti. In una cappa a flusso laminare, avvolgere la parte inferiore dell'inserto del puntale con una pellicola sigillante sterile da laboratorio. Riempire ogni apertura del puntale della pipetta con agar quasi fino in cima.
- Aggiungere nuovamente l'inserto della punta nella scatola della punta, riempiendo il fondo della scatola con la soluzione idroponica di Hoagland a metà forza (0,5 mM NH4H2PO4, 3 mM KNO3, 2 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,023 mM H3BO3, 0,005 mM MnCl2·4H2O, 0,0004 mM ZnSO4·7H2O, 0,0002 mM CuSO4·5H2O, 0,00007 mM H2MoO4·1H2O e 0,045 mM FeSO4·7H2O, aggiustato a pH 7,0).
- Rimuovere con cautela le piantine dalle piastre di agar MS e posizionarle sull'agar MS sopra l'agar nell'apertura della pipetta nell'inserto della scatola dei puntali.
- Chiudere il coperchio della scatola dei puntali e metterlo in una camera di crescita con un ciclo giorno-notte di 16 ore/8 ore a 23 °C e 70% di umidità.
- Quando le piante sono troppo grandi per la scatola delle punte, trapiantatele nella camera di crescita della coltura descritta al punto 5.1. Per il trasferimento, rimuovere l'intero tappo di agar con la pianta e spostarlo in un tappo di schiuma con un taglio radiale. Il tappo di schiuma può essere posizionato tra le due scatole di coltura e la scatola di coltura inferiore può essere riempita con Hoagland a metà forza.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La Figura 1 mostra una rappresentazione di un seme di Typha che ha subito il processo di scarificazione, insieme a un seme non completamente scarificato con il becco rimosso e un seme non scarificato. Assicurarsi che il tempo di miscelazione sia sufficiente per produrre principalmente semi completamente scarificati.
Dopo la scarificazione e l'essiccazione dei semi, la vitalità dei semi deve essere testata utilizzando la tecnica di germinazione non sterile...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo qui presentato fornisce una guida dettagliata per la crescita di specie di tifa da seme per applicazioni di laboratorio. Mentre la tifa può essere facilmente propagata da talee di rizoma, l'avvio delle piante da seme consente la variazione genetica all'interno di un set di campioni, garantisce che le piante siano allo stesso livello di crescita e offre l'opportunità di una colonizzazione precoce per esperimenti di bioaumento microbico. È importante identificare correttament...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
AZ è stato finanziato da un premio di laurea CGS-M del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). La ricerca sulla CWTS nel laboratorio di Muench è supportata da Genome Canada attraverso una sovvenzione LSARP (Large Scale Applied Research Project) (#18207) in collaborazione con Genome Alberta e Genome Quebec.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0.2 & micro; Filtro M sterile | VWR | 514-4126 | |
| 3′,5′-Dimetossi-4′-idrossiacetofenone | Laboratori PhytoTech | S7777 | |
| Scatole di coltura con coperchi (77 mm e volte 77 mm e volte 97 mm) | Millipore Sigma | V8505 | |
| Sigillante in silicone resistente al calore ad alta temperatura | Gruppo Manifatturiero Imperiale | KK0205 | |
| Film sigillante di laboratorio | Millipore Sigma | P7793 | |
| Murashige e Skoog media | Laboratori PhytoTech | M401 | |
| Tensioattivo organosiliconico | Laboratori PhytoTech | S7777 | |
| Phytoagar | GoldBiotecnologia | P1003 | |
| Polisorbato 20 | Roche | 11332465001 |
Riferimenti
- Ciria, M. P., Solano, M. L., Soriano, P. Role of Macrophyte Typha latifolia in a Constructed Wetland for Wastewater Treatment and Assessment of Its Potential as a Biomass Fuel. Biosys Eng. 92 (4), 535-544 (2005).
- Shelef, O., Gross, A., Rachmilevitch, S. Role of Plants in a Constructed Wetland: Current and New Perspectives. Water. 5 (2), 405-419 (2013).
- Parde, D., et al. A review of constructed wetland on type, treatment and technology of wastewater. Environ Tech Innovation. 21, 101261(2021).
- Abdullah, S. R. S., et al. Plant-assisted remediation of hydrocarbons in water and soil: Application, mechanisms, challenges and opportunities. Chemosphere. 247, 125932(2020).
- Noor, I., et al. Heavy metal and metalloid toxicity in horticultural plants: Tolerance mechanism and remediation strategies. Chemosphere. 303, 135196(2022).
- Vymazal, J. Plants used in constructed wetlands with horizontal subsurface flow: A review. Hydrobiologia. 674 (1), 133-156 (2011).
- Sandoval, L., Zamora-Castro, S. A., Vidal-Álvarez, M., Marín-Muñiz, J. L. Role of Wetland Plants and Use of Ornamental Flowering Plants in Constructed Wetlands for Wastewater Treatment: A Review. Appl Sci. 9 (4), 685(2019).
- Wu, H., et al. Constructed wetlands for pollution control. Nat Rev Earth Environ. 4, 218-234 (2023).
- Yang, Y., Shen, Q. Phytoremediation of cadmium-contaminated wetland soil with Typha latifolia L. and the underlying mechanisms involved in the heavy-metal uptake and removal. Environ Sci Pollution Res. 27 (5), 4905-4916 (2020).
- Leto, C., Tuttolomondo, T., La Bella, S., Leone, R., Licata, M. Effects of plant species in a horizontal subsurface flow constructed wetland - phytoremediation of treated urban wastewater with Cyperus alternifolius L. and Typha latifolia L. in the West of Sicily (Italy). Ecol Eng. 61, 282-291 (2013).
- Sesin, V., Davy, C. M., Freeland, J. R. Review of Typha spp. (cattails) as toxicity test species for the risk assessment of environmental contaminants on emergent macrophytes. Environ Pollution. 284, 117105(2021).
- Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Rogers, S., Beech, J., Sarma, K. S. Shoot regeneration and plant acclimatization of the wetland monocot cattail (Typha latifolia). Plant Cell Rep. 18 (1), 71-75 (1998).
- Tangen, B. A., et al. Distributions of native and invasive Typha (cattail) throughout the Prairie Pothole Region of North America. Wetlands Ecol Management. 30 (1), 1-17 (2022).
- Pieper, S. J., Nicholls, A. A., Freeland, J. R., Dorken, M. E. Asymmetric Hybridization in Cattails (Typha spp.) and Its Implications for the Evolutionary Maintenance of Native Typha latifolia. J Heredity. 108 (5), 479-487 (2017).
- Lansdown, R. V. Typha latifolia. The IUCN Red List of Threatened Species 2017. , (2017).
- Bedish, J. W. Cattail Moisture Requirements and their Significance to Marsh Management. Am Midland Naturalist. 78 (2), 288(1967).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
