Articolo metodologico

In vitro Test della trombosi per dispositivi di assistenza ventricolare

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DOI:

10.3791/67731

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21 marzo 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 3Department of Cardiovascular Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo da banco per indurre la trombosi nei dispositivi di assistenza ventricolare (VAD) all'interno di una piattaforma di test a ricircolo. Questo metodo serve a identificare i punti caldi trombogenici nel percorso del flusso sanguigno e può aiutare a migliorare la tromboresistenza prima dei test preclinici su modelli animali.

Abstract

Il rischio di trombosi rimane una preoccupazione significativa nello sviluppo e nell'uso clinico dei dispositivi di assistenza ventricolare (VAD). Le valutazioni tradizionali della trombogenicità del VAD, principalmente attraverso studi sugli animali, sono costose e richiedono tempo, sollevano preoccupazioni etiche e, in ultima analisi, potrebbero non riflettere accuratamente i risultati umani. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un aggressivo protocollo di test in vitro progettato per provocare trombosi e identificare potenziali aree ad alto rischio all'interno del percorso del flusso sanguigno. Questo protocollo, motivato dal lavoro di Maruyama et al., impiega una strategia anticoagulante modificata e utilizza componenti prontamente disponibili, rendendolo accessibile alla maggior parte dei laboratori che conducono test del sangue in vitro dei VAD. Abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo attraverso test iterativi e perfezionamento di un VAD pediatrico miniaturizzato a levitazione magnetica (PediaFlow PF5). Il metodo si è rivelato efficace nell'identificare i punti caldi trombogenici causati da difetti di progettazione e produzione nei primi prototipi di VAD, consentendo miglioramenti mirati prima di passare agli studi sugli animali. Nonostante i suoi limiti, tra cui l'assenza di flusso pulsatile e l'influenza delle caratteristiche del sangue del donatore, questo protocollo funge da strumento pratico per lo sviluppo precoce del VAD e la mitigazione del rischio.

Introduzione

I dispositivi di assistenza ventricolare (VAD) sono diventati uno standard di cura nella gestione dei pazienti con insufficienza cardiaca avanzata, ma il rischio di trombosi e ictus rimane una sfida significativa 1,2. La trombosi all'interno dei VAD viene in genere valutata durante gli studi preclinici sugli animali che, sebbene preziosi, presentano costi sostanziali e sfide logistiche. Questi studi richiedono molte risorse, richiedono molto tempo e sono suscettibili di un singolo difetto che comprometta l'intero test e richieda ulteriori prove. Ciò non solo aumenta l'onere finanziario, ma solleva anche preoccupazioni etiche dovute alla necessità di ripetere i test sugli animali.

Sebbene esistano molti modelli numerici per prevedere la deposizione piastrinica e la trombosi 3,4,5,6, solo pochi sono adatti per simulare la formazione di trombi in dispositivi su macroscala come i VAD 7,8,9. Inoltre, i modelli esistenti presuppongono inevitabilmente superfici idealizzate e geometrie semplificate "a tenuta stagna", che non riflettono accuratamente le complessità e le imperfezioni dei gruppi pompa del mondo reale. Quando si considerano le interazioni piastrine-superficie, questi modelli su macroscala generalmente impiegano proprietà del materiale uniformemente prescritte (tipicamente modellate come coefficiente nelle condizioni al contorno superficie-flusso)10,11,12. Di conseguenza, i modelli numerici non possono sostituire completamente i test sperimentali con il sangue.

Sia la scelta del materiale che la finitura superficiale svolgono un ruolo fondamentale nell'adesione piastrinica sulle superfici VAD 13,14,15,16,17. Imperfezioni come macchie ruvide o irregolarità possono favorire l'adesione piastrinica e la formazione di trombi. Inoltre, le fessure tra i componenti nel percorso del flusso possono fungere da nidus per la trombosi, fornendo ambienti protetti in cui i coaguli possono formarsi e crescere18,19. Anche l'uso di grasso, lubrificanti o sigillanti durante l'assemblaggio può rappresentare un rischio, poiché queste sostanze possono penetrare nel percorso del flusso e interagire con il sangue, aumentando ulteriormente il rischio di complicanze.

C'è, quindi, la necessità di un protocollo di test in vitro ben definito in grado di valutare in modo affidabile la tromboresistenza dei VAD prima che siano sottoposti a test sugli animali o all'uso clinico. Sebbene esista uno standard ASTM ampiamente adottato per la valutazione dell'emolisi20, non esiste uno standard simile per i test di trombogenicità dei VAD in condizioni operative clinicamente rilevanti21. Nonostante studi seminali risalenti a tre decenni fa dimostrino la fattibilità del test della trombosi in vitro per le pompe del sangue 22,23,24,25, i test sugli animali hanno persistito come pratica de facto per valutare la trombosi fino ad oggi26. L'ostacolo a una più ampia adozione dei metodi in vitro è stata probabilmente la natura complessa della coagulazione, con la moltitudine di fattori confondenti che possono influenzare i risultati dei test, rendendo difficile differenziare la trombogenicità intrinseca della pompa dagli artefatti derivanti da limitazioni metodologiche ed errori procedurali.

Questo ci ha motivato a condividere un protocollo dettagliato come guida per gli sperimentatori per evitare insidie, promuovendo così l'uso di test in vitro e mitigando la dipendenza dagli studi sugli animali. Il protocollo qui descritto, derivato da Maruyama et al.27, è stato perfezionato e convalidato durante la progettazione del VAD28,29 pediatrico PediaFlow (PF5) di 5agenerazione. Questo metodo di test si è rivelato determinante per identificare e affrontare sistematicamente i potenziali rischi trombogenici nei prototipi VAD prima della sperimentazione animale.

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Protocollo

Il sangue intero ovino utilizzato in questo studio è stato ottenuto da un fornitore commerciale e, pertanto, non ha richiesto una revisione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Cornell University.

1. Costruzione del circuito di flusso di prova

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per un elenco dettagliato dei componenti del loop e di tutti gli altri materiali utilizzati in questo protocollo.

  1. Modificare la sacca endovenosa (IV).
    1. Utilizzare una termosigillatrice in plastica per modificare una sacca per flebo per regolarne il volume e la forma, come illustrato nella Figura 1.
      NOTA: La forma della sacca facilita la disaerazione e consente di bloccare la sacca con un emostatico attraverso la linea del fluido30,31. La posizione della linea di sigillatura viene scelta in base al volume di adescamento del VAD e del tubo per ottenere un volume di adescamento totale di 150 mL.
    2. Introdurre una presa d'aria praticando un'incisione di 4 mm nella parte superiore del sacchetto. Inserire un luer lock femmina spinato nell'incisione e sigillare il sito con adesivo in gomma siliconica RTV. Fissare un rubinetto unidirezionale al luer lock.
  2. Assemblare il circuito di prova utilizzando la sacca per flebo modificata, il tubo in cloruro di polivinile (PVC), i connettori spinati in policarbonato e i rubinetti a 3 e 1 via, come mostrato nella Figura 1.
  3. Collegare il manometro della pressione.
    1. Collegare le linee di prolunga da 6 pollici alle porte di pressione sul lato di ingresso e di uscita. Fissare un rubinetto unidirezionale all'altra estremità della linea di prolunga.
      NOTA: Il rubinetto consente di scollegare il tubo del manometro per adescare la linea di prolunga con il fluido prima di avviare la pompa, come descritto al punto 4.3.
    2. Collegare un'estremità di ciascun tubo con diametro interno (ID) da 1/8" a una punta del manometro e inserire un raccordo luer maschio all'altra estremità.
    3. Collegare i raccordi luer maschio ai rubinetti unidirezionali. Aprire i rubinetti per abilitare le letture della pressione.
  4. Applicare una sonda di flusso a ultrasuoni clamp-on per misurare la portata.
  5. Posizionare un morsetto Hoffman distalmente alla porta di pressione di uscita per regolare la resistenza al flusso.

2. Preparazione della soluzione di cloruro di calcio (CaCl2)

  1. Sciogliere il CaCl2 in polvere in 1x soluzione salina tamponata con TRIS (pH 7,4) per preparare una soluzione 1 M. Evitare tamponi contenenti fosfato (ad es. PBS o DPBS) poiché il calcio e il fosfato reagiscono per formare un precipitato insolubile.
  2. Se si prepara CaCl2 in grandi quantità, aggiungere la polvere di CaCl2 in modo incrementale in più passaggi, poiché la sua dissoluzione è un processo esotermico.
  3. Titolare il pH della soluzione a 6-8 utilizzando acido cloridrico (HCl) o idrossido di sodio (NaOH) se necessario.

3. Preparazione del sangue

NOTA: Il sangue ovino utilizzato in questo studio è stato ottenuto da un fornitore commerciale elencato nella Tabella dei materiali. Il sangue è stato raccolto utilizzando un ago da 14 G, con l'animale trattenuto in una posizione eretta agricola standard. Il processo di raccolta ha richiesto 10-12 minuti dall'inserimento dell'ago al completamento. Il sangue è stato anticoagulato con 14 parti di CPD in 86 parti di sangue (formulazione CPD: 26,3 g/L di Na-citrato, 25,2 g di destrosio, 3 g/L di acido citrico e 2,2 g/L di Na fosfato in acqua deionizzata [DI]). La sacca di sangue è stata spedita durante la notte in un contenitore isolato con impacchi di ghiaccio ed è stata utilizzata per l'esperimento entro 24 ore dalla raccolta.

  1. Preparare il sangue del donatore per l'uso.
    1. Posizionare la sacca di sangue su una piattaforma inclinabile per 15-30 minuti per mescolare delicatamente il sangue e lasciarlo raggiungere la temperatura ambiente (RT).
    2. Posizionare un'ancoretta magnetica in un becher o contenitore in policarbonato designato per il trasferimento del sangue.
    3. Trasferire il sangue nel becher attraverso un filtro trasfusionale per rimuovere i macroaggregati. Maneggiare il sangue con delicatezza per evitare danni ai componenti cellulari. Versare il sangue lungo le pareti del contenitore per evitare la caduta libera e ridurre al minimo i traumi cellulari.
      NOTA: Eliminare il sangue se sono presenti trombi di grandi dimensioni o se il filtro si ostruisce.
    4. Posizionare il becher o il contenitore su un agitatore magnetico e regolare la velocità fino a quando la superficie del sangue inizia a girare delicatamente senza formare un grande vortice. Mescolate continuamente per almeno 5 minuti.
    5. Misurare l'ematocrito e la conta piastrinica per assicurarsi che i valori rientrino nell'intervallo normale per la specie.
  2. Eseguire le titolazioni per determinare la concentrazione target di CaCl2 .
    NOTA: Il sangue citrato viene ricalcificato per consentire la coagulazione e i test della trombosi, con l'aggiunta di eparina per prevenire la coagulazione incontrollata. Il tempo di coagulazione attivato (ACT) target per l'inizio del test è di 300 s. Si prega di notare che i valori di ACT di riferimento forniti in questa sezione sono stati ottenuti utilizzando sangue di pecora donata e possono variare a seconda della specie e del livello di anticoagulante utilizzato durante la raccolta. Inoltre, le misure ACT possono variare tra gli strumenti 32,33,34. Potrebbero essere necessari alcuni tentativi ed errori per stabilire l'intervallo ACT ottimale per una specifica configurazione di laboratorio.
    1. Trasferire 2 mL della soluzione preparata di 1 M di CaCl2 e 0,5 mL di eparina sodica (1000 U/mL) dalla confezione del produttore nelle provette per microcentrifuga per evitare la contaminazione delle soluzioni madre.
    2. Trasferire 10 mL di sangue in provette di polipropilene da 14 mL. Prepara quattro di questi tubi.
    3. Per ottenere una concentrazione di eparina di 0,5 U/mL nel sangue, aggiungere 5 μL di eparina sodica al campione di sangue da 10 mL.
    4. Per ottenere una concentrazione di calcio di 5 mM nel sangue, aggiungere 50 μL di soluzione di CaCl2 1 M al campione di sangue da 10 mL. Durante l'erogazione, agitare il puntale della pipetta per distribuire il CaCl2 su un'area più ampia.
    5. Immediatamente, capovolgere il tubo 10 volte, arrotolarlo orizzontalmente (su una superficie piana o tra i palmi), quindi capovolgerlo altre 10 volte per garantire una miscelazione accurata.
    6. Misurare l'ACT utilizzando un sistema di coagulazione del sangue intero point-of-care seguendo le istruzioni del produttore. L'ACT iniziale varia in genere tra 400 e 500 s.
    7. Mantenendo costante la concentrazione di eparina, aumentare la concentrazione di CaCl2 (a circa 7-8 mM) per ottenere un ACT di 300 s.
    8. Verificare la concentrazione finale e l'ACT risultante in una provetta di sangue separata.

4. Procedure preliminari al test

NOTA: Tutti i passaggi descritti in questa sezione si applicano alle Sezioni 5 e 6. Eseguire questi passaggi prima di azionare la pompa con albumina sierica bovina (BSA) o sangue nell'ansa. Trasferire il sangue tra i vasi utilizzando l'alimentazione per gravità per ridurre al minimo lo stress meccanico. Evitare di usare lo stantuffo della siringa per guidare il sangue, poiché ciò può creare una pressione eccessiva. Inoltre, evitare di strozzare il sangue attraverso aperture strette per evitare danni ai componenti cellulari.

  1. Riempimento e svuotamento del circuito di prova
    1. Collegare una linea di prolunga da 30 pollici alla porta di iniezione e collegare un serbatoio siringa da 60 ml come imbuto. Aprire il rubinetto del serbatoio in modo che funga da presa d'aria.
    2. Versare il liquido nell'imbuto, sollevandolo secondo necessità per velocizzare la limatura. Riempi l'anello fino a 1-2 cm sotto la presa d'aria nella parte superiore della borsa. Chiudere i rubinetti della presa d'aria e della porta di iniezione.
    3. Per drenare, aprire i rubinetti della presa d'aria e della porta di iniezione e abbassare l'imbuto sotto il livello del banco. Sollevare la pompa sopra la porta di scarico per evacuare il fluido rimanente.
  2. Disaerazione del ciclo di test
    NOTA: Eseguire questa procedura quando si riempie il circuito con BSA o sangue prima di avviare la pompa.
    1. Assicurarsi che non vi sia aria intrappolata in nessun punto del circuito. Rimuovi le bolle d'aria sulle superfici picchiettando e stringendo delicatamente il tubo e il serbatoio.
    2. Se si valuta una pompa del sangue a flusso assiale, ruotarla in posizione verticale per rilasciare l'aria attraverso la galleggiabilità. Se si utilizza una pompa centrifuga, capovolgerla e ruotarla per assicurarsi che l'aria non rimanga intrappolata nei percorsi del flusso secondario.
    3. Ispezionare attentamente le sezioni orizzontali dei tubi e le giunzioni tra tubi e connettori per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria.
    4. Spremere la sacca per flebo per avvicinare il livello del fluido alla parte stretta superiore e bloccare la sacca con un emostatico attraverso la linea del fluido per eliminare l'interfaccia fluido-aria. Chiudere il rubinetto di arresto della presa d'aria.
  3. Adescamento delle linee di pressione e della porta di campionamento
    1. Chiudere il rubinetto all'estremità delle linee di pressione, rimuovere il tubo del manometro e collegare una siringa da 3 ml. Aprire il rubinetto e aspirare 1-2 ml di liquido nella linea di prolunga (circa 4 cm).
    2. Chiudere il rubinetto, staccare la siringa e ricollegare il tubo del manometro. Aprire il rubinetto per abilitare le letture della pressione.
    3. Adescare il sample porta utilizzando una siringa.
  4. Pulizia delle porte di iniezione e campionamento
    1. Taglia o strappa una salvietta priva di lanugine in tre frammenti uguali. Ruota l'angolo di un frammento per formare una punta e inseriscilo nella porta per assorbire il sangue residuo.
    2. Attorcigliare il secondo frammento, inumidirlo con soluzione fisiologica e inserire la punta bagnata nella porta. Attorciglialo attorno alla porta per rimuovere tutto il sangue rimasto.
    3. Utilizzare il terzo frammento per assorbire l'eventuale soluzione salina residua nella porta.
      NOTA: Eseguire questa procedura di pulizia immediatamente dopo aver prelevato un campione di sangue o ogni volta che è presente sangue residuo nelle porte.

5. Passivazione delle superfici a contatto con il sangue

  1. Riempire l'ansa con una soluzione di BSA all'1% e azionare il VAD per farlo circolare per almeno 30 minuti.
  2. Ispezionare l'anello per verificare la presenza di perdite e rimontarlo se necessario.
  3. Drenare completamente la soluzione di BSA per evitare l'emodiluizione.

6. Test della trombosi

  1. Preparare il ciclo di prova.
    1. Riempire l'ansa con 150 ml di sangue.
    2. Disaerare il circuito e adescare le linee di pressione e la porta di campionamento come descritto nei passaggi 4.2-4.4.
    3. Avviare la pompa a bassa velocità e farla funzionare per circa 5 secondi per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno della pompa, quindi arrestare la pompa.
    4. Se compaiono delle bolle nel sacchetto, ripetere il passaggio 4.2 per eseguire nuovamente la disaerazione.
    5. Riavviare la pompa a bassa velocità per far circolare il sangue nel circuito.
  2. Aggiungi eparina al sangue nell'ansa.
    1. Trasferire 1 mL di eparina sodica (1000 U/mL) e 1,5 mL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; 0,5 M) dalla confezione del produttore in provette separate per facilitarne la manipolazione durante il test.
    2. Utilizzare la porta trasversale del rubinetto a 3 vie per somministrare le sostanze nell'ansa utilizzando una siringa. Ruotare il luer lock maschio sul rubinetto in modo che la porta di iniezione sia rivolta verso l'alto per intrappolare le bolle d'aria nella parte superiore.
    3. Raggiungere una concentrazione di eparina di 0,5 U/mL nell'ansa aggiungendo 75 U di eparina sodica a 150 mL di sangue. Aspirare 75 U di eparina (75 μL se si utilizza una concentrazione di 1000 U/mL) in una micropipetta e dispensarla in una siringa da 3 mL dispensando contemporaneamente la pipetta e tirando lo stantuffo della siringa. Assicurarsi che tutto il liquido venga trasferito senza fuoriuscire.
    4. Collegare la siringa alla porta di iniezione tramite il luer lock, con la porta rivolta verso l'alto e la punta della siringa rivolta verticalmente verso il basso. Aspirare lo stantuffo della siringa per riempirla di sangue e mescolare l'eparina con il sangue aspirando l'aria nella siringa. Lasciare che la bolla d'aria salga verso l'alto della siringa. Iniettare la miscela nel circuito, assicurandosi che non entri aria.
    5. Far entrare e uscire il sangue dalla siringa 4-5 volte per assicurarsi che il sangue eparinizzato non rimanga confinato nello spazio della porta. Assicurarsi che l'aria non entri nel circuito.
  3. Titola l'ATTO del sangue nell'ansa.
    1. Raggiungere una concentrazione iniziale di calcio di 5 mM nell'ansa aggiungendo 750 μL di soluzione di CaCl2 1 M a 150 mL di sangue utilizzando la stessa procedura dell'eparina.
      1. Il sangue esposto ad alte concentrazioni di calcio può iniziare a coagulare nella siringa. Iniettare rapidamente il fluido dopo aver rimosso l'aria residua. Facoltativamente, diluire il CaCl2 nella siringa con 1 ml di soluzione salina tamponata con TRIS per ridurre il rischio di coagulazione prematura.
    2. Lasciare che il CaCl2 iniettato circoli nell'ansa per almeno 2 minuti prima di prelevare un campione di sangue per misurare l'ACT iniziale.
    3. Collegare una siringa da 1 ml alla porta di campionamento. Prelevare ed eliminare 0,5 ml di sangue di scarto per eliminare il sangue stagnante dalla porta.
    4. Collegare una nuova siringa da 1 ml, prelevare 0,5 ml di sangue per l'analisi e misurare l'ACT. Pulire la porta di campionamento utilizzando la procedura descritta al punto 4.4.
    5. Fare riferimento ai valori di titolazione al punto 3.2 per indicare la concentrazione target di CaCl2 . Aumentare in modo incrementale la concentrazione di calcio per ottenere un ACT di 300 s. Evitare di aggiungere l'intera quantità di CaCl2 in una sola volta per evitare una rapida coagulazione.
      NOTA: Nei test utilizzati in questo studio, la concentrazione iniziale di calcio di 5 mM ha portato a un ACT di 450 ± 50 s e la concentrazione finale di 7-8 mM ha prodotto un ACT di 300 ± 20 s. Anche se questa risposta può variare, cerca di portare l'ACT a o al di sotto di 300 s per l'inizio del test.
  4. Inizia il test.
    1. Una volta raggiunto l'ACT di 300 s nel ciclo, iniziare il test di 1 ora. Regolare la pompa alla portata e alla pressione desiderate modificando la velocità del rotore e regolando la resistenza utilizzando la fascetta Hoffman.
    2. Misurare l'ACT ogni 15 minuti seguendo i passaggi 6.3.3-6.3.4.
    3. Se l'ACT scende al di sotto di 200 s, iniettare altri 25 U di eparina sodica nel circuito.
  5. Termina il test.
    1. Al termine di 1 ora, iniettare EDTA nell'ansa per inibire l'ulteriore coagulazione, mirando a una concentrazione finale di 5 mM nel sangue. (Iniettare 1,5 mL se si utilizza una soluzione di EDTA 0,5 M.)
    2. Lasciare circolare l'EDTA e mescolare per 2 minuti, quindi arrestare la pompa.
  6. Scollegare e lavare la pompa.
    1. Clamp il tubo collegato all'ingresso e all'uscita della pompa utilizzando emostatici, posizionando i clamps a 3-4 cm di distanza dalle punte di ingresso e uscita.
    2. Scollegare con cautela il tubo per rilasciare la pompa.
    3. Drenare il sangue dalla pompa e defluire in un contenitore.
    4. Lavare il sangue residuo dalla pompa mediante alimentazione per gravità o pipettaggio di soluzione fisiologica attraverso l'ingresso e l'uscita della pompa.
      NOTA: i passaggi 6.7 e 6.8 vengono eseguiti contemporaneamente.
  7. Ispezionare il percorso del flusso della pompa.
    1. Acquisisci immagini dell'ingresso e dell'uscita della pompa utilizzando una telecamera per endoscopio/boroscopio.
    2. Smontare la pompa (se applicabile). Lavare i componenti in un bagno salino e ispezionare la presenza di trombi utilizzando un cannocchiale da dissezione o una lente macro.
    3. Fotografare le superfici a contatto con il sangue per la documentazione.
      NOTA: Un'ispezione coerente e una documentazione approfondita sono fondamentali per i test comparativi.
  8. Filtra il sangue usato.
    1. Taglia un pezzo di tessuto a rete di nylon da 100 μm abbastanza grande da coprire l'apertura di un contenitore di raccolta.
    2. Posizionare la rete sopra il contenitore con un leggero telo per consentire al sangue di fluire efficacemente attraverso di esso. Fissare i bordi della rete per evitare che scivoli durante la filtrazione.
    3. Passare il sangue usato attraverso una rete di nylon. Smaltire il sangue secondo le linee guida per la gestione dei rifiuti biologici dell'istituto.
    4. Esaminare la rete alla ricerca di trombi catturati e documentare i risultati.
  9. Prepararsi per l'analisi istologica.
    1. Se è prevista un'analisi istologica, fissare eventuali trombi presenti nella soluzione di formalina seguendo le procedure di sicurezza appropriate.
      ATTENZIONE: Utilizzare sempre una cappa aspirante quando si maneggia la formaldeide.

7. Procedura di pulizia

  1. Smontare il circuito di flusso. Gettare la sacca di sangue in PVC e il tubo.
  2. Immergere tutti gli altri componenti a contatto con il sangue (connettori, rubinetti, luer lock, ecc.) in una soluzione detergente in polvere all'1% di enzima attivo per una notte. Sciacquare con acqua tiepida del rubinetto, seguita da acqua deionizzata e asciugare all'aria.
    1. Se rimangono coaguli, sonicare i componenti nella soluzione detergente. Risciacquare abbondantemente e asciugare all'aria.
  3. Pulire la pompa.
    1. Se la pompa può essere smontata, immergere e sonicare i componenti a contatto con il sangue con una soluzione detergente/sgrassante multiuso all'1%, seguita da una soluzione detergente in polvere attiva all'1% per gli enzimi.
    2. Se la pompa non può essere smontata, collegarla a un nuovo circuito di flusso riempito con soluzioni detergenti e farla funzionare ad alta velocità per almeno 30 minuti. Ripetere se necessario.
  4. Sciacquare accuratamente la pompa con acqua tiepida del rubinetto, seguita da acqua deionizzata e asciugare all'aria.

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Risultati

L'esecuzione di questo protocollo consente l'identificazione di aree localizzate di deposizione piastrinica, rivelando punti problematici all'interno del percorso del flusso della pompa. L'applicazione coerente di questo protocollo consente miglioramenti incrementali affrontando questi "punti caldi" identificati.

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Discussione

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Dichiarazioni

S.E.O. attualmente lavora come consulente per Magenta Medical e in precedenza è stato consulente presso Boston Scientific. Nessun altro autore ha informazioni finanziarie rilevanti o conflitti di interesse da segnalare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health grant R01HL089456 e dal progetto numero W81XWH2010387 dell'attività di acquisizione della ricerca medica dell'esercito degli Stati Uniti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 14 mLFalcon352059Provette in polipropilene a fondo tondo con tappo a scatto
Rubinetto a 1 viaQosina99759Luer Lock femmina, Luer maschio con rubinetto a
3 vieSpin Lock Qosina997712 Luer Lock femmina, cuvette Luer Lock maschio rotante
ACT+ per HemochronWerfen000JACT+45/Box
Per tutti gli usi detergente/sgrassatoreSimple Green2710200613005Simple Green Cleaner e Sgrassatore. Utilizzare una soluzione all'1%.
Connettori spinatiQosina73311Materiale: policarbonato; ¼ ” x ¼ ” connettore diritto
Connettori spinati con luer lockQosina73316Materiale: policarbonato; ¼ ” x ¼ ” connettore diritto con luer lock
Albumina sierica bovina (BSA)Thermo Scientific ChemicalsAAJ6465522O
equivalente Cloruro di calcio, CaCl2Thermo Scientific ChemicalsAA89866-30Anidro, ≥ 96,0% ACS
Endoscopio da dissezione (consigliato)Olympushttps://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/Olympus SZH10 (ingrandimento zoom continuo 7x - 70x) o DPBS simile
(senza calcio e magnesio)Gibco14200075soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio, 10X (deve essere diluito a 1X prima dell'uso)
Qualità EDTABiologico351-027-721EA0,5 M, pH 7,0 8.0 (acido etilendiamminertetraacetico)
Endoscopio/boroscopio/fotocamera per otoscopio (opzionale)Bebirdhttps://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers3– Diametro sonda 4 mm
Detergente in polvere attivo enzimaticoAlconox1304-1Alconox Tergazyme. Utilizzare una soluzione all'1%.
Linea di estensione, 30"Qosina 3621830" lunghezza,  femmina luer lock a maschio luer lock
Linea di estensione, 6"Qosina 362126" di lunghezza,  luer lock femmina a luer lock maschio
Luer lock femmina, spinatoQosina11548Si adatta a tubi ID da 1/8 di pollice; materiale: policarbonato;
Misuratore di portataTransonichttps://www.transonic.com/t402-t403-consolesTransonic TS410 modulo
EmostaticoFisherbrand13-820-004Emostatico di bloccaggio con lunghezza della punta di almeno 5 cm
Eparina SodicaMcKesson Servizi di imballaggio9495131000 U/mL di concentrazione
HoffmanHumboldtH8720Sacca per flebo con morsetto a filettatura fine
(serbatoio di sangue conforme)Qosina51494Materiale: PVC, 2 porte per tubi 0,258" ID. La sacca da 100 ml viene modificata utilizzando una termosigillatrice
Salviette prive di lanugineKimberly-Clark Professional34120Kimtech Science Wipers
Agitatore magneticoINTLLABMS-500O simile
Luer lock maschio, spinatoQosina11549Adatto a tubi ID da 1/8 di pollice; materiale: policarbonato;
Manometro (digitale)Sper Scientific840081SPER-840081 o similare
Nylon rete filtranteMcMaster-Carr9318T21100-μ m (0,0039") dimensione di apertura
Sangue ovinoLampire7209004Sangue intero del donatore, anticoagulato con ACD 14:86, spedito durante la notte
Sigillatrice termica per sacchetti di plasticaUlineH-190Uline H-190 o simile (senza taglierina)
Adesivo in gomma siliconicaSmooth-On B00IRC1YI0Sil-Poxy o simile
Siringa con luer lock, 1 mLFisher Scientific14-955-646Fisherbrand siringa manuale senza ago per scopi di ricerca
Siringa con luer lock, 3 mLFisher Scientific14-955-457Fisher siringa manuale senza ago per scopi di ricerca
Siringa con luer lock, 60 mLFisher Scientific14-955-461Siringa manuale Fisherbrand senza ago per scopi di ricerca
Filtro trasfusionaleHaemonetics Corporation SQ40S/SQ40NSHaemonetics Corporation SQ40S filtro per trasfusione di sangue a sfera
TRIS Soluzione salina tamponataThermo Scientific ChemicalsAAJ62938K2TBS 10x (deve essere diluito a 1X prima dell'uso), tubo pH 7,4
TuboTygonADF00017Tygon ND-100-65 (grado medico)
Sensore di flusso a ultrasuoniTransonichttps://www.transonic.com/hqxl-flowsensorsSelezionare il modello di sensore di flusso appropriato per le dimensioni del tubo utilizzato. Il sensore clamp-on ME6PXL si adatta al sensore da 3/8" Tubo OD. Il sensore è calibrato da Transonic per il fluido di prova (ad es. sangue a 24°C) e per il grado del tubo (ad es. Tygon ND-100-65)
Sonicatore a ultrasuoni (opzionale)Ultrasuoni BransonCPX952238R CPX2800HBranson o
sistema VADPediaFlowPF5Il sistema VAD da testare; include la pompa e il controller
Sistema di coagulazione del sangue interoWerfenhttps://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-eliteHemochron Signature Elite o Signature Jr
simile

Riferimenti

  1. Kirklin, J. K., et al. Eighth annual INTERMACS report Special focus on framing the impact of adverse events. J Heart Lung Transplant. 36 (10), 1080-1086 (2017).
  2. Kormos, R. L., et al. The Society of Thoracic Surgeons Intermacs Database Annual Report: Evolving indications, outcomes, and scientific partnerships. Ann Thorac Surg. 107 (2), 341-353 (2019).
  3. Leiderman, K., Fogelson, A. An overview of mathematical modeling of thrombus formation under flow. Thromb Res. 133 (SUPPL. 1), S12-S14 (2014).
  4. Anand, M., Rajagopal, K. A short review of advances in the modelling of blood rheology and clot formation. Fluids. 2 (3), 35(2017).
  5. Belyaev, A. V., Dunster, J. L., Gibbins, J. M., Panteleev, M. A., Volpert, V. Modeling thrombosis in silico: Frontiers, challenges, unresolved problems and milestones. Phys Life Rev. 26- 27, 57-95 (2018).
  6. Manning, K. B., Nicoud, F., Shea, S. M. Mathematical and computational modeling of device-induced thrombosis. Curr Opin Biomed Eng. 20, 100349(2021).
  7. Wu, W. T., Yang, F., Wu, J., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. High fidelity computational simulation of thrombus formation in Thoratec HeartMate II continuous flow ventricular assist device. Sci Rep. 6 (Decemeber), 1-11 (2016).
  8. Méndez Rojano, R., Lai, A., Zhussupbekov, M., Burgreen, G. W., Cook, K., Antaki, J. F. A fibrin enhanced thrombosis model for medical devices operating at low shear regimes or large surface areas. PLoS Comput Biol. 18 (10), e1010277(2022).
  9. Taylor, J. O., Meyer, R. S., Deutsch, S., Manning, K. B. Development of a computational model for macroscopic predictions of device-induced thrombosis. Biomech Model Mechanobiol. 15 (6), 1713-1731 (2016).
  10. Strong, A. B., Stubley, G. D., Chang, G., Absolom, D. R. Theoretical and experimental analysis of cellular adhesion to polymer surfaces. J Biomed Mater Res. 21 (8), 1039-1055 (1987).
  11. Sorensen, E. N., Burgreen, G. W., Wagner, W. R., Antaki, J. F. Computational simulation of platelet deposition and activation: I. Model development and properties. Ann Biomed Eng. 27 (4), 436-448 (1999).
  12. Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Wagner, W. R., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. Multi-constituent simulation of thrombus deposition. Sci Rep. 7 (1), 42720(2017).
  13. Yamane, T. How Do We Select Materials. Mechanism of Artificial Heart. , Springer. Tokyo. (2016).
  14. Sin, D., Kei, H., Miao, X. Surface coatings for ventricular assist devices. Expert Rev Med Devices. 6 (1), 51-60 (2009).
  15. Zhang, M., Tansley, G. D., Dargusch, M. S., Fraser, J. F., Pauls, J. P. Surface coatings for rotary ventricular assist devices: A systematic review. ASAIO J. 68 (5), 623-632 (2022).
  16. Linneweber, J., Dohmen, P. M., Kerzscher, U., Affeld, K., Nosé, Y., Konertz, W. The effect of surface roughness on activation of the coagulation system and platelet adhesion in rotary blood pumps. Artif Organs. 31 (5), 345-351 (2007).
  17. Jayaraman, A., Kang, J., Antaki, J. F., Kirby, B. J. The roles of sub-micron and microscale roughness on shear-driven thrombosis on titanium alloy surfaces. Artif Organs. 47 (3), 490-501 (2023).
  18. Jamiolkowski, M. A., Pedersen, D. D., Wu, W., Antaki, J. F., Wagner, W. R. Visualization and analysis of biomaterial-centered thrombus formation within a defined crevice under flow. Biomaterials. 96, 72-83 (2016).
  19. Zhussupbekov, M., Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Massoudi, M., Antaki, J. F. Influence of shear rate and surface chemistry on thrombus formation in micro-crevice. J Biomech. 121, 110397(2021).
  20. ASTM F1841-19: Standard practice for assessment of hemolysis in continuous flow blood pumps. , ASTM International. At https://www.astm.org/f1841-19.html (2019).
  21. Sarode, D. N., Roy, S. In vitro models for thrombogenicity testing of blood-recirculating medical devices. Expert Rev Med Devices. 16 (7), 603-616 (2019).
  22. Swier, P., Bos, W. J., Mohammad, S. F., Olsen, D. B., Kolff, W. J. An in vitro test model to study the performance and thrombogenecity of cardiovascular devices. ASAIO Trans. 35 (3), 683-686 (1989).
  23. Schima, H., et al. In vitro investigation of thrombogenesis in rotary blood pumps. Artif Organs. 17 (7), 605-608 (1993).
  24. Tayama, E., et al. In vitro thrombogenic evaluation of centrifugal pumps. Artif organs. 21 (5), 418-420 (1997).
  25. Paul, R., et al. In vitro thrombogenicity testing of artificial organs. Int J Artif Organs. 21 (9), 548-552 (1998).
  26. Jamiolkowski, M. A., Snyder, T. A., Perkins, I. L., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Preclinical device thrombogenicity assessments: Key messages from the 2018 FDA, industry, and academia forum. ASAIO J. 67 (2), 214-219 (2021).
  27. Maruyama, O., Tomari, Y., Suciyama, D., Nishida, M., Tsutsui, T., Yamane, T. Simple in vitro testing method for antithrombogenic evaluation of centrifugal blood pumps. ASAIO J. 55 (4), 314-322 (2009).
  28. Olia, S. E., et al. Preclinical performance of a pediatric mechanical circulatory support device: The PediaFlow ventricular assist device. J Thorac Cardiovasc Surg. 156 (4), 1643-1651.e7 (2018).
  29. Borovetz, H. S., Olia, S. E., Antaki, J. F. Toward the Development of the PediaFlowTM Pediatric Ventricular Assist Device: Past, Present, Future. Appl Eng Sci. 11, 100113(2022).
  30. Herbertson, L. H., et al. Multilaboratory study of flow-induced hemolysis using the FDA benchmark nozzle model. Artif Organs. 39 (3), 237-248 (2015).
  31. Olia, S. E., Herbertson, L. H., Malinauskas, R. A., Kameneva, M. V. A reusable, compliant, small volume blood reservoir for in vitro hemolysis testing. Artif Organs. 41 (2), 175-178 (2017).
  32. Doherty, T. M., Shavelle, R. M., French, W. J. Reproducibility and variability of activated clotting time measurements in the cardiac catheterization laboratory. Catheter Cardiovasc Interv. 65 (3), 330-337 (2005).
  33. Chia, S., Van Cott, E. M., Raffel, C. O., Jang, I. -K. Comparison of activated clotting times obtained using Hemochron and Medtronic analysers in patients receiving anti-thrombin therapy during cardiac catheterisation. Thromb Haemost. 101 (03), 535-540 (2009).
  34. Li, H., Serrick, C., Rao, V., Yip, P. M. A comparative analysis of four activated clotting time measurement devices in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Perfusion. 36 (6), 610-619 (2021).
  35. Hastings, S. M., Ku, D. N., Wagoner, S., Maher, K. O., Deshpande, S. Sources of circuit thrombosis in pediatric extracorporeal membrane oxygenation. ASAIO J. 63 (1), 86-92 (2017).
  36. Starling, R. C., et al. Unexpected abrupt increase in left ventricular assist device thrombosis. N Engl J Med. 370 (1), 33-40 (2014).
  37. Hastings, S. M., Deshpande, S. R., Wagoner, S., Maher, K., Ku, D. N. Thrombosis in centrifugal pumps: Location and composition in clinical and in vitro circuits. Int J Artif Organs. 39 (4), 200-204 (2016).
  38. Patel, M., Jamiolkowski, M. A., Vejendla, A., Bentley, V., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Effect of temperature on thrombogenicity testing of biomaterials in an in vitro dynamic flow loop system. ASAIO J. 69 (6), 576-582 (2023).
  39. ASTM F2888-19: Standard practice for platelet leukocyte count-An in-vitro measure for hemocompatibility assessment of cardiovascular materials. , ASTM International. Available from: https://www.astm.org/f2888-19.html (2019).
  40. Patel, M., Serna, C., Parrish, A., Gupta, A., Jamiolkowski, M., Lu, Q. Alternative anticoagulant strategy to improve the test sensitivity of ASTM F2888-19 standard for platelet and leukocyte count assay. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 112 (12), e35514(2024).

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