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Articolo metodologico

Saccharomyces cerevisiae Modelli di malattia di Alzheimer per lo screening di geni, mutazioni e sostanze chimiche che influenzano la produzione di amiloide-beta da parte della γ-secretasi

968 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/67733

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24 giugno 2025

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1Department of Agricultural Chemistry, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un sistema di lievito che ricostituisce la γ-secretasi umana. Questo sistema consente l'identificazione e lo studio delle mutazioni che influenzano l'attività e lo screening degli inibitori della γ-secretasi (GSI). Utilizzando le proprietà di perdita di funzione dei mutanti familiari della malattia di Alzheimer, è possibile eseguire lo screening per i modulatori della γ-secretasi (GSM).

Abstract

La γ-secretasi è un complesso proteasi incorporato nella membrana cellulare, costituito dalle subunità catalitiche della presenilina (PS1 o PS2) e da tre cofattori aggiuntivi: nicastrina, Aph-1 e Pen2. Scinde i domini transmembrana delle proteine transmembrana di tipo I, come la proteina precursore dell'amiloide (APP) e Notch. La scissione dell'APP genera i peptidi amiloidi β (Aβ), che si accumulano nei pazienti con malattia di Alzheimer. Nonostante le ricerche significative, l'esatto meccanismo di questa proteolisi unica, che si verifica all'interno dei doppi strati lipidici, non è ancora del tutto chiaro. Per studiare le proprietà enzimatiche della γ-secretasi, abbiamo stabilito un sistema reporter di lievito utilizzando substrati artificiali di γ-secretasi contenenti frammenti di APP o Notch fusi all'attivatore trascrizionale Gal4. L'attività della γ-secretasi è stata valutata mediante attivazione trascrizionale dei geni reporter al rilascio di Gal4 dai substrati legati alla membrana, come valutato dalla crescita del lievito o dall'attività della β-galattosidasi. Inoltre, abbiamo sviluppato un test in vitro per identificare le diverse forme di Aβ prodotte dai microsomi di lievito. Questi modelli di lievito forniscono una piattaforma per lo screening di mutazioni, geni e composti che influenzano la funzione della γ-secretasi. Studiando le proprietà di perdita di funzione dei mutanti PS1 della malattia di Alzheimer familiare (FAD), è possibile eseguire lo screening delle mutazioni soppressori del FAD e dei modulatori della γ-secretasi (GSM), oltre agli inibitori della γ-secretasi (GSI). In questo rapporto, descriviamo i metodi genetici e biochimici utilizzati per studiare l'attività della γ-secretasi nel sistema del lievito con i passaggi essenziali del protocollo per il video.

Introduzione

La γ-secretasi è responsabile della scissione intramembrana di oltre 150 proteine transmembrana di tipo I, tra cui la proteina precursore dell'amiloide (APP) e Notch1. L'importanza della scissione intramembrana include non solo il turnover proteico, ma anche la trasduzione del segnale attraverso i frammenti generati. Ad esempio, la lavorazione di APP produce piccoli peptidi di β amiloide (Aβ). Sebbene l'Aβ debba essere rimosso come prodotto di degradazione, nella malattia di Alzheimer si accumula nel cervello per formare placche senili2. D'altra parte, l'elaborazione di Notch è essenziale per la segnalazione NOTCH3, che è fondamentale per lo sviluppo. La γ-secretasi è costituita da quattro proteine transmembrana: presenilina (PS1 o PS2), nicastrina (NCT), faringe anteriore-1 (Aph-1a o 1b) e potenziatore della presenilina 2 (Pen2)4. Queste proteine hanno un totale di 19 domini transmembrana: ce ne sono nove in PS, sette in Aph1, due in Pen2 e uno in NCT. Il PS funge da subunità catalitica e contiene due residui di acido aspartico situati nei domini transmembrana TM6 e TM75. Durante la maturazione del complesso, il PS subisce una scissione endoproteolitica all'interno del suo loop idrofilo HL6, portando alla formazione di frammenti ammino-terminali e carbossilici-terminali4. Le mutazioni associate alla malattia di Alzheimer familiare (FAD) si trovano sia nel gene APP che nel gene PS2. Queste mutazioni missenso patogene influenzano negativamente l'attività della γ-secretasi, riducendo la sua capacità di elaborare efficacemente l'APP. Ciò porta ad un aumento della produzione delle forme Aβ42 inclini all'aggregazione piuttosto che della comune Aβ406. I meccanismi esatti con cui queste mutazioni interrompono la scissione rimangono poco chiari. I modulatori della γ-secretasi (GSM), che possono alterare il rapporto tra Aβ42 e altre forme di Aβ, si dimostrano promettenti come potenziali agenti terapeutici per il trattamento del morbo di Alzheimer abbassando i livelli di Aβ427.

Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato a lungo utilizzato come organismo modello per studiare le funzioni chiave nelle cellule eucariotiche, come la divisione cellulare, il trasporto delle proteine e l'autofagia. I ricercatori hanno impiegato la complementazione funzionale per studiare gli omologhi umani, tra cui il ciclo di divisione cellulare (CDC), la secrezione (SEC) e i geni correlati all'autofagia (ATG). La trasformazione dei mutanti del lievito con geni umani consente ai ricercatori di analizzare i processi cellulari da una prospettiva funzionale. Delle cinque famiglie conosciute di proteasi intramembrana, il lievito ne possiede solo tre: peptide segnale peptidasi (Ypf1), romboidi (Pcp1 e Rbd2) ed enzima di conversione Ras1 (Rce1). Tuttavia, non ci sono omologhi della γ-secretasi o della proteasi del sito-2 nel lievito8, rendendo l'approccio di complementazione non adatto. Nonostante l'assenza di controparti di lievito per queste proteasi, S. cerevisiae rimane prezioso per l'esplorazione delle proteine umane. Tecniche come i saggi di lievito uno-ibrido, due-ibrido e tri-ibrido, che utilizzano l'attivatore trascrizionale del lievito Gal4, vengono impiegate per rilevare le interazioni tra DNA, fattori di trascrizione, proteine o RNA9. Abbiamo modificato il sistema Gal4 per monitorare la proteolisi intramembrana mediata dalla γ-secretasi.

Abbiamo ricostituito con successo la reazione di scissione della γ-secretasi nel lievito introducendo la γ-secretasi umana insieme a substrati artificiali fusi a Gal4 (Figura 1)10. La reazione di scissione è stata monitorata attraverso il sistema reporter Gal, monitorando la crescita del lievito o misurando l'attività della β-galattosidasi. Inoltre, abbiamo identificato varie forme di Aβ (Aβ38, Aβ40, Aβ42, Aβ43 e Aβ45) rilasciate nei microsomi di lievito mediante immunoblotting (Figura 1)11.

Quando sono stati introdotti mutanti PS1 o APP correlati a FAD in questo sistema, sono stati osservati gradi variabili di attività con perdita di funzione12. Abbiamo condotto uno screening basato sulla crescita per identificare le mutazioni soppressori che ripristinano la funzione compromessa di questi mutanti FAD (Figura 2). Questi soppressori non solo hanno salvato il difetto, ma hanno anche migliorato in modo indipendente l'attività di rifilatura della γ-secretasi. In particolare, hanno ridotto i livelli delle forme più lunghe di Aβ, in particolare Aβ42, in modo simile ai modulatori della γ-secretasi (GSM) che abbassano l'Aβ42. Il sistema di ricostituzione del lievito consente lo screening di mutazioni, geni e composti che regolano l'attività, tra cui l'inibitore della γ-secretasi (GSI) e il modulatore (GSM)13.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di raggiungere due obiettivi principali: i) stabilire un sistema di screening della γ-secretasi basato sul lievito e ii) fornire un esempio di tecniche di ricostituzione per reazioni enzimatiche umane nel lievito, sottolineando l'essenza dei metodi di ricostituzione. Descriviamo i metodi in tre procedure chiave con i seguenti passaggi essenziali: 1) ricostituzione della γ-secretasi nel lievito, 2) esecuzione di un saggio in vitro della γ-secretasi utilizzando microsomi di lievito e 3-5) screening delle mutazioni della γ-secretasi e regolatori chimici nel lievito.

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Protocollo

1. Misurazione dell'attività della γ-secretasi utilizzando un sistema reporter di lievito

  1. Trasformare i plasmidi (Tabella 1) nel ceppo di lievito PJ-69-4A (Tabella 2) utilizzando il metodo standard dell'acetato di litio per esprimere la γ-secretasi e il suo substrato14. Per ricostituire la reazione di scissione, trasformare tre plasmidi: due per la γ-secretasi e uno per il substrato. Selezionare, trasformare su terreno di agar SC privo di Leu, Trp e Ura (SC-LWU).
  2. Per valutare la scissione del substrato per crescita, strisciare i ceppi di lievito su terreno SC-LWU privo di istidina e adenina (SC-LWHUAde) e incubare a 30 °C per 3 giorni.
  3. Utilizzare le dimensioni della colonia per valutare i livelli di espressione di HIS3 e ADE2. Valutare le dimensioni della colonia come segue: +++ rappresenta la crescita wild-type con colonie più grandi di 1 mm, - rappresenta nessuna crescita e ++ o + rappresenta la crescita parziale con colonie più grandi di 0,5 mm o più piccole di 0,5 mm, rispettivamente. L'espressione di questi geni è una misura indiretta dell'attività della γ-secretasi (Figura 1).
  4. Per valutare la scissione del substrato in base all'attività della β-galattosidasi, cioè il livello di espressione di lacZ (Figura 1), far crescere i ceppi in terreno SC-LWU a 30 °C fino a quando la coltura raggiunge una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL, corrispondente a OD600 di 0,8-1,0.
    1. Prelevare le cellule da una coltura da 1,5 mL mediante centrifugazione in provetta da 1,5 mL a 21.100 x g per 3 minuti a 4 °C, lavare con 100 μL di acqua ghiacciata e risospendere in 30 μL di D-tampone (20 mM Tris/Cl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5% glicerolo) con 1 mM di ditiotreitolo (DTT) e cocktail di inibitori della proteasi PI/acqua (1000x soluzione: 1 M p-amminobenzamidina (pABA), 1 mg/mL antidolorifico, 1 mg/mL aprotinina, 1 mg/mL leupeptina) e PIs/DMSO (soluzione 1000x: 1 M fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 0,1 M N-p-Tosl-L-fenilalanina clorometilchetone (TPCK), 1 mg/mL chimostatina, 1 mg/mL pepstatina).
    2. Aggiungere una perla di vetro lavata con acido appena sotto la superficie della soluzione e lisare le cellule facendo vorticare la miscela 10 volte alla massima velocità per 1 minuto mentre la si mette sul ghiaccio a intervalli di 1 minuto.
    3. Centrifugare le celle lisate a 21.100 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante come lisato grezzo.
    4. Preparare la miscela di reazione con 5-10 μL di lisato grezzo e 0,4 mL di tampone Z (40 mM NaH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4). Iniziare la reazione aggiungendo 80 μl di soluzione di o-nitrofenil-β-D-galattopiranoside (ONPG) allo 0,4%, quindi incubare a 37 °C fino a quando la soluzione diventa giallo pallido a causa della formazione di nitrofenolo.
    5. Arrestare la reazione aggiungendo 0,2 mL di soluzione 1 M Na2CO3 e misurare l'assorbanza a 420 nm per calcolare l'attività della β-galattosidasi.
    6. Quantificare le concentrazioni proteiche nei lisati grezzi utilizzando un kit di analisi delle proteine, basato sul metodo di Bradford utilizzando l'albumina sierica bovina (BSA) come standard. Preparare il reagente colorante diluendo 1 parte del brodo colorante con 4 parti di acqua deionizzata a doppia distillazione (DDI).
    7. Miscelare 1-5 μL di lisato o soluzione BSA con 100 μL di colorante diluito in un pozzetto per piastra per microtitolazione. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e misurare l'assorbanza a 595 nm. Determinare la concentrazione proteica dalla curva standard BSA.
      Unità β-galattosidasi = (1.000 x A420) / (t x c x V)
      dove t = tempo di incubazione, c = concentrazione proteica (mg/mL), V = volume di lisato nel saggio (mL). Un'unità di β-galattosidasi è definita come la quantità di enzima necessaria per idrolizzare 1 μmol di ONPG per produrre o-nitrofenolo e D-galattosio al minuto per mg di proteine.
  5. Per confermare l'espressione delle subunità della γ-secretasi e dei substrati, far crescere i ceppi in terreno SC-LWU a 30 °C fino a quando la coltura raggiunge OD600 0,8-1,0.
    1. Raccogliere le cellule da una coltura da 10 mL mediante centrifugazione in una provetta da 50 mL a 2.100 x g per 10 minuti a 4 °C, lavare con 1 mL di acqua ghiacciata seguita da centrifugazione in una provetta da 1,5 mL a 21.100 x g per 3 min a 4 °C e risospendere in 100 μL di tampone B88 (20 mM Hepes/KOH (pH 6,8), 250 mM di sorbitolo, 150 mM di KOAc, 5 mM di Mg(OAc)2) con 1 mM di DTT e i cocktail di inibitori della proteasi, PI/acqua e PI/DMSO.
    2. Aggiungere le perle di vetro appena sotto la superficie della soluzione e lisare la cellula agitando 10x alla massima velocità per 1 minuto mantenendo la miscela sul ghiaccio per intervalli di 1 minuto.
    3. Centrifugare i lisati a 845 x g per 2 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante come lisato totale che contiene la frazione di membrana.
    4. Miscelare 100 μL di lisato totale con 96 mg di urea e 40 μL di tampone campione SDS 6x (0,4 M Tris/Cl (pH 6,8), 12% SDS, 0,6M DTT, 0,05% Blu di bromofenolo, 50% glicerolo) e incubare a 65 °C per 10 minuti. L'aggiunta di urea è necessaria per prevenire l'aggregazione della presenilina.
    5. Analizzare l'espressione della γ-secretasi e dei suoi substrati analizzando campioni su gel di poliacrilammide Tris/glicina al 12,5% e immunoblotting.
    6. Rilevare la γ-secretasi e i suoi substrati mediante anticorpi contro presenilina, nicastrina, Aph1, Gal4, FLAG, HA o Pgk1 (controllo del carico) e l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) contro IgG di topo (per FLAG, HA e Pgk1), IgG di coniglio (per presenilina, Aph1 e Gal4) o IgG di cavia (per nicastrina).
    7. Per la rivelazione chemiluminescente, miscelare la soluzione A (50 mM Tris/Cl (pH 8,5), 1,25 mM di luminolo, 0,02 mM di acido p-cumarico) con la soluzione B (50 mM Tris/Cl (pH 8,5), 0,009% H2O2) immediatamente prima dell'uso. Incubare la macchia in un volume sufficiente della miscela per 1 minuto. Il volume richiesto dipende dalla dimensione del blot; per una macchia di 10 cm x 6 cm, si utilizzano 4 mL. Sviluppare il blot e quantificare l'intensità del segnale utilizzando l'analizzatore di immagini luminescenti.

2. Misura della produzione di Aβ mediante saggio microsomico in vitro

  1. Trasformare i plasmidi APP C55, APP C99 o γ-secretasi (Tabella 1) nel ceppo di lievito PJ-69-4A pep4Δ come descritto nel passaggio 1.1. esprimere separatamente la γ-secretasi e il suo substrato (Tabella 2; ceppi γ311, γ312 e γ313)14. Seleziona i ceppi C55 e C99 sul terreno di agar SC-U e il ceppo γ-secretasi sul terreno di agar SC-LW.
  2. Isolare i microsomi da ceppi di lievito che esprimono APP C55, APP C99 o γ-secretasi secondo il protocollo standard11. Separare i microsomi mediante centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio e recuperarli all'interfaccia saccarosio 1,2 M-1,5 M utilizzando una pipetta di plastica monouso. Determinare la concentrazione proteica nei microsomi misurando l'assorbanza a 260 nm dopo averli solubilizzati in SDS allo 0,2%.
  3. Preparare la miscela di reazione con due microsomi, cioè APPC55 o γ-secretasi, contenenti 40 μg di proteine ciascuno e γ-tampone (50 mM PIPES/KOH (pH 7,0), 250 mM di saccarosio, 1 mM di EGTA) in un volume finale di 12,5 μL. Solubilizzare miscelando con un volume uguale (12,5 μL) di CHAPSO al 2% in γ-tampone e incubare in CHAPSO all'1% per 1 ora.
  4. Per avviare la reazione, diluire le miscele quattro volte fino a un volume finale di 100 μL utilizzando γ-tampone contenente 1 miscela di inibitore della proteasi (PI): 50 μM di diisopropil fluorofosfato (DIFP), 50 μM di PMSF, 0,1 μg/mL di N α-p-tosil-L-lisina clorometil chetone (TLCK), 0,1 μg/mL di antidolore, 0,1 μg/mL di leupeptina, 0,1 mM di EGTA, 1 mM di tiolfano e 5 mM di fenantrolina (PNT) allo 0,25% di CHAPSO con 400 μg/mL di proteine. Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 24 ore. Se necessario, aggiungere lo 0,1% di fosfatidilcolina (PC), 10 μM L685,458 o DAPT (inibitori della γ-secretasi).
  5. Arrestare la reazione aggiungendo 500 μL di cloroformio/metanolo (2:1) e incubare per 1 ora con vortice intermittente. Aggiungere 900 μl di metanolo, mescolare e centrifugare a 21.100 x g per 15 minuti per raccogliere i peptidi Aβ nel pellet.
  6. Lavare il pellet con 500 μL di cloroformio/metanolo/acqua (1:2:0,8), lasciarlo asciugare all'aria, sospenderlo in 40 μL di tampone per campioni SDS e far bollire la miscela per 10 minuti. Analizza la produzione di Aβ analizzando i campioni su un gel di poliacrilammide Tris/Tricina al 16,5%. Per identificare le forme Aβ, utilizzare un gel di poliacrilammide Tris/Tricina al 10% con urea 8 M (pH 8,45).
  7. Rilevare l'Aβ mediante immunoblotting utilizzando l'anticorpo 82E1 specifico per il sito Asp-1 dell'Aβ umano e l'anticorpo secondario coniugato HRP contro le IgG di topo. Per la rilevazione chemiluminescente, miscelare quantità uguali di soluzione A e B immediatamente prima dell'uso, come descritto al punto 1.5.7, e incubare il blot in un volume sufficiente della miscela per 1 minuto. Il volume richiesto dipende dalla dimensione del blot; per una macchia di 10 cm x 6 cm, si utilizzano 4 mL.
  8. Sviluppa il blot e quantifica l'intensità del segnale utilizzando l'analizzatore di immagini luminescenti.

3. Screening per mutazioni della γ-secretasi o dell'APP con effetto modulatorio

  1. Per generare mutazioni casuali mediante PCR soggetta a errori, progettare primer per incorporare regioni sovrapposte di 40 bp del gene di interesse all'estremità 5' di ciascun primer.
  2. Preparare 50 μL di reazione PCR soggetta a errori in 1x tampone Taq con 50 ng di DNA stampo, 0,2 mM dGTP, 1 mM dATP/dTTP/dCTP, 3 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 1,25 U Taq polimerasi e 400 nM primer. Utilizzare il seguente protocollo PCR: 94 °C per 5 minuti, seguiti da 30 cicli di 94 °C per 30 secondi, 55 °C per 30 secondi e 72 °C per 120 secondi, terminando con 72 °C per 10 minuti. Questa impostazione produce un tasso di mutazione approssimativo di 1,9 mutazioni per kilobase10.
  3. Trasformare i frammenti di DNA mutagenizzato (4 μg) con DNA plasmidico linearizzato (4 μg) in ceppo di lievito PJ69-4A contenente mutazioni FAD, APP o PS114. La sovrapposizione di 40 bp nei primer facilita la ricombinazione omologa tra i frammenti nel lievito, portando alla ricostruzione del plasmide. Selezionare i trasformanti sulle piastre SC-LWU come descritto al punto 1.1.
  4. Conta i trasformanti sulle piastre SC-LWU e replicali sulle piastre SC-LWHUAde usando il velluto. Per replicare, premere la piastra trasformante su un blocco cilindrico ricoperto di velluto, quindi premere una nuova piastra SC-LWHUAde sul velluto per trasferire le colonie. I ceppi che esprimono mutanti FAD APP o PS1 crescono male su SC-LWHUAde, mentre quelli con mutazioni modulatorie mostrano una crescita robusta e formano colonie.
  5. Per recuperare il DNA plasmidico da cloni positivi, coltivare i ceppi in 3 mL di terreno SC-LWU per una notte a 30 °C fino aOD 600 >1,0. Centrifugare le cellule in una provetta da 15 mL a 2.100 x g per 10 min a 4 °C, lavare con 0,8 mL di acqua ghiacciata seguita da centrifugazione in una provetta da 1,5 mL a 21.100 x g per 3 min a 4 °C, quindi risospendere in 0,3 mL di soluzione di lisi (10 mM Tris/Cl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% Triton X-100, 1% SDS).
  6. Lisi le cellule aggiungendo 0,3 mL di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1) e 0,3 g di perle di vetro. Agitare alla massima velocità per 10 min, quindi centrifugare a 21.100 x g per 10 min a temperatura ambiente.
  7. Dopo la centrifugazione, il campione si separa in una fase acquosa superiore e una fase fenolica inferiore. Recuperare la fase acquosa e miscelare con 30 μl di acetato di sodio 3 M e 700 μl di etanolo al 100%. Evitare di prendere materiali sull'interfase.
  8. Centrifugare la soluzione a 21.100 x g per 10 minuti a 4 °C, lavare il pellet con etanolo al 70%, asciugare all'aria e risospendere in 15 μl di tampone TE.
  9. Poiché la concentrazione di DNA plasmidico è in genere troppo bassa per ulteriori analisi, è necessario amplificarla in E. coli. Trasformare il DNA plasmidico in E. coli DH5α con metodi di trasformazione ad alta efficienza15 e purificare per ulteriori analisi. Identificare le mutazioni mediante sequenziamento del DNA utilizzando il metodo Sanger16.
  10. Questo metodo è applicabile a plasmidi mutagenizzati preparati con metodi diversi (come nelle fasi 3.1 e 3.2). Se si prendono di mira regioni proteiche specifiche, progettare primer di PCR inversa con nucleotidi casuali. Dopo la PCR e la legatura per circolarizzare il DNA plasmidico, si ottiene una libreria di plasmidi mutagenizzati. Introdurre mutazioni specifiche utilizzando il kit di mutagenesi sito-specifica.

4. Screening per l'inibitore della γ-secretasi (GSI) nel lievito

  1. Utilizzare lo screening chimico ad alto rendimento del GSI sviluppato sulla base della crescita del lievito o del saggio della β-galattosidasi, come descritto di seguito.
  2. Condurre lo screening GSI con ceppi di lievito, γ124, γ126 e γ190 (Tabella 2). Selezionare i candidati GSI come composti che riducono la crescita o l'attività della β-galattosidasi della γ-secretasi wild-type su APP (γ124) e/o Notch (γ126) (Tabella 3).
  3. Selezionare GSI APP sparing o Notch-sparing specifici per il substrato. Escludere i composti tossici mediante contro-screening con l'espressione solubile di Gal4. I candidati GSI non devono influenzare la crescita o l'attività della β-galattosidasi del ceppo di controllo Gal4 (γ190) (Tabella 3).
  4. Per il test di crescita, coltivare ceppi in terreno SC-LWHUAde contenenti potenziali GSI in piastre a 384 pozzetti da OD600 di 0,03. Incubare per una notte a 30 °C senza agitare. Monitorare la crescita dopo 24 ore con OD600.
  5. Per i saggi di β-galattosidasi in un formato a 384 pozzetti, far crescere i ceppi a una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL in terreno SC-LWU contenente potenziali GSI. Lisi le cellule utilizzando il sistema di dosaggio Beta-Glo e misurare l'attività della β-galattosidasi utilizzando la 6-o-β-galattopiranosil-luciferina come substrato secondo il protocollo del produttore.
  6. Per i candidati GSI, misurare la produzione di Aβ mediante saggio microsomico in vitro per confermare l'effetto inibitorio.

5. Screening per il modulatore della γ-secretasi (GSM) nel lievito

  1. Utilizzare lo screening chimico ad alto rendimento del GSM, che è stato sviluppato sulla base della crescita del lievito o del saggio della β-galattosidasi, come descritto di seguito.
  2. Condurre lo screening GSM con ceppi di lievito, γ106, γ112 e γ5 (Tabella 2). Selezionare i candidati GSM come composti che aumentano la crescita o l'attività della β-galattosidasi di FAD PS1 (γ106 e γ112) o di ceppi mutanti FAD APP (Tabella 4). Escludere le sostanze chimiche attivatrici reporter non specifiche mediante controscreening con il ceppo senza γ subunità catalitica secretasi. I candidati GSM non devono influenzare la crescita o l'attività della β-galattosidasi del ceppo di controllo senza PS1 (γ5) (Tabella 4).
  3. Per il test di crescita, coltivare ceppi in terreno SC-LWHUAde contenenti potenziali GSM in piastre a 384 pozzetti da OD600 di 0,03. Incubare per una notte a 30 °C senza agitare. Monitorare la crescita dopo 48 ore con OD600.
  4. Per i saggi di β-galattosidasi in un formato a 384 pozzetti, far crescere i ceppi a una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL in terreno SC-LWU contenente potenziali GSM. Lisare le cellule utilizzando il sistema di dosaggio Beta-Glo e misurare l'attività della β-galattosidasi utilizzando 6-o-β-galattopiranosil-luciferina come substrato secondo il protocollo del produttore.
  5. Per i candidati GSM, misurare la produzione di Aβ mediante saggio microsomico in vitro per confermare l'effetto modulatorio, cioè la riduzione delle forme tossiche di Aβ Aβ42 e Aβ43.

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Risultati

Utilizzando le tecniche descritte finora, abbiamo analizzato geni, mutazioni, sostanze chimiche e peptidi come fattori che influenzano l'attività della γ-secretasi 10,11,12,13,17,18,19. Lo screening basato sulla crescita di geni e mutazioni consente di testa...

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Discussione

Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi
La ricostituzione della γ-secretasi nel lievito utilizzando metodi genetici e biochimici è relativamente semplice, ma ci sono alcuni passaggi critici per garantire il successo.

Durante la trasformazione del lievito (fasi 1.1, 2.1 e 3.3), dovrebbero essere introdotti più plasmidi: due per i componenti della γ-secretasi e uno per i substrati. È possibile eseguire anche trasformazioni ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Number 22K06121. Gli autori desiderano ringraziare i membri del Laboratorio di Enzimologia dell'Università di Tohoku.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpi
anti-Amiloid & beta; (N) (82E1) anticorpoIBLCat# 10323
anticorpo anti-Aph1a, 245-265 (C terminale)BioLegendCat# 823101
Anticorpo antiFLAG (M2)SigmaCat# F3165
Anticorpo anti-Gal4SigmaCat# G9293
Anticorpo anti-HA (12CA5)SigmaCat# 11 583 816 001
Anticorpo anti-NicastrinChemiconCat# AB5890
Anticorpo anti-PGK1 (22C5D8)abcamCat# ab197960
anticorpi anti-PS1 N-terminale (G1Nr) o ad anello (GIL)Takasugi et.al., J. Biol. Chem., 277, 50198-50205
anticoniglio & nbsp; IgG, anticorpo collegato all'HRPSegnalazione cellulareCatalogo #7074
IgG-HRP anti-caviaSanta Cruz BiotecnologiaCat# sc-2438
anti-mouse IgG, anticorpo legato all'HRPSegnalazione cellulareCat# 7076
ceppi batterici e di lievito
E. coli DH5 & alpha;InvitrogenCat# 18265017
S. cerevisiae PJ-69-4AJames P. et. al., Genetics 144:1425-1436 (1996)
Sostanze chimiche, peptidi, proteine ricombinanti
(3,5-Difluorofenilacetil)-Ala-Phg-OBut (DAPT)Istituto dei PeptidiCat# 3219-v
Aminoide &beta-proteina (Umano, 1-38)Istituto dei PeptidiCat# 4484-v
Aminoide &beta-proteina (Umano, 1-40)Istituto dei PeptidiCat# 4307-v
Proteina amiloide &beta-proteina (Umano, 1-42)Istituto dei PeptidiCat# 4349-v
Proteina amiloide β-proteina (Umano, 1-43)Istituto dei PeptidiCat# 4370-v
Antidolore, diidrocloruroIstituto dei PeptidiCat# 4062
aprotininaSigmaCat# A1153
CHAPSODojindoCat# 343-05163
CimostatinaSigmaCat# C7268
Diisopropile fluorofosfato (DIFP)Chimica WakoCat# 049-18921
L685.458Istituto dei PeptidiCat# 4394-v
LeupeptinIstituto dei PeptidiCat# 4041
N-p-Tosil-L-fenilalanina clorometil chetone (TPCK)SigmaCat# T4376
Nα -p-tosil-L-lisina clorometil chetone (TLCK)SigmaCat# T7254
o-nitrofenil-β-D-galattipiranoside (ONPG)SigmaCat# N1127
p-aminobenzamidina (pABA), dicloridratoSigmaCat# 857661
Pepstatina ASigmaCat# P5318
Fenantrilina (PNT)SigmaCat# P9375
Fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF)SigmaCat# P7626
fosfatidilcolina (PC), tuorlo d'uovo, Tipo XVI-ESigmaCat# P3556
Taq DNA polimerasiTakaraCat# R001A
ThiolphanSigmaCat# T6031
kit commerciali per analisi, altri materiali e strumenti
Sistema di analisi beta-gloPromegaCat# E4720
Kit per il test proteico Bio-RadBio-RadCat# 5000001
Perline di vetro, lavate all'acido (425-600 μ m)SigmaCat# G8772
ImageQuant LAS4000GE HealthcareImageQuant LAS4000
Kit di Mutagenesi Diretto dal sito QuikChangeAgilentCat# 200518

Riferimenti

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