Contenuto di flavonoidi durante la crescita e lo sviluppo floreale della Calendula officinalis L.

Il crescente interesse per i metaboliti secondari delle piante medicinali è guidato dalle loro diverse applicazioni nell'industria farmaceutica, terapeutica, cosmetica e in altre industrie. Tra questi c'è la Calendula officinalis L., una pianta erbacea annuale della famiglia delle Asteraceae originaria della regione mediterranea¹ ma ampiamente coltivata in tutto il mondo, ha ottenuto riconoscimenti grazie ai vari usi dei suoi fiori, tra cui applicazioni ornamentali, medicinali, industriali e culinarie². Attualmente, l'Inghilterra è il più grande produttore mondiale di C. officinalis³.

I capolini sono l'organo più utilizzato di questa pianta in quanto contengono composti bioattivi come flavonoidi, carotenoidi, terpenoidi, oli essenziali, tannini, cumarine, carboidrati e acidi grassi 3,4,5,6. Questi composti naturali contribuiscono alle sue proprietà farmacologiche, tra cui effetti antinfiammatori, antiossidanti, antimicrobici e cicatrizzanti⁷. Storicamente, C. officinalis, comunemente noto come calendula, è stato utilizzato nei sistemi di medicina tradizionale come l'Ayurveda e l'omeopatia per alleviare una vasta gamma di disturbi, dalle ferite cutanee e dai disturbi gastrointestinali alle irregolarità mestruali^{e alle condizioni} infiammatorie. Le applicazioni moderne si estendono all'industria farmaceutica, alimentare e cosmetica, dove gli estratti di calendula sono incorporati in creme, sieri, tinture e sistemi di somministrazione di farmaci⁹. Nonostante l'ampia ricerca, permangono sfide per sfruttare appieno il potenziale terapeutico di C. officinalis. La variabilità della concentrazione di composti bioattivi dovuta a fattori ambientali e di coltivazione evidenzia la necessità di processi di estrazione e formulazione standardizzati. L'attività biologica dei flavonoidi e la loro identificazione nei tessuti vegetali sono aspetti essenziali del controllo di qualità^10,11.

In Messico, la coltivazione della calendula avviene spesso senza una comprensione dettagliata dei suoi processi di crescita e dello sviluppo floreale, limitando così le sue prestazioni fisiologiche, la resa e la correlazione tra composti bioattivi e fattori agronomici. La concentrazione e la distribuzione dei flavonoidi nei tessuti vegetali sono influenzate dalle condizioni di crescita e di coltivazione, sottolineando l'importanza di studiare i processi fisiologici e di sviluppo di questa specie.

Questo studio ha avuto lo scopo di analizzare la distribuzione della biomassa e le relazioni tra pozzi e fonti negli organi vegetativi e riproduttivi di C. officinalis, per identificare i principali eventi di sviluppo floreale e per quantificare la concentrazione totale di flavonoidi nei capolini mediante un metodo microspettrofotometrico qui proposto. I risultati mirano a ottimizzare le pratiche agricole e migliorare la qualità dei prodotti derivati da questa pianta.

1. Materiali e metodi generali

1. Esperimento sul campo per rilevare l'iniziazione floreale
   1. Configurare l'esperimento in condizioni di campo. Trapiantare piantine di calendula su una superficie di 153 m² con una densità di impianto di piante per metro quadrato, distanziate di 60 cm l'una dall'altra.
   2. Stabilire il sistema di irrigazione a goccia localizzato con calibro 16/8000 NOTA: Il lotto di semi utilizzato in questo esperimento è stato raccolto da un singolo genotipo, quindi selezionato con il metodo di selezione di massa in tre cicli di coltivazione precedenti. Per un clima temperato, il periodo di semina è migliore nella stagione primaverile, seguita dal trapianto circa 2 mesi dopo, quando le piantine sono pronte. L'irrigazione è consigliata una volta alla settimana. Parassiti e malattie dovrebbero essere evitati e la gestione agronomica dovrebbe essere effettuata in base alle esigenze della coltura.
2. Raccogli campioni da piante selezionate a giorni alterni, a partire da 14 giorni dopo il trapianto. Cercare il meristema apicale al microscopio stereoscopico (circa 40X) per determinare la data di comparsa del primordio dell'infiorescenza.
   NOTA: Quando il meristema floreale (FM) appare in almeno la metà dei campioni, questa data può essere registrata come l'età corretta per FM. L'unità sperimentale per osservare l'iniziazione floreale era composta da cinque meristemi in una singola pianta, con otto repliche (piante). Analisi della crescita e dello sviluppo floreale
   1. Raccogli il capolino apicale quando il bocciolo floreale si apre.
      NOTA: Assicurati che i fiori ligulati siano visibili.
   2. Effettuare raccolte di organi floreali durante le ultime sette fasi floreali¹² (Figura 1).
      NOTA: In questo esperimento, sono stati utilizzati cinque capitulum di otto piante diverse in ogni fase fenologica. In tutti i casi, i fiori sono stati raccolti dalla parte apicale della pianta.
   3. Campiona piante intere in sei volte attraverso il ciclo biologico.
   4. Asciugare i campioni raccolti per 48 ore. Misurare il peso secco degli organi vegetativi e riproduttivi.
      NOTA: Si consiglia l'essiccazione a 40 °C in un forno a circolazione d'aria.
   5. Calcolare la forza di assorbimento (SS) e l'attività di assorbimento (SA) sia per gli organi vegetativi che per quelli riproduttivi¹³.
      NOTA: per SS e SA, utilizzare le formule equivalenti rispettivamente al tasso di crescita assoluto (AGR) e al tasso di crescita relativo (RGR).
   6. Traccia le curve di crescita utilizzando un foglio di calcolo.

2. Quantificazione dei flavonoidi totali¹⁴

1. Essiccare il materiale vegetale in una stufa ad aria forzata a 40 °C per 48 ore.
2. Conservare il materiale essiccato in sacchetti di carta. Tenerli al buio a temperatura ambiente (RT).
3. Congelare il materiale vegetale utilizzando azoto liquido per prepararlo alla macinazione.
4. Macinare il materiale congelato in un mortaio di porcellana fino a raggiungere una consistenza uniforme.
   NOTA: Prestare attenzione quando si maneggia l'azoto liquido, poiché potrebbe schizzare a contatto con il materiale vegetale.
5. Preparazione del campione: pesare 25 mg di sostanza secca polverizzata da ciascun campione. Aggiungere 500 μl di metanolo all'80%.
6. Estrazione dei flavonoidi: Incubare la miscela in un'ecografia a 70 °C per un'ora. Quindi centrifugare a 731 g per 13 min¹⁵.
7. Preparare le aliquote: Prelevare 150 μL dell'estratto ottenuto e aggiungere 37 μL di metanolo all'80%.
8. Mescolare 50 μl di estratto, 100 μl di cloruro di alluminio al 10% e 100 μl di acetato di potassio 1 M. Aggiungere acqua distillata per portare il volume totale a 5 ml.
9. Lasciare riposare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente.
10. . Uno spettrofotometro è stato utilizzato per misurare l'assorbanza a 415 nm.
11. Generare la curva di calibrazione: Preparare una soluzione madre sciogliendo 2,7 mg di quercetina in 10 mL di metanolo all'80%. Da questo stock, preparare una serie di 5 soluzioni di quercetina che vanno da 50, 100, 175, 250 e 350 μL. e diluire a 10 mL.
12. Preparare i campioni di calibrazione: per ogni soluzione di quercetina (500 μL), aggiungere 100 μL di cloruro di alluminio al 10% e 100 μL di acetato di potassio 1M, 1,5 mL di metanolo all'80% e 2,8 mL di acqua distillata.
13. Lasciare riposare la soluzione per 40 minuti a temperatura ambiente.
14. Misurare l'assorbanza dei campioni di calibrazione a 415 nm con lo spettrofotometro. Registrare i valori di assorbanza per costruire la curva di calibrazione.
    NOTA: Confrontare la concentrazione totale di flavonoidi nei fiori di raggio, nei fiori tubolari e nei capolini interi. Questo esperimento ha utilizzato un disegno sperimentale completamente randomizzato con cinque ripetizioni per trattamento. La variabile di risposta era la concentrazione di flavonoidi; i mezzi di trattamento sono stati confrontati con il test di Tukey (SAS Institute, 2003).

La crescita di C. officinalis ha mostrato una cinetica di accumulo di biomassa sigmoidea in tutta la pianta e nei suoi organi. Questa osservazione si allinea con i rapporti di altri autori, che mostrano costantemente una curva di crescita sigmoidea. Tra gli organi aerei, gli steli hanno accumulato la maggior parte della biomassa (Figura 3). La crescita iniziale in tutti gli organi aerei è stata lenta, con la fioritura e lo sviluppo delle gemme a partire dal giorno 41. La pianta ha raggiunto la sua biomassa massima il giorno 69, con una media di 76 g per pianta.

Il comportamento cinetico della forza di affondamento (SS) per gli organi principali della pianta è stato valutato dall'impollinazione fino a 77 giorni dopo il trapianto (Figura 3). I risultati mostrano che gli organi vegetativi (radice, fusto, foglia) hanno continuato a crescere mentre si sviluppavano i capolini dei fiori. Pertanto, c'era competizione per i nutrienti tra gli organi vegetativi e riproduttivi. Gli organi vegetativi hanno dimostrato una SS significativamente più alta rispetto ai capolini dei fiori. Gli organi vegetativi hanno raggiunto il loro massimo SS (2,2 g/giorno) il giorno 50, mentre gli organi riproduttivi hanno raggiunto il loro tasso di crescita più alto (0,64 g/giorno) il giorno 62.
Il tasso di crescita relativo (RGR) della pianta di calendula e dei suoi organi (Figura 4) è diminuito con la maturazione della coltura. Questo declino è attribuibile alla riduzione proporzionale del tessuto meristematico della pianta. I valori di picco di RGR sono stati osservati il giorno 48 negli organi riproduttivi, che hanno mostrato il tasso di crescita più veloce (0,137 g/g/giorno), mentre gli organi vegetativi hanno mostrato il tasso di crescita più veloce (0,16 g/g/giorno) molto prima, il giorno 21. Gli organi riproduttivi sono stati in grado di superare gli organi vegetativi solo dopo il giorno 44. Da questo giorno in poi, la pianta ha progressivamente ridotto l'attività meristematica per la generazione delle foglie, aumentando al contempo l'attività dei meristemi riproduttivi.

L'iniziazione floreale rappresenta la transizione di un meristema da vegetativo (producendo solo foglie) a riproduttivo (formando primordii floreali che si svilupperanno in capolini ). Morfologicamente, questa transizione avviene rapidamente ed è visivamente identificabile al microscopio dal passaggio da un piccolo apice vegetativo a forma di cupola a un apice riproduttivo più grande e appuntito con piccole sporgenze laterali16. Tale differenziazione comporta cambiamenti istologici, fisiologici e biochimici negli apici17.

Nelle piante di calendula in vaso, i cui capolini sono gli organi primari raccolti per scopi medicinali e ornamentali, l'iniziazione floreale si è verificata nella quinta settimana dopo il trapianto, quando viene coltivata nelle alte valli centrali del Messico (Tabella 1).

Sono state rilevate differenze nella concentrazione totale di flavonoidi (espressi in equivalenti di quercetina) tra gli stadi dello sviluppo floreale. I contenuti più elevati sono stati osservati tra l'ottavo e l'undicesimo stadio, corrispondenti a gemme con sepali separati a capolini completamente aperti. Questi risultati suggeriscono che la raccolta dei capolini di calendula per scopi terapeutici dovrebbe essere effettuata durante queste fasi per massimizzare il contenuto di flavonoidi. Nelle fasi precedenti (gemme con sepali uniti) o nelle fasi successive (capolini senescenti), le concentrazioni di flavonoidi erano inferiori dal 22% al 27% rispetto ai capolini completamente aperti.

Se si considera la produzione di flavonoidi per pianta (Tabella 2), gli stadi sette e otto hanno prodotto il più alto contenuto di flavonoidi nei capolini dei fiori. Queste informazioni sono significative per la produzione commerciale di calendula, in quanto facilitano non solo le rese massime di flavonoidi, ma anche la standardizzazione per l'elaborazione di fitofarmaci.
Figura 1: Fasi dello sviluppo floreale nella calendula. La figura illustra le fasi di sviluppo floreale della Calendula officinalis L., comunemente nota come calendula. Fornisce una rappresentazione visiva della progressione dallo stadio iniziale di gemma alla senescenza del capolino e all'inizio della formazione dei frutti (achenio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Cinetica di distribuzione della biomassa nella calendula. Questa figura illustra come la biomassa viene allocata tra i diversi organi della pianta nel tempo, evidenziando i cambiamenti nell'accumulo di biomassa in varie parti della pianta, come steli, foglie, fiori e radici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cinetica della forza di affondamento (SS) degli organi vegetativi e riproduttivi nella calendula durante il suo ciclo. Questa figura mostra come la forza di assorbimento varia tra gli organi della pianta, come steli, foglie e fiori, dall'inizio alla fine del ciclo di vita della pianta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Cinetica dell'attività di sink (SA) negli organi vegetativi e riproduttivi della calendula lungo il suo ciclo. La figura illustra come il livello di attività associato alla domanda di risorse cambia nel tempo per diverse parti della pianta, come steli, foglie e fiori. Riflette i cambiamenti della pianta dalle prime fasi di crescita alla maturità e allo sviluppo riproduttivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Concentrazione totale di flavonoidi (mg/g di sostanza secca) durante lo sviluppo floreale della calendula. La figura mostra le quantità di flavonoidi presenti nella sostanza secca dei fiori di calendula nelle diverse fasi di sviluppo. Questa metrica aiuta a capire come si evolve il contenuto di flavonoidi man mano che i fiori maturano. I risultati sono le medie confrontate con il test HSD di Tukey (p > 0,05) n=5. Le barre rappresentano l'errore standard. Lettere diverse indicano differenze significative. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Sequenza degli eventi di sviluppo floreale nella calendula. Questa tabella aiuta a comprendere la progressione dello sviluppo floreale nella calendula, descrivendo le fasi dalla formazione iniziale delle gemme alla piena fioritura e allo sviluppo dei frutti (achenio). *I risultati sono mostrati come errore medio ± standard (n = 5). Ci sono state differenze significative tra i trattamenti secondo l'analisi della varianza (p ≤ 0,05). Le diverse lettere indicano differenze significative tra il test delle medie di Tukey ( α = 0,05, n = 5). ND:Non rilevato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Contenuto totale di flavonoidi nei capolini di calendula durante lo sviluppo floreale. Questa tabella mostra come la concentrazione di flavonoidi varia dalla formazione iniziale delle gemme alla piena fioritura e allo sviluppo dei frutti (achenio). I dati evidenziano le fasi ottimali per la raccolta e la massimizzazione del contenuto di flavonoidi. Produzione di flavonoidi (g/pianta) = [Peso secco dell'organo floreale (g/pianta) × Concentrazione di flavonoidi (mg/g) Clicca qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.