Contenuto di flavonoidi durante la crescita e lo sviluppo floreale della Calendula officinalis L.

Sommario

Qui presentiamo il metodo colorimetrico del cloruro di alluminio, una tecnica analitica diretta per determinare quantitativamente i flavonoidi nella calendula. Questo approccio utilizza una semplice reazione chimica che coinvolge il trattamento dell'estratto di calendula con un reagente di cloruro di alluminio, formando un complesso colorato. L'intensità del colore, valutata mediante spettrofotometria, è correlata alla concentrazione di flavonoidi.

Abstract

Calendula (Calendula officinalis L.) con molteplici usi, in particolare le sue applicazioni medicinali grazie alla sua ricchezza e diversità di metaboliti secondari, come i flavonoidi, che possiedono proprietà antinfiammatorie e antiossidanti. Questo studio ha analizzato la crescita delle piante e la distribuzione della biomassa, nonché la concentrazione totale di flavonoidi nei fiori tubolari, ligulati e nei capolini durante lo sviluppo floreale. . L'iniziazione e la differenziazione floreale si sono verificate cinque settimane dopo il trapianto, seguendo un modello sigmoideo di accumulo di biomassa nei suoi organi e nell'altezza della pianta. Gli organi aerei hanno raggiunto una biomassa massima di 76 g/g/pianta il giorno 69. Il tasso di crescita assoluto massimo è stato di 2,38 g/die a 62 giorni, mentre il tasso di crescita relativo più alto è stato registrato negli organi riproduttivi il giorno 48 (0,137 g/g/die). I flavonoidi, espressi come equivalenti di quercetina, hanno mostrato concentrazioni più elevate durante le fasi che vanno dai boccioli dei fiori in procinto di aprirsi ai capolini completamente aperti (145-177 mg/g di sostanza secca). Questi risultati sottolineano l'importanza della raccolta in fasi ottimali per massimizzare il contenuto di flavonoidi e sfruttare il loro potenziale per applicazioni terapeutiche e commerciali.

Introduzione

Il crescente interesse per i metaboliti secondari delle piante medicinali è guidato dalle loro diverse applicazioni nell'industria farmaceutica, terapeutica, cosmetica e in altre industrie. Tra questi c'è la Calendula officinalis L., una pianta erbacea annuale della famiglia delle Asteraceae originaria della regione mediterranea¹ ma ampiamente coltivata in tutto il mondo, ha ottenuto riconoscimenti grazie ai vari usi dei suoi fiori, tra cui applicazioni ornamentali, medicinali, industriali e culinarie². Attualmente, l'Inghilterra è il più grande produttore mondiale di C. officinalis³.

I capolini sono l'organo più utilizzato di questa pianta in quanto contengono composti bioattivi come flavonoidi, carotenoidi, terpenoidi, oli essenziali, tannini, cumarine, carboidrati e acidi grassi 3,4,5,6. Questi composti naturali contribuiscono alle sue proprietà farmacologiche, tra cui effetti antinfiammatori, antiossidanti, antimicrobici e cicatrizzanti⁷. Storicamente, C. officinalis, comunemente noto come calendula, è stato utilizzato nei sistemi di medicina tradizionale come l'Ayurveda e l'omeopatia per alleviare una vasta gamma di disturbi, dalle ferite cutanee e dai disturbi gastrointestinali alle irregolarità mestruali^{e alle condizioni} infiammatorie. Le applicazioni moderne si estendono all'industria farmaceutica, alimentare e cosmetica, dove gli estratti di calendula sono incorporati in creme, sieri, tinture e sistemi di somministrazione di farmaci⁹. Nonostante l'ampia ricerca, permangono sfide per sfruttare appieno il potenziale terapeutico di C. officinalis. La variabilità della concentrazione di composti bioattivi dovuta a fattori ambientali e di coltivazione evidenzia la necessità di processi di estrazione e formulazione standardizzati. L'attività biologica dei flavonoidi e la loro identificazione nei tessuti vegetali sono aspetti essenziali del controllo di qualità^10,11.

In Messico, la coltivazione della calendula avviene spesso senza una comprensione dettagliata dei suoi processi di crescita e dello sviluppo floreale, limitando così le sue prestazioni fisiologiche, la resa e la correlazione tra composti bioattivi e fattori agronomici. La concentrazione e la distribuzione dei flavonoidi nei tessuti vegetali sono influenzate dalle condizioni di crescita e di coltivazione, sottolineando l'importanza di studiare i processi fisiologici e di sviluppo di questa specie.

Questo studio ha avuto lo scopo di analizzare la distribuzione della biomassa e le relazioni tra pozzi e fonti negli organi vegetativi e riproduttivi di C. officinalis, per identificare i principali eventi di sviluppo floreale e per quantificare la concentrazione totale di flavonoidi nei capolini mediante un metodo microspettrofotometrico qui proposto. I risultati mirano a ottimizzare le pratiche agricole e migliorare la qualità dei prodotti derivati da questa pianta.

Protocollo

1. Materiali e metodi generali

1. Esperimento sul campo per rilevare l'iniziazione floreale
   1. Configurare l'esperimento in condizioni di campo. Trapiantare piantine di calendula su una superficie di 153 m² con una densità di impianto di piante per metro quadrato, distanziate di 60 cm l'una dall'altra.
   2. Stabilire il sistema di irrigazione a goccia localizzato con calibro 16/8000 NOTA: Il lotto di semi utilizzato in questo esperimento è stato raccolto da un singolo genotipo, quindi selezionato con il metodo di selezione di massa in tre cicli di coltivazione precedenti. Per un clima temperato, il periodo di semina è migliore nella stagione primaverile, seguita dal trapianto circa 2 mesi dopo, quando le piantine sono pronte. L'irrigazione è consigliata una volta alla settimana. Parassiti e malattie dovrebbero essere evitati e la gestione agronomica dovrebbe essere effettuata in base alle esigenze della coltura.
2. Raccogli campioni da piante selezionate a giorni alterni, a partire da 14 giorni dopo il trapianto. Cercare il meristema apicale al microscopio stereoscopico (circa 40X) per determinare la data di comparsa del primordio dell'infiorescenza.
   NOTA: Quando il meristema floreale (FM) appare in almeno la metà dei campioni, questa data può essere registrata come l'età corretta per FM. L'unità sperimentale per osservare l'iniziazione floreale era composta da cinque meristemi in una singola pianta, con otto repliche (piante). Analisi della crescita e dello sviluppo floreale
   1. Raccogli il capolino apicale quando il bocciolo floreale si apre.
      NOTA: Assicurati che i fiori ligulati siano visibili.
   2. Effettuare raccolte di organi floreali durante le ultime sette fasi floreali¹² (Figura 1).
      NOTA: In questo esperimento, sono stati utilizzati cinque capitulum di otto piante diverse in ogni fase fenologica. In tutti i casi, i fiori sono stati raccolti dalla parte apicale della pianta.
   3. Campiona piante intere in sei volte attraverso il ciclo biologico.
   4. Asciugare i campioni raccolti per 48 ore. Misurare il peso secco degli organi vegetativi e riproduttivi.
      NOTA: Si consiglia l'essiccazione a 40 °C in un forno a circolazione d'aria.
   5. Calcolare la forza di assorbimento (SS) e l'attività di assorbimento (SA) sia per gli organi vegetativi che per quelli riproduttivi¹³.
      NOTA: per SS e SA, utilizzare le formule equivalenti rispettivamente al tasso di crescita assoluto (AGR) e al tasso di crescita relativo (RGR).
   6. Traccia le curve di crescita utilizzando un foglio di calcolo.

2. Quantificazione dei flavonoidi totali¹⁴

1. Essiccare il materiale vegetale in una stufa ad aria forzata a 40 °C per 48 ore.
2. Conservare il materiale essiccato in sacchetti di carta. Tenerli al buio a temperatura ambiente (RT).
3. Congelare il materiale vegetale utilizzando azoto liquido per prepararlo alla macinazione.
4. Macinare il materiale congelato in un mortaio di porcellana fino a raggiungere una consistenza uniforme.
   NOTA: Prestare attenzione quando si maneggia l'azoto liquido, poiché potrebbe schizzare a contatto con il materiale vegetale.
5. Preparazione del campione: pesare 25 mg di sostanza secca polverizzata da ciascun campione. Aggiungere 500 μl di metanolo all'80%.
6. Estrazione dei flavonoidi: Incubare la miscela in un'ecografia a 70 °C per un'ora. Quindi centrifugare a 731 g per 13 min¹⁵.
7. Preparare le aliquote: Prelevare 150 μL dell'estratto ottenuto e aggiungere 37 μL di metanolo all'80%.
8. Mescolare 50 μl di estratto, 100 μl di cloruro di alluminio al 10% e 100 μl di acetato di potassio 1 M. Aggiungere acqua distillata per portare il volume totale a 5 ml.
9. Lasciare riposare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente.
10. . Uno spettrofotometro è stato utilizzato per misurare l'assorbanza a 415 nm.
11. Generare la curva di calibrazione: Preparare una soluzione madre sciogliendo 2,7 mg di quercetina in 10 mL di metanolo all'80%. Da questo stock, preparare una serie di 5 soluzioni di quercetina che vanno da 50, 100, 175, 250 e 350 μL. e diluire a 10 mL.
12. Preparare i campioni di calibrazione: per ogni soluzione di quercetina (500 μL), aggiungere 100 μL di cloruro di alluminio al 10% e 100 μL di acetato di potassio 1M, 1,5 mL di metanolo all'80% e 2,8 mL di acqua distillata.
13. Lasciare riposare la soluzione per 40 minuti a temperatura ambiente.
14. Misurare l'assorbanza dei campioni di calibrazione a 415 nm con lo spettrofotometro. Registrare i valori di assorbanza per costruire la curva di calibrazione.
    NOTA: Confrontare la concentrazione totale di flavonoidi nei fiori di raggio, nei fiori tubolari e nei capolini interi. Questo esperimento ha utilizzato un disegno sperimentale completamente randomizzato con cinque ripetizioni per trattamento. La variabile di risposta era la concentrazione di flavonoidi; i mezzi di trattamento sono stati confrontati con il test di Tukey (SAS Institute, 2003).

Risultati

La crescita di C. officinalis ha mostrato una cinetica di accumulo di biomassa sigmoidea in tutta la pianta e nei suoi organi. Questa osservazione si allinea con i rapporti di altri autori, che mostrano costantemente una curva di crescita sigmoidea. Tra gli organi aerei, gli steli hanno accumulato la maggior parte della biomassa (Figura 3). La crescita iniziale in tutti gli organi aerei è stata lenta, con la fioritura e lo sviluppo delle gemme a partire dal giorno 41. La pianta ha r...

Discussione

Sono stati identificati due tipi di fiori, ligulato e tubolare (Figura 5). Abbiamo scoperto che i fiori ligulati contengono una concentrazione inferiore di flavonoidi rispetto ai fiori tubolari, con differenze che vanno dall'11% al 53%. Ciò indica che i fiori tubolari accumulano più flavonoidi rispetto ai fiori ligulati, perché i fiori tubolari hanno più biomassa e una maggiore concentrazione di questi composti.

Quando sono stati ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Forno a circolazione d'aria	Precision 17 GCA Corp.	N/A
Attrezzatura Pulizia degli insetti	Alternagro	N/A	Controllo dei parassiti agricoli con oli ed estratti vegetali
Metanolo grado analitico	merck	822283	Reagente
Nitrofoska speciale 12+12+17+2 MgO+8 S	EUROCHEM	7/548/CEE,1999/45/CE	NPK - fertilizzante granulare contiene: nitrato di ammonio, sali di ammonio, fosfati, sali di calcio, potassio, in alcuni casi magnesio e oligoelementi. 1H-Pirazolo, 3,4-dimetil-,fosfato (1:1)
PHC Healthy Start	PHC Mexico	N/A	PHC Healthy Start 12-16-12 è un fertilizzante per migliorare la nutrizione, il colore e il vigore delle piante.
Quercetina	Sigma-Aldrich	204-187-1	Sostanza standard