Articolo metodologico

Saggi di fluorescenza per lo studio dell'interazione del Mycobacterium tuberculosis con il recettore immunitario SLAMF1

DOI:

10.3791/67745

⸱

28 febbraio 2025

 ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas (CIBA), Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (UNNOBA), 2Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (CIT NOBA), UNNOBA- Universidad Nacional de San Antonio de Areco (UNSAdA)- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3CONICET- Universidad de Buenos Aires, Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN), 4Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Química Biológica, Universidad de Buenos Aires

In questo articolo

Sommario

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Questo studio fornisce un protocollo per valutare l'interazione del Mycobacterium tuberculosis con il sensore microbico SLAMF1. I saggi sono stati condotti su macrofagi umani derivati da monociti utilizzando la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza. Gli strumenti descritti sono rilevanti per lo studio delle interazioni tra patogeni e immunorecettori.

Abstract

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La valutazione dell'interazione diretta tra patogeni e recettori immunitari di solito coinvolge tecniche sofisticate o implica l'uso di ceppi transgenici e cellule geneticamente modificate. Qui viene descritto un metodo alternativo per rilevare l'interazione biochimica tra il sensore microbico dei macrofagi SLAMF1 e il Mycobacterium tuberculosis . Sono stati sviluppati due approcci tecnici che impiegano la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza. Sono stati generati estratti di proteine cellulari totali da macrofagi umani, quindi incubati con cellule intere di antigeni di M. tuberculosis (WCMtb) o di M. tuberculosis (Mtb Ags) per una notte a 4 °C e infine reticolati utilizzando il trattamento con formaldeide/glicina/glicole etilenico bis (succinimidil succinato). L'interazione di SLAMF1 con WCMtb mediante citometria a flusso è stata rilevata con un anticorpo anti-SLAMF1 PE-specifico. L'esistenza di interazione mediante microscopia a fluorescenza è stata eseguita attaccando Mtb Ags colorati con rodamina-PE a vetrini rivestiti di poli-D-lisina, che sono stati incubati con l'estratto proteico totale da macrofagi derivati da monociti. Dopo il trattamento di reticolazione, SLAMF1 è stato visualizzato utilizzando anticorpi primari (anti-SLAMF1) e secondari (Alexa Fluor 488). I saggi hanno fornito un potente strumento biochimico per misurare le interazioni patogeno-immunorecettore, superando le difficoltà associate alle linee cellulari transgeniche e agli esperimenti di modulazione dell'espressione genica delle proteine.

Introduzione

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Il Mycobacterium tuberculosis, l'agente patogeno causale della tubercolosi identificato 142 anni fa, rimane una sfida globale, che attualmente infetta almeno un quarto della popolazionemondiale1. Trasmesso attraverso goccioline trasportate dall'aria da persone infette, M. tuberculosis raggiunge i macrofagi alveolari nei polmoni dove può sopravvivere per lunghi periodi in uno stato latente 2,3. Non solo viene attivata la risposta macrofagica locale, ma negli ultimi anni è stato descritto che i monociti periferici possono essere reclutati nel tratto respiratorio e differenziarsi in macrofagi alveolari, generando una risposta ancora più robusta contro M. tuberculosis rispetto alla loro controparte di origine fetale 2,4.

I macrofagi sono attori fondamentali dell'immunità innata. Dopo l'ingestione di M. tuberculosis, i macrofagi mostrano numerose funzioni microbicide, come la secrezione di citochine proinfiammatorie, la fusione del fagolisosoma e l'attivazione di altre cellule immunitarie per uccidere M. tuberculosis 2,3. Tuttavia, la complessa struttura architettonica di questo patogeno fornisce effettori (ad esempio, proteine e lipidi) in grado di regolare il metabolismo e le funzioni dei macrofagi e, di conseguenza, il processo infiammatorio3. Questa manipolazione delle risposte dei macrofagi, attraverso la secrezione di fattori di virulenza o lo sfruttamento di fattori dell'ospite, porta a diverse strategie di fuga esercitate da M. tuberculosis. Alcuni meccanismi chiave di evasione includono l'induzione di citochine antinfiammatorie, l'inibizione della maturazione e dell'acidificazione dei fagolisosomi, le alterazioni dello stress ossidativo, l'interruzione dell'autofagia e le carenze durante l'elaborazione e la presentazione dell'antigene 3,5.

Un'interazione strettamente regolata tra macrofagi e M. tuberculosis è fondamentale per lo sviluppo di una corretta risposta immunitaria. Pertanto, lo studio di queste sinapsi è fondamentale per identificare i meccanismi immunoprotettivi o immunopatogeni indotti dal crosstalk ospite-patogeno, nonché per identificare potenziali bersagli terapeutici. Molti recettori mediano il riconoscimento e/o l'internalizzazione di M. tuberculosis, inclusi i TLR 6,7,8, NLRs 7,8, i recettori del complemento 6,8, i recettori della lectina di tipo C 6,8 e i recettori scavenger 6,8. L'accumulo di dati indica che sia i PRR superficiali che quelli intracellulari svolgono un ruolo importante durante l'infezione, riconoscendo la M. tuberculosis opsonizzata e non opsonizzata.

Zihad e Sifat et al. hanno recentemente esaminato la partecipazione dei PRR nelle risposte indotte da M. tuberculosis da parte delle cellule innate9. In particolare, la maggior parte dei membri della famiglia dei TLR sono stati implicati nell'interazione con i ligandi di M. tuberculosis 6,7. Il TLR2 di superficie riconosce antigeni micobatterici come le lipoproteine acilate, le lipoproteine 19-kDa, le lipoproteine LprA, le lipoproteine LprG, l'antigene 30-kDa, l'antigene 38-kDa, MymA, l'acido prolina-prolina-glutammico (PPE)-57, LAM, LM, PIM, proteina da shock termico 60, proteina firma Rv1509 e la proteina secreta ESAT-67. La membrana TLR4 interagisce con le proteine da shock termico, l'antigene 38-kDa, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE e HBHA. D'altra parte, i ligandi per i TLR endosomiali (TLR 3, 7, 8 e 9) includono dsRNA, tRNA, ssRNA, RNA fagosomiale e dsDNA di M. tuberculosis. Inoltre, TLR2 ha un ruolo attivo nell'avvio delle risposte immunitarie quando agisce in combinazione con TLR1 e TLR6, TLR4 e TLR9 6,7. NOD2 e NLRP3 sono gli NLR citoplasmatici più ben caratterizzati nella tubercolosi. Sebbene i loro ligandi specifici rimangano in fase di studio, questi recettori sono attivati dal dipeptide muramilico o dall'ESAT-6, rispettivamente 7,8. I recettori della lectina di tipo C sono classicamente coinvolti nell'endocitosi di M. tuberculosis. Mentre la dectina-2 agisce come PRR diretto per ManLAM della parete cellulare di M. tuberculosis, il ligando della dectina-1 non è stato ancora scoperto8. Mincle e MCL riconoscono entrambi il glicolipide trealosio-6,6'-dimicolato (TDM), chiamato anche fattore di corda7. Il DCAR interagisce con i glicolipidi micobatterici fosfatidil-mio-inositolo mannosidi (PIM)7. CR3 riconosce i micobatteri LAM e PIM, DC-SIGN liga ManLAM, MR riconosce una serie di componenti di M. tuberculosis, tra cui ManLAM, PIM, LM, glicoproteina 38-kDa, antigene 19-kDa e altre proteine mannosilate mentre il ligando DCIR non è ancora identificato.

I CLR solubili includono SP-A, che riconosce ManLam, LM, glicoproteina 60-kDa e glicoproteina Apa; SP-D che interagisce con LAM, LM e PILAM; e MBL, specializzato nel riconoscimento ManLAM 6,7. I recettori scavenger sono anche PRR fagocitici. SR-A e MARCO hanno TDM come ligando, SR-B1 riconosce ESAT-6 e CD36 si lega a ManLAM e LM 7,8. Inoltre, Dectina-1, Mincle e MARCO possono anche combinarsi con TLR2 o TLR4 per attivare segnali dopo aver rilevato PAMP 6,7 di M. tuberculosis. Il CD14 è un recettore di superficie che ha la capacità di internalizzare i batteri non opsonizzati e riconosce anche la proteina da shock termico Chaperonin 60.1. In particolare, CD14 funziona come co-recettore insieme a MARCO e TLR26. AIM2 è un recettore citosolico in grado di rilevare l'ssDNA quando M. tuberculosis fuoriesce dal fagosoma8. Infine, AhR è un fattore di trascrizione attivato da un ligando che lega il fattore di virulenza pigmentato naphthochinone phthiocol di M. tuberculosis6.

Molte delle interazioni sopra descritte sono state postulate e non strettamente dimostrate. Anche i ligandi per alcuni recettori rimangono sconosciuti, il che rafforza la necessità di comprendere meglio il campo dell'immunoriconoscimento di M. tuberculosis. In questo contesto, la molecola costimolatoria SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) è stata recentemente descritta come recettore di M. tuberculosis da Barbero et al.10. Agendo non solo come molecola di segnalazione ma anche come sensore di M. tuberculosis, SLAMF1 ha un ruolo particolarmente intrigante nella tubercolosi. SLAMF1 può indurre l'attivazione delle cellule immunitarie modulando funzioni protettive come la produzione di IFN-γ da parte delle cellule T attraverso la fosforilazione di Erk/CREB 11,12,13, l'autofagia nei neutrofili 14 e la clearance batterica nei macrofagi15.

Le interazioni recettori-ligando sono state studiate nel corso degli anni utilizzando tecniche quali ELISA, Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR), Calorimetria di Titolazione Isotermica (ITC), Polarizzazione a Fluorescenza (FP), Cristallografia a raggi X, Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), Termoforesi su Microscala (MST), Trasferimento di Energia di Risonanza (ad esempio, BRET o FRET) Microscopia Confocale, Microscopia Elettronica, Microscopia Crio-Elettronica (Cryo-EM) e Microscopia a Forza Atomica (AFM)16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Alcuni di questi approcci implicano l'uso di geni reporter, proteine ricombinanti marcate o molecole chimeriche, modelli di knockout, knockdown o sovraespressione. In alternativa, gli strumenti computazionali possono prevedere le interazioni recettore-ligando e i siti di legame e sono spesso utilizzati in combinazione con approcci biologici per ottenere una comprensione completa delle interazioni 29,30,31. Qui vengono descritte due alternative per rilevare l'interazione biochimica e anche una sezione su come etichettare i batteri in modo fluorescente. Viene presentato un protocollo che consente lo studio delle interazioni recettore-patogeno in vitro, valutando in particolare l'innesco della SLAMF1-M. tuberculosis attraverso la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza, due tecniche solitamente disponibili e utilizzate di routine.

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono macrofagi derivati da monociti umani sono state eseguite in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013) e in accordo con il Comitato Etico dell'UNNOBA (COENOBA). Il consenso informato scritto è stato ottenuto prima della raccolta del campione. La distribuzione del gruppo maschi/femmine era di 13/6 anni e l'età mediana era di 32 anni, con un intervallo interquartile (IQR) di 18-75 anni. La presenza di patologie pregresse, comorbilità o una diagnosi positiva per la tubercolosi sono stati definiti come criteri di esclusione. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura e stimolazione di macrofagi derivati da monociti

  1. Prelievo di sangue
    1. Ottenere 60 ml di sangue da donatori sani mediante venipuntura in una siringa eparinizzata.
      NOTA: L'estrazione del sangue deve essere eseguita da un biochimico o da un tecnico di flebotomia.
    2. Gettare l'ago nel contenitore per lo smaltimento di oggetti taglienti e qualsiasi materiale che è stato a contatto con il sangue dei donatori nel contenitore dei rifiuti patologici.
  2. Isolamento dei monociti e generazione di macrofagi
    1. Trasferire con cura il sangue in provette da 50 ml e diluirlo a metà con una soluzione salina.
    2. Eseguire la centrifugazione su un mezzo a gradiente di densità per ottenere cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC).
    3. Raccogli i PBMC dall'alone biancastro.
    4. Eseguire due lavaggi con soluzione salina a 400 x g per 10 min e un lavaggio finale a 200 x g per 15 min a 20 °C per eliminare le piastrine.
    5. Determinare il numero di PBMC in una camera di conteggio cellulare ed eseguire la selezione magnetica positiva CD14 con microsfere CD14.
      NOTA: Durante la selezione magnetica, seguire attentamente le istruzioni del produttore. Inoltre, è possibile verificare la purezza dei monociti isolati utilizzando la citometria a flusso.
    6. Risospendere le cellule isolate in RPMI 1640 e determinare il numero di monociti in una camera di conteggio delle cellule.
    7. Seminare 500 μL di monociti selezionati CD14 positivi da 1 ×10 6/mL per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti in assenza di siero per promuovere l'aderenza.
    8. Dopo 2 ore, rimuovere le cellule non aderenti lavandole con RPMI 1640 preriscaldato.
    9. Per differenziare i macrofagi, coltivare i monociti aderenti per ulteriori 16-18 ore (durante la notte) in 1 mL di terreno completo (terreno RPMI 1640 integrato con L-glutammina, 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina).
    10. Il giorno successivo, cambia il mezzo di coltura. Rimuovere il terreno, lavare con 1 ml di 1x PBS e aggiungere 1 ml di terreno completo.
    11. Stimolare i macrofagi con M. tuberculosis sonicato (antigeni di M. tuberculosis (Ags)) per 24 ore. Utilizzare 10 μl di M. tuberculosis Ags (10 μl = 1 × 106 batteri) per 1 × 106 macrofagi derivati da monociti.
      NOTA: 10 μL di M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 batteri, quantificati con O.D. 600nm in spettrofotometro considerando un O.D. di 1 come 1 x 108 batteri/mL. Utilizzare le cappe di biosicurezza BSL2 e un incubatore a 37 °C in un'atmosfera con il 5% di CO2 per tutte le fasi di coltura.
  3. Corroborazione dell'espressione di SLAMF1
    1. Raccogli i macrofagi da un singolo pozzetto. Posizionare la piastra di coltura su una superficie fredda. Staccare le cellule con movimenti su e giù aggiungendo 1 mL di FACS freddo (1x PBS + 2% FBS) due volte consecutivamente. Utilizzare una provetta per citometria a fondo tondo per la raccolta.
    2. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante scaricandolo.
    3. Colorare le cellule con un anticorpo SLAMF1 umano accoppiato a fluorofori per 30 minuti a 4 °C al buio. Vortice dopo l'aggiunta di 1,25 μl di anticorpo.
    4. Lavare le cellule per eliminare l'eccesso di anticorpi utilizzando il FACS, risospendere il pellet nel FACS e acquisire il campione utilizzando un citometro a flusso.
      NOTA: 1,25 μL di anticorpo anti-SLAMF1 corrisponde a 0,0625 μg utilizzato per marcare 0,5 x 106 macrofagi. Tuttavia, si raccomanda vivamente la titolazione dell'anticorpo, oltre all'esecuzione del corrispondente controllo dell'isotipo o della fluorescenza meno uno (FMO).

2. Preparazione dell'estratto proteico cellulare totale

  1. Preparazione del tampone di lisi
    1. Preparare il tampone del test di immunoprecipitazione radio (RIPA) con NaCl 150 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, SDS 1%, Triton X-100 1% e desossicolato di sodio 1%.
    2. Integrare il tampone RIPA con 1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e inibitori della proteasi come la pepstatina A e la leupeptina.
  2. Raccolta cellulare e isolamento di proteine
    1. Eliminare l'RPMI completo dai pozzetti della piastra utilizzando una pipetta P1000 e prelevare i macrofagi mediante pipettaggio su e giù con 1x PBS freddo.
    2. Trasferire le cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 mL. Raccogliere un pozzetto per microprovetta.
    3. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
    4. Aggiungere 1 mL di PBS freddo e ripetere i passaggi 2.2.2 e 2.2.3 raccogliendo le cellule nella stessa provetta da microcentrifuga.
    5. Risospendere i pellet di cella in 100 μl di 1x PBS e raggruppare quattro provette. Ripetere il passaggio 2.2.3. Ogni provetta conterrà 2 x 106 macrofagi.
    6. Aggiungere 100 μl di tampone RIPA integrato e incubare la sospensione su ghiaccio per 1 ora, agitando ogni 10 minuti.
    7. Centrifugare a 14.000 x g per 15 min. Raccogliere il surnatante e conservare fino al momento dell'utilizzo a -20 °C.

3. Interazione M. tuberculosis -SLAMF1 mediante citometria a flusso

  1. Reticolazione proteine-batteri
    1. Incubare 1 ×10 6 cellule intere inattivate di M. tuberculosis (WCMtb, M. tuberculosis inattivate mediante irradiazione gamma) con estratto proteico da 1 x 106 macrofagi (50 μL) per una notte a 4 °C in un supporto per microprovette rotante.
      NOTA: 10 μL di WCMtb = 1 × 106 batteri, quantificati con O.D. 600nm in spettrofotometro considerando un O.D. di 1 come 1 x 108 batteri/mL.
    2. Il giorno seguente, aggiungere 500 μl di formaldeide all'1% diluita in 1x PBS. Incubare per 15 minuti sotto agitazione (agitatore) a temperatura ambiente (RT).
    3. Aggiungere 25 μl di glicina 0,125 M diluita in acqua. Incubare per 5 minuti sotto agitazione (agitatore) a RT.
    4. Lavare due volte con 1 mL di 1x PBS a 14.000 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante tra le fasi di lavaggio.
    5. Risospendere il pellet e incubare la sospensione in 500 μL di 2 mM di reticolante glicole etilenico bis (succinimidil succinato) (EGS) diluito in una miscela 1:1 di acido acetico glaciale:acqua per 1 ora a RT.
      NOTA: Si consiglia vivamente la preparazione dei reagenti al momento dell'uso. Per preparare l'EGS, l'acido acetico glaciale e l'acqua devono essere mescolati in proporzioni uguali e riscaldati a 70 °C. Se la soluzione non è calda, l'EGS non viene completamente risospeso.
  2. Colorazione SLAMF1
    1. Ripetere il passaggio 3.1.4 utilizzando 500 μL di 1x PBS nel primo lavaggio e 1 mL nel secondo.
    2. Colorare il complesso proteina-batteri per 30 minuti a 4 °C al buio con un anticorpo anti-SLAMF1 umano (come al punto 1.3.3) aggiungendo l'anticorpo al microtubo e facendo vortici. Utilizzare la quantità di anticorpo adatta per 1 x 106 cellule (2,5 μL o 0,125 μg).
    3. Lavare le cellule per eliminare l'eccesso di anticorpi utilizzando il FACS, risospendere il pellet nel FACS e acquisire il campione in un citometro a flusso (come al punto 1.3.4).
      NOTA: Eseguire il controllo dell'isotipo o dell'FMO corrispondente.

4. Marcatura degli antigeni di M. tuberculosis

  1. Risospendere la rodamina B in etanolo ad una concentrazione madre di 5 mg/mL (1000x). Conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
  2. Aggiungere 1 μL di Rodamina B per 100 μL di M. tuberculosis Ags in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Incubare per 45 minuti a RT in agitazione continua (vortice).
  4. Lavare almeno 3 volte a 14.000 x g per 5 minuti a 24 °C utilizzando 1 mL di 1x PBS fino a quando il surnatante non è trasparente. Il pallino (Mtb-R Ags) apparirà rosa chiaro.
  5. Risospendere l'Mtb-R Ags in 100 μL di 1x PBS per ripristinare il volume iniziale.
    NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni sterili. Assicurarsi che la colorazione venga eseguita immediatamente prima di eseguire gli esperimenti.

5. Interazione M. tuberculosis - SLAMF1 mediante microscopia a fluorescenza

  1. Reticolazione batteri-proteine
    1. Introdurre vetrini coprioggetto rotondi da 12 mm in piastre di coltura a 24 pozzetti (1 vetrino coprioggetti per pozzetto) utilizzando una pinzetta chirurgica a muso tondo.
      NOTA: Pulire accuratamente i vetrini coprioggetti con etanolo al 70%. Se lo si desidera, possono essere sterilizzati in autoclave o sotto la luce UV per 30 minuti.
    2. Incubare il vetrino coprioggetti con 400 μL di 10 μg/mL di Poli-D-Lisina per una notte a 4 °C. Copri la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
    3. Il giorno successivo, togliete la piastra dal frigorifero e lavate due volte il vetrino coprioggetti con 1 ml di acqua.
    4. Lascia asciugare il vetrino coprioggetti.
    5. Diluire 20 μl (2 x 106) di Mtb-R Ags in 180 μl di 1x PBS. Gli ultimi 200 μl sono sufficienti per coprire completamente un vetrino coprioggetti.
    6. Incubare il vetrino coprioggetti con Mtb-R Ags per 1 ora a 37 °C in un incubatore cellulare.
    7. Eliminare il liquido rimanente e lavare due volte con 1 ml di 1x PBS.
      NOTA: In questa fase, la corretta adesione di Mtb-R al vetrino coprioggetti può essere verificata con un microscopio a fluorescenza utilizzando i filtri corrispondenti al canale rosso.
    8. Aggiungere 400 μL di tampone bloccante (10% FBS in 1x PBS) per 30 minuti a RT in agitazione (agitatore).
    9. Lavare due volte con 400 μL di tampone bloccante.
    10. Incubare con 100 μL di estratto proteico diluito in 300 μL di 1x PBS per 2 ore a RT in agitazione (shaker).
    11. Aggiungere 400 μl di formaldeide all'1% diluita in 1x PBS. Incubare per 15 minuti sotto agitazione (agitatore) a RT.
    12. Aggiungere 500 μL di glicina 0,125 M diluita in acqua. Incubare per 5 minuti sotto agitazione (agitatore) a RT.
    13. Lavare due volte con 1 mL di 1x PBS.
    14. Aggiungere 400 μL di 2 mM EGS per 1 ora a RT in agitazione (agitatore).
    15. Ripetere il passaggio 5.1.13
      NOTA: Si consiglia vivamente la preparazione dei reagenti al momento dell'uso.
  2. Colorazione SLAMF1
    1. Avvolgere il coperchio della piastra di coltura in una pellicola di paraffina.
    2. Aggiungere una goccia di 60 μl di anticorpo primario anti-SLAMF1 precedentemente titolato (diluizione 1:75) sul coperchio coperto da film di paraffina.
    3. Rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto dalla placca utilizzando una pinzetta chirurgica a punta fine curva e aghi.
      NOTA: Per facilitare la rimozione dei vetrini, l'ago può essere piegato con un angolo di circa 45°.
    4. Capovolgere il vetrino coprioggetti sulla goccia contenente l'anticorpo. Incubare per 30 minuti a RT al buio.
    5. Sollevare il vetrino coprioggetti e lavare due volte con il tampone bloccante.
    6. Capovolgere il vetrino coprioggetti su una nuova goccia contenente l'anticorpo secondario (diluizione 1:200). Incubare per 30 minuti a RT al buio.
    7. Ripetere il passaggio 5.2.5.
    8. Rimuovere il liquido in eccesso e montare il vetrino coprioggetti su una goccia di liquido di montaggio posta su un vetrino.
    9. Osservare al microscopio a fluorescenza utilizzando filtri adeguati.
      NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni sterili. Diluire gli anticorpi nel tampone bloccante. Maneggiare con cura il vetrino coprioggetti per evitare graffi che potrebbero ostacolare l'osservazione al microscopio. Si consiglia vivamente un fluido di montaggio adatto alla fluorescenza.

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Risultati

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In questo lavoro, viene fornito un protocollo che consente la valutazione dell'interazione di M. tuberculosis con il recettore immunitario SLAMF1 nei macrofagi umani (Figura 1). A tal fine, è stato ottenuto sangue periferico da donatori sani. Quindi, le PBMC sono state separate mediante centrifugazione sul mezzo del gradiente di densità e i monociti sono stati isolati mediante selezione magnetica positiva (purezza ≥95%, Figura 2A, B). I...

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Discussione

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Questo studio fornisce un'utile guida per studiare l'interazione biochimica tra M. tuberculosis e i sensori microbici espressi nei macrofagi umani, un tipo di cellula chiave coinvolto nella risposta dell'ospite durante la tubercolosi. I protocolli forniti saranno rilevanti per decifrare le molecole che svolgono un ruolo nell'ingresso di M. tuberculosis nei fagociti.

La caratterizzazione delle interazioni bio-molecolari, come quella tra patoge...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (numeri di sovvenzione SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 a V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, numeri di sovvenzione PICT-2012-2459 e PICT A 2017-1896 a V.P. e PICT-2021-I-INVI-00584 a A.B.); Fondazione Florencio Fiorini; e Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, numero di sovvenzione PIO 15720150100010CO a V.P.). Ringraziamo Natalia Menite e Gastón Villafañe per il supporto tecnico. Ringraziamo la Dott.ssa Paula Barrionuevo e la Dott.ssa Luciana Balboa per la discussione scientifica durante la pubblicazione che ha dato origine allo sviluppo dei saggi presentati in questo lavoro. Ringraziamo infine il Dr. Estermann per i suoi consigli sui protocolli di cross-linking, Lic. Moroni per i suoi consigli su come lavorare con la Poli-Lisina e il Lic. Moriconi per il suo aiuto con le figure schematiche.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo secondario Alexa Fluor 488InvitrogenCodice: A21121Per microscopia a fluorescenza
anticorpo FITC anti-SLAMF1 eBioscience11-1509-42Per citometria a flusso
anticorpo PE anti-SLAMF1 BioLeggenda306308Per citometria a flusso
anticorpo primario anti-SLAMF1 BioLeggenda306302Per microscopia a fluorescenza
Aqua-Poly/MontaturaPoliscienze18606-20Supporti di montaggio
Microsfere CD14Miltenyi Biotec130-097-052Per l'isolamento dei monociti
Vetrini coprioggetti 12mmHDA-Per il test di interazione mediante microscopia
EGSThermoFisher Scientific 21565Per il trattamento di reticolazione
FACSCanto IIBD Bioscienze338960Citometro a flusso con software BD FACSDiva
Siero fetale bovino Natocor-Inattivato e irradiato, per coltura di macrofagi
Ficoll-Paque PLUSCitiva17144003Per la separazione delle PBMC
Figi/ImageJSoftware Open Source-Per analisi micrografiche
FlowJo 7.6.2 Stella dell'albero-Per analisi di citometria a flusso
FormaldeideMerckK47740803613Per il trattamento di reticolazione
VetriniBicchiere Klass-Per il test di interazione mediante microscopia
GlicinaSigmaG8898Per il trattamento di reticolazione
Imager.A2Carl Zeiss430005-9901-000Microscopio a fluorescenza con modulo di illuminazione Colibri 7
iMarkBIO-RAD1681130Lettore di assorbanza per micropiastre 
L-glutamminaSigma Aldrich49419Per la coltura dei macrofagi
M. tuberculosis, ceppo H37Rv, cellule intere irradiate con raggi gamma Risorse BEI, NIAID, NIHNR-14819Per saggi di interazione
M. tuberculosis, ceppo H37Rv, lisato a cellule intereRisorse BEI, NIAID, NIHNR-14822Per la stimolazione dei macrofagi e il saggio di interazione
Neofuge 13RForza di guarigioneNeofuge 13RCentrifuga refrigerata ad alta velocità per l'estrazione di proteine
Penicillina/StreptomicinaGibco15140122Per la coltura dei macrofagi
PMSFThermoFisher Scientifico36978Per l'isolamento delle proteine
Poli-D-lisinaSigma AldrichA-003-MPer il trattamento dei vetrini coprioggetti
Cocktail di inibitori della proteasiSigma Aldrich P8340Per l'isolamento delle proteine
Rodamina B Sigma Aldrich 21955Per la colorazione di M. tuberculosis
RPMI 1640Gibco11875093Per la coltura dei macrofagi
Centrifuga Sorvall ST 16/16RThermoFisher Scientifico75004240Per l'isolamento di PBMC e monociti

Riferimenti

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