Articolo metodologico

Estrazione e pulizia dei tessuti Preparazione di campioni di cervello e midollo spinale di topo

DOI:

10.3791/67749

⸱

11 aprile 2025

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, 2Key Laboratory of Anesthesiology, (Shanghai Jiaotong University), Ministry of Education, 3Department of Anesthesiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un protocollo per l'estrazione e la preparazione di campioni chiari di intero cervello e midollo spinale con segnali fluorescenti conservati, migliorando l'efficienza sperimentale e l'integrità dei dati per far progredire la ricerca neuroscientifica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricerca neuroscientifica incentrata sul sistema nervoso centrale richiede una comprensione approfondita di vari fattori, tra cui la distribuzione cellulare, la connettività neuronale e la dinamica molecolare. Le metodologie tradizionali per studiare l'intero cervello e il midollo spinale spesso comportano l'isolamento, il sezionamento e la scansione di fette di tessuto, seguite dal laborioso processo di ricostruzione tridimensionale dell'immagine. Questo approccio convenzionale può richiedere molto tempo e essere ingombrante. I progressi nella pulizia dei tessuti e nelle tecniche di imaging dell'intero organo hanno rivoluzionato l'analisi dell'intero cervello e del midollo spinale. Per massimizzare il potenziale di questi metodi innovativi, è essenziale estrarre e cancellare campioni di cervello mantenendo la loro connessione con il midollo spinale. Questo protocollo fornisce una guida dettagliata e sistematica per la preparazione di campioni del cervello collegati al midollo spinale, delineando le procedure di estrazione e pulizia. Semplificando questi processi, questo approccio migliora significativamente l'efficienza sperimentale e l'integrità dei dati, favorendo così i progressi nella ricerca neuroscientifica e consentendo indagini più complete sulle complessità del sistema nervoso centrale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mappatura e l'analisi accurate della distribuzione nervosa forniscono preziose informazioni sull'organizzazione strutturale e funzionale del sistema nervoso centrale, aprendo la strada a strategie terapeutiche innovative e migliorando la nostra comprensione generale dei meccanismi neurali. Attualmente, mancano video tutorial completi per guidare i ricercatori nella preparazione e nell'estrazione di campioni cerebrali collegati al midollo spinale e nel raggiungimento di una pulizia dei tessuti di successo.

Sono disponibili diversi approcci di pulizia dei tessuti: idrofobici, idrofili, a base di idrogel e metodi di pulizia dell'espansione dei tessuti 1,2,3. La tecnica di pulizia dei tessuti è ampiamente applicata nello studio di organi come la milza4, i polmoni5, il muscolo gastrocnemio6, il cervello7, il midollo spinale8 e i reni9. Il nostro protocollo fornirà istruzioni dettagliate su come preparare campioni di cervello intero collegati al midollo spinale che sono stati marcati con un marcatore fluorescente utilizzando topi STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J cep. Offrirà una guida passo passo per l'estrazione del campione e descriverà il protocollo di pulizia utilizzando kit idrofili per la pulizia dei tessuti. Questo protocollo aiuta i ricercatori a padroneggiare l'intero processo, dall'estrazione del campione di midollo spinale alla preparazione e alla successiva scansione. Ciò non solo migliorerà l'efficienza sperimentale, ma garantirà anche l'integrità e la qualità dei campioni, fornendo dati più accurati e affidabili a supporto della ricerca neuroscientifica.

Rispetto ai metodi convenzionali di sezionamento, imaging e ricostruzione tridimensionale10,11, l'approccio qui presentato offre diversi vantaggi chiave, come (1) una maggiore integrità strutturale: mantenendo la struttura dell'intero organo, questo metodo riduce il rischio di perdita di informazioni critiche che possono verificarsi con il sezionamento12; (2) acquisizione completa dei dati: l'uso di un kit di pulizia dei tessuti consente una mappatura dettagliata delle cellule che sono difficili da ottenere con le tecniche tradizionali; (3) Efficienza e accuratezza: il protocollo semplifica l'intero processo, dall'estrazione del campione all'imaging, riducendo il tempo richiesto dalle procedure di immunoistochimica o colorazione e minimizzando gli errori associati al sezionamento e al montaggio13.

Il protocollo supera i limiti dei metodi di sezionamento tradizionali, che spesso si traducono in dati incompleti e frammentati. Preservando la connessione cervello-midollo spinale intatta e utilizzando moderni metodi di pulizia dei tessuti, questo protocollo fornisce una visione più olistica del sistema nervoso centrale, che è fondamentale per comprendere i complessi meccanismi e funzioni neurali. L'obiettivo principale di questo metodo è quello di consentire l'imaging completo del sistema nervoso centrale preparando campioni di cervello intero collegati al midollo spinale, che sono stati marcati con marcatori neuronali fluorescenti. Questo protocollo mira a facilitare la visualizzazione dettagliata delle strutture neurali e delle distribuzioni cellulari utilizzando metodi anatomici avanzati e tecniche di pulizia dei tessuti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE (Animal Research Reporting In Vivo Experiments) e la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il presente studio è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale Renji, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Qui, per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi del ceppo MJrs/J STOCK Tg (Thy1-EGFP) di 7-8 settimane (origine C57BL/6J x CBA). Gli animali sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e alloggiati in gabbie standard (22 °C ± 2 °C, 12 h/12 h ciclo luce/buio, cibo e acqua ad libitum).

1. Perfusione

  1. Anestetizzare profondamente i topi adulti utilizzando tribromoetanolo all'1,25% (0,02 ml/kg, vedere la tabella dei materiali) somministrato mediante iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa da 1 ml. Controllare la profondità dell'anestesia in base alla risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
  2. Fissa gli arti del mouse alla tavola acrilica bianca usando i morsetti in acciaio. Tagliare la pelle tra i due femori del topo e continuare a tagliare verso l'alto fino a raggiungere il diaframma. Apri entrambi i lati del torace attraverso il diaframma per esporre il cuore usando forbici e pinze dritte.
  3. Inserire un ago per infusione da 0,7 mm nel ventricolo sinistro. Praticare un'incisione di 1-2 mm nell'appendice atriale destra.
  4. Perfondere con 1x PBS contenente 10 U/mL di eparina sodica a una velocità di 10 mL/min con una pompa peristaltica (vedere la Tabella dei materiali) per eliminare completamente il sangue. Il fegato che diventa completamente pallido indica una clearance riuscita.
  5. Perfondere con 50 mL di PFA al 4% pre-raffreddato con una pompa peristaltica a una velocità di 10 mL/min. Monitora la presenza di segni come l'arricciamento della coda del topo e le contrazioni muscolari.
    NOTA: La perfusione non riuscita può influire sui successivi processi di compensazione.

2. Estrazione del campione

  1. Sezionare con cura l'intero cervello e il midollo spinale utilizzando forbici e pinze per evitare di danneggiare il campione.
  2. Separare la pelle sul dorso e sulla testa del topo usando le forbici oftalmiche. Recidere la colonna vertebrale nel punto in cui la linea che collega i bordi posteriori superiori di entrambi gli arti si interseca con la colonna vertebrale.
  3. Rimuovere il tessuto muscolare e adiposo dal collo e dalla parte posteriore del topo per esporre la colonna vertebrale e il cranio. Taglia lungo lo spazio della linea mediana tra i lati sinistro e destro della colonna vertebrale e del midollo spinale dall'estremità inferiore del canale vertebrale usando le forbici per la venere.
  4. Rimuovere la parte superiore e i lati bilaterali della colonna vertebrale recisa per esporre il midollo spinale. Ripeti i passaggi fino a raggiungere la connessione cerebrale.
  5. Posiziona la punta di una lama delle forbici di Venere tra il forame magno e il cervello. Far scorrere e tagliare lungo la sutura medio-sagittale per aprire il cranio. Usa il forcipe per rimuovere il cranio ed esporre il cervello.
  6. Rimuovere il tessuto cervello-midollo spinale del topo dall'estremità cranica usando una pinza e le forbici per la venere.
    NOTA: I tagli o i danni alla superficie possono essere esacerbati durante la successiva pulizia, causando potenzialmente danni imprevedibili al campione. Maneggiare i campioni con cura.
  7. Utilizzare una pinza da dissezione per rimuovere la membrana del midollo spinale sotto lo stereomicroscopio.
  8. Fissare il campione di midollo encefalico e spinale alla piastra di fissaggio (vedi Tabella dei materiali) utilizzando punti di sutura. Aggiungere almeno 20 volte il volume del campione di PFA al 4% e posizionarlo su un agitatore a 4 °C per un'agitazione lenta. Fissare durante la notte per 16-24 ore.
    NOTA: L'eccessiva fissazione porta a un'eccessiva reticolazione delle proteine, riducendo l'efficienza di eliminazione14. Una fissazione insufficiente o ritardata può causare la degradazione dell'antigene e la distruzione della morfologia dei tessuti.
  9. Scartare il PFA e lavare il campione 3 volte con 1 PBS. Assicurarsi che il volume di PBS sia almeno 10 volte il volume del campione, immergendo completamente il campione. Ogni lavaggio dura 2 ore con agitazione su agitatore ad una velocità non inferiore a 60 giri/min per rimuovere a fondo il PFA residuo.

3. Pulizia dei tessuti

NOTA: In questo caso viene utilizzato un kit per la pulizia dei tessuti (vedere la tabella dei materiali).

  1. Preparare la soluzione per la rimozione dei lipidi mescolando la soluzione A e la soluzione B con un rapporto di massa di 9:1.
    NOTA: Si raccomanda che il volume della soluzione per la rimozione dei lipidi sia superiore a 20 volte il volume del campione.
  2. Posizionare il tessuto fissato in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere 50 mL della soluzione per la rimozione dei lipidi. Porre la provetta da centrifuga in un agitatore a 37 °C, agitando delicatamente a 60 giri/min per la rimozione dei lipidi. Cambiare la soluzione per la rimozione dei lipidi ogni giorno per 3-5 giorni. Per determinare il completamento, posizionare la provetta da centrifuga su una scatola luminosa con una linea di scala. Se la linea della scala nera è chiaramente visibile e non distorta attraverso il campione, il processo è completo.
  3. Immergere il campione in 20 mL di soluzione C su un agitatore a 25 °C, agitando a meno di 60 giri/min per la corrispondenza dell'indice di rifrazione. Cambiare la soluzione C dopo 24 ore. Posizionare il piatto di coltura con il campione completamente immerso nella soluzione C su una scatola luminosa con una linea di scala. Se la linea della scala nera è chiaramente visibile e non distorta attraverso il campione, il processo di corrispondenza è completo.
    NOTA: Per i tessuti di topo adulto, la corrispondenza dell'indice di rifrazione viene in genere completata entro 2 giorni.

4. Inclusione tissutale

  1. Preparare la soluzione in Gel con 147 g di Soluzione C in un flacone di vetro da 200 ml, aggiungere 3,0 g di agarosio, mescolare bene a spirale, quindi microonde fino a ebollizione e spegnere immediatamente il microonde. Trasferire la provetta da centrifuga in un'incubatrice a 37 °C fino a quando l'agarosio non si scioglie.
    NOTA: Si consiglia di preparare la soluzione in gel fresca secondo necessità.
  2. Incorporare il campione chiarificato con uno strato profondo 2 mm di soluzione gel a 37 °C nello stampo e raffreddare in frigorifero a 4 °C per 30 minuti fino a semi-solidificazione. Posizionare il campione con indice di rifrazione corrispondente nello stampo e aggiungere la soluzione di gel in modo che sia livellato o leggermente al di sotto della parte superiore del campione.
  3. Rimettere lo stampo in frigorifero a 4 °C per 2 ore. Aggiungere la soluzione di gel fino a raggiungere il livello della superficie dello stampo. Coprire con un vetrino coprioggetti. Accelerare la solidificazione in frigorifero a 4 °C per 2 ore. Conservare il campione incorporato per una notte in frigorifero a 4 °C. Procedere con l'imaging il prima possibile.

5. Scansione

  1. Rimuovere il vetrino coprioggetti con una pinzetta ed estrarre il campione incorporato. Posizionare il campione in una provetta da 50 ml e aggiungere 30 ml di soluzione di imaging per immergere completamente il campione.
  2. Applicare l'adesivo 502 per fissare saldamente il campione sul supporto del campione. Fissare il supporto al dispositivo di imaging.
  3. Eseguire il software di scansione come descritto. Selezionare il livello di ingrandimento di 4x nella sezione di ingrandimento. Fare clic sul pulsante Calibrazione per attivare la modalità di calibrazione.
  4. Fare clic sul pulsante Anteprima per accedere alla modalità di anteprima. Fare clic sul pulsante di movimento della direzione Z per spostare lentamente il campione verso l'alto dal fondo della camera del campione fino a quando il foglio luminoso generato non passa attraverso il campione.
  5. Selezionare il canale laser appropriato e l'opzione della modalità di illuminazione. Selezionare la direzione del percorso di scansione per il campione. Fare clic sul pulsante Scansione automatica per avviare l'acquisizione del campione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo isola con successo l'intero cervello collegato al midollo spinale in topi maschi STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J cep. Inoltre, rende trasparenti i campioni, assicurando che i segnali fluorescenti siano completamente preservati e acquisiti, fornendo immagini chiare e dettagliate che mantengono l'integrità della fluorescenza originale.

La Figura 1 mostra un midollo encefalico-spinale int...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo sperimentale proposto prevede l'utilizzo di topi il cui cervello è collegato al midollo spinale marcato con virus di tracciamento neurale fluorescenti. Questo protocollo fornisce istruzioni complete e dettagliate sulla preparazione di campioni di cervello intero che rimangono collegati al midollo spinale. Il protocollo delinea meticolosamente ogni fase, assicurando che i ricercatori possano replicare il processo con precisione.

Diversi passaggi c...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (sovvenzione n. 82101249 e n. 82471204 a XY Sun). Fondazione di ricerca post-dottorato della Cina (sovvenzione n. 2022M722125 a XY Sun).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mlShandong Weigao Group Medical Polymer
502 collaDeli Group
BD siringa da insulinaBecton, Dickinson e  Pinza328421 da
dissezione dentata a piegareJinzhongJD1050
Morsetto circolare in acciaioWeili
Forbici finiJinzhongy00030
Pinza emostatica piegata con denteJinzhongJ31020
Pinza emostatica diritta con denteJinzhongJ31010
Ago per infusione 0,7 mmKindly Group
Light box scala lineaNuohai Life ScienceNH210901
Microdissezione pinza dirittaJinzhongWA3020
NobeliumSoftwareNuohai Life ScienceSoftware
paraformaldeide BiosharpBL539A
Pompe peristalticheNuohai Life ScienceNH1000
Testa delle pompe peristalticheNuohai Life ScienceNH-15
Soluzione salina tamponata con fosfatoServicebioG4202
Eparina di sodioShanghai PharmaH31022051
STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J ceppo topiLaboratory007788
Pinze da dissezione a denti drittiJinzhongJD1060
Kit per la pulizia dei tessuti (irofilo)Nuohai Life ScienceNH-CR-210701
Trattamento per colture tissutali 100 mm x 20 mmNEST704001
Forbici per tessutiJinzhongJ21040
Pentobarbital di sodioSigma-AldrichP3761
Forbici per venereJinzhongYBC010
Jackson

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  3. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chem Biol. 23 (1), 137-157 (2016).
  4. Wu, M., et al. Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity. Cell. 187 (12), 2935-2951.e19 (2024).
  5. Liu, T., et al. Local sympathetic innervations modulate the lung innate immune responses. Sci Adv. 6 (20), eaay1497(2020).
  6. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Sci Adv. 5 (1), eaau8355(2019).
  7. Bagnoli, S., Terzibasi Tozzini, E., Cellerino, A. Whole-Brain clearing and immunofluorescence in Nothobranchius furzeri. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 698-704 (2023).
  8. Lu, T., Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. 3D imaging of supraspinal inputs to the thoracic and lumbar spinal cord mapped by retrograde tracing and light-sheet microscopy. J Neurochem. 162 (4), 352-370 (2022).
  9. Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue. J Vis Exp. (149), e60002(2019).
  10. Song, J. H., et al. Precise mapping of single neurons by calibrated 3D reconstruction of brain slices reveals topographic projection in mouse visual cortex. Cell Rep. 31 (8), 107682(2020).
  11. Fournel, R., Veruki, M. L., Hartveit, E. Digital reconstruction and quantitative morphometric analysis of bipolar cells in live rat retinal slices. J Comp Neurol. 530 (10), 1700-1728 (2022).
  12. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  13. Peng, Y. C., et al. Rapid histological assessment of prostate specimens in the three-dimensional space by hydrophilic tissue clearing and confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 70 (8), 597-608 (2022).
  14. Singhal, P., et al. Evaluation of histomorphometric changes in tissue architecture in relation to alteration in fixation protocol - An in vitro study. J Clin Diagn Res. 10 (8), ZC28-ZC32 (2016).
  15. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
  16. Lee, S. H., Son, H. J. Second wave, late-stage neuroinflammation in cleared brains of aged 5xFAD Alzheimer's mice detected by macrolaser light sheet microscopy imaging. Int J Mol Sci. 24 (23), 242317058(2023).
  17. Zhao, J., Lai, H. M., Qi, Y., He, D., Sun, H. Current status of tissue clearing and the path forward in neuroscience. ACS Chem Neurosci. 12 (1), 5-29 (2021).
  18. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869(2024).
  19. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385, eadm6869(2024).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Tissue ClearingBrain Spinal CordMouse Brain ExtractionCentral Nervous SystemWhole Organ ImagingFluorescent ImagingNeural Structure VisualizationParaformaldehyde FixationLipid RemovalLight Sheet Microscopy

Articoli correlati