Articolo metodologico

Un metodo efficiente per l'estrazione degli epiteli umani delle tube di Falloppio per l'analisi di singole cellule

DOI:

10.3791/67753

⸱

28 marzo 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo di un giorno per l'isolamento delle cellule epiteliali delle tube di Falloppio umane. Le cellule epiteliali isolate possono essere piastrate in coltura bidimensionale (2D) o dissociate in sospensioni di singole cellule e utilizzate in esperimenti a valle, tra cui la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Abstract

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Le tube di Falloppio umane sono intrinseche alla riproduzione. Lo scopo delle tube di Falloppio è quello di consentire il transito degli spermatozoi, dell'ovulo e, se la fecondazione ha successo, dell'embrione. Le cellule epiteliali che rivestono la superficie interna delle tube di Falloppio sono parte integrante dei processi normali e anormali delle tube di Falloppio, compreso l'inizio della malattia. Dopo la menopausa, le tube di Falloppio cessano di avere un ruolo significativo nell'organismo e la composizione delle cellule intraepiteliali cambia. Descriviamo un metodo in cui queste cellule epiteliali possono essere isolate da tube di Falloppio fresche con una contaminazione minima delle cellule stromali in una sospensione di una singola cellula. Queste cellule possono essere coltivate in coltura o utilizzate per ulteriori analisi, come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Questo protocollo di isolamento può essere raggiunto in 4-6 ore e produce cellule vitali che possono essere utilizzate per l'analisi immediata a valle. Questo efficiente protocollo facilita l'isolamento delle cellule epiteliali delle tube di Falloppio con una popolazione epiteliale arricchita.

Introduzione

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Le tube di Falloppio sono costituite da più parti. Dall'ovaio all'utero, la tuba di Falloppio è composta dalle fimbrie, dall'ampolla, dall'istmo e dalla porzione intramurale. Le fimbrie si estendono dall'estremità delle tube di Falloppio dove afferrano l'ovulo rilasciato dall'ovaio. L'ovulo viaggia quindi attraverso l'ampolla, dove è più probabile che venga fecondato, fino all'istmo e infine viene trasferito nell'utero attraverso la porzione intramurale1. La mucosa più interna delle tube di Falloppio che facilita il trasporto degli ovuli è costituita da uno strato di epitelio luminale, comprendente cellule ciliate e secretorie. Le cellule ciliate tendono ad essere più concentrate in corrispondenza delle fimbrie2. Svolgono un ruolo fondamentale nello spostamento fisico dell'ovulo attraverso le tube di Falloppio dall'ovaio all'utero. Le loro appendici consentono alle cellule ciliate non solo di muovere l'ovulo, ma anche di eliminare lo stress genotossico dopo l'ovulazione3.

Le cellule epiteliali secretorie delle tube di Falloppio secernono un fluido che aiuta la nutrizione e l'assemblaggio dei gameti4. La proporzione di cellule ciliate e secretorie lungo l'epitelio delle tube di Falloppio differisce nello stato post-menopausale con una diminuzione delle cellule ciliate poiché le tube di Falloppio non svolgono più una funzione critica nel trasporto5. Inoltre, in assenza di estrogeni, si pensa che le tube di Falloppio diventino vestigiali 1,6. Si ritiene che questa perdita di cellule ciliate nelle tube di Falloppio aumenti il rischio di sviluppare carcinomi sierosi7. Inoltre, si ritiene che le cellule epiteliali secretorie delle tube di Falloppio diano origine a lesioni da carcinoma intraepiteliale tubarico sieroso (STIC), un noto precursore del sottotipo più aggressivo di carcinoma tuboovarico, il carcinoma sieroso di alto grado 7,8.

Lo scopo di questo protocollo è quello di isolare le cellule epiteliali dalle tube di Falloppio umane e dissociarle in sospensioni unicellulari. Questo protocollo produce una popolazione epiteliale unicellulare arricchita che può essere utilizzata per molte analisi. Come mostrato in questo manoscritto, abbiamo eseguito l'analisi della citometria a flusso e piastrato le cellule in 2D dopo l'isolamento. L'analisi della citometria a flusso dimostra la presenza di singole cellule, che sono per lo più vitali e di natura epiteliale. In queste analisi, abbiamo incluso quattro marcatori, e506 per la vitalità, EpCAM per le cellule epiteliali, CD45 per le cellule immunitarie e CD10 per le cellule stromali. Le cellule morte sono state escluse utilizzando il marcatore di vitalità e506 e le cellule immunitarie sono state espulse utilizzando CD45. È possibile che la sospensione abbia una popolazione di cellule immunitarie; tuttavia, per ottenere una popolazione relativamente pura di cellule epiteliali, le cellule CD45-positive possono essere esaurite utilizzando un kit di deplezione CD45. Inoltre, quando vengono piastrate in coltura, le cellule CD45-positive spesso non proliferano. Le cellule isolate con questo metodo e coltivate in 2D mostrano popolazioni epiteliali aderenti simili a ciottoli. Questo metodo può essere utilizzato per generare preparati cellulari, che possono essere sviluppati in librerie di RNA a singola cellula.

La ricerca per definire il lignaggio cellulare degli epiteli delle tube di Falloppio, le alterazioni di questi lignaggi durante le diverse fasi della vita riproduttiva e gli eventi scatenanti che portano alla trasformazione e alla genesi maligna è diventata più importante negli ultimi quattro anni 6,9,10,11,12 . Questo protocollo apporterà un notevole beneficio alla ricerca in questo campo, fornendo un modo efficiente per isolare gli epiteli delle tube di Falloppio e trasformarli in singole cellule.

Protocollo

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Questo protocollo è stato adattato da un metodo di isolamento delle cellule epiteliali uterine descritto in precedenza13,14. Campioni freschi di tube di Falloppio deidentificate sono stati raccolti attraverso il nostro protocollo #10-0727 approvato dall'IRB dell'Università della California, Los Angeles (UCLA) e digeriti in una sospensione a cellula singola entro circa 4-6 ore.

1. Raccolta e preparazione delle tube di Falloppio

  1. Raccogliere le tube di Falloppio umane fresche (Figura 1A) in terreni di dissociazione (DMEM [4,5 g/L di D-glucosio] contenenti il 10% di siero fetale bovino (FBS), 5 ml di L-glutammina e 5 ml di penicillina/streptomicina) in provette da 15 ml o 50 ml e trasportarle in laboratorio con ghiaccio.
  2. Trasferire le tube di Falloppio in una capsula di Petri sterile contenente terreni di dissociazione freschi.
  3. Al microscopio da dissezione, sezionare il grasso, il tessuto connettivo e tutti i vasi che circondano le provette utilizzando una pinza a punta fine e le forbici Vannas Tubingen (Figura 1B).
  4. Al microscopio da dissezione, tagliare il piano coronale delle tube di Falloppio con le forbici per formare piccoli cilindri, ~3-5 mm ciascuno di diametro (Figura 1C), utilizzando le pinze a punta fine per stabilizzare il tessuto.

2. Isolamento e dissociazione delle cellule epiteliali

  1. Aspirare con cura il mezzo di dissociazione dal piatto.
  2. Lavare i pezzi di tessuto 2 volte con soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) pipettando delicatamente ~2 ml per coprire i pezzi e ruotando leggermente la piastra.
  3. Aspirare l'ultimo lavaggio con 1 PBS, incubare i pezzi di tessuto per 5 minuti in acido etilendiamminotetraacetico freddo da 5 mM (EDTA) a temperatura ambiente e ripetere per un totale di due incubazioni. Aspirare l'EDTA 5mM dopo ogni incubazione.
  4. Sospendere i frammenti di tessuto in una soluzione fredda di tripsina/sale bilanciato di Hanks (HBSS) all'1% e incubare a 4 °C per 40 minuti (Figura 1D).
  5. Aspirare l'1% di tripsina/HBSS e lavare i pezzi di tessuto 2 volte in un mezzo di dissociazione freddo per inattivare la tripsina.
  6. Incubare i frammenti di tessuto in 2 mL di terreno di dissociazione con 0,4 mg di DNasi per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Potrebbe essere necessario un periodo di incubazione più lungo, ma non superare i 45 minuti prima di iniziare il passaggio 2.7.
  7. Sotto un microscopio da dissezione, mentre si è ancora nel terreno con DNasi, tenere in posizione un frammento della tuba di Falloppio, il lume parallelo al fondo del piatto, con una pinza. Con l'altra mano, premere ripetutamente sul pezzo delle tube di Falloppio con una pinza per espellere le cellule epiteliali dal lume della tuba. Confermare che un alone di cellule sia visibile intorno al tessuto quando le cellule vengono rilasciate dal lume del tubo. Ripetere l'operazione per ogni frammento di tuba di Falloppio nel piatto (Figura 1E).
  8. Trasferire il terreno contenente le cellule in una provetta sterile da 15 mL, lavare la piastra di Petri con il terreno di dissociazione almeno 2 volte e unire i lavaggi nella provetta da 15 mL. Eliminare i frammenti del tubo stromale.
  9. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 × g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di dissociazione.
  10. Contare le cellule alicitando 10 μl della sospensione cellulare e mescolando 1:1 con il blu di tripano. Pipettare 10 μl di miscela in un vetrino di conteggio della camera e inserirlo in un contatore di cellule (Figura 1F).

3. Digestione in sospensione unicellulare

  1. Risospendere le cellule in 9 mL di terreno di dissociazione, 1 mL di 8 mg/mL di collagenasi (tipo 1) e 0,4 mg di DNasi. Incubare a 37 °C per 30-45 minuti in un agitatore orbitale a 200 giri/min (Figura 1G).
  2. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 × g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di dissociazione per lavare via la collagenasi.
  3. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 μm in una provetta da 50 mL (Figura 1H).
  4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 × g per 5 min.
  5. Se il pellet cellulare appare rosso, eseguire la lisi dei globuli rossi (RBC) come descritto nei passaggi 3.6-3.8. Se il pellet della cella non è rosso, andare al passaggio 3.9.
  6. Diluire 500 μL di tampone di lisi dei globuli rossi in 4,5 mL di acqua ultrapura.
  7. Aspirare il terreno, aggiungere 5 mL del tampone di lisi dei globuli rossi diluito e incubare su ghiaccio per 3 minuti.
  8. Per interrompere la lisi dei globuli rossi, aggiungere 45 mL di 1x PBS alla provetta da 50 mL.
  9. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 × g per 5 min.
  10. Contare le cellule alicitando 10 μL della sospensione cellulare e mescolandola 1:1 con il blu di tripano. Pipettare 10 μl di miscela in un vetrino di conteggio della camera e inserirlo nel contatore di cellule (Figura 1I).

4. Colorazione con citometria a flusso

  1. Aliquotare 250.000 cellule in due provette separate a fondo tondo di polistirene da 5 mL per il controllo primario degli anticorpi coniugati e degli isotipi da utilizzare per la citometria a flusso con marcatore di superficie.
    NOTA: È possibile utilizzare un numero inferiore di celle per il conteggio e il numero di cellule necessarie per l'analisi a valle. Per ottenere risultati di flusso ottimali, è necessario includere nell'analisi un minimo di 50.000 cellule.
  2. Diluire l'anticorpo (ad es. EpCAM e CD10 anti-umani) e l'isotipo secondo la diluizione raccomandata dal produttore in 1x PBS. Includono un colorante di vitalità fissabile (e506) e un anticorpo CD45 coniugato anti-umano per eliminare le cellule immunitarie umane vive. Preparare una miscela di anticorpi sufficiente per almeno 50 μl per provetta. Lasciare al buio sul ghiaccio fino al passaggio 4.4.
  3. Lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 500 × g per 5 minuti a 4 °C.
  4. Aspirare il 1x PBS. Risospendere il pellet nel pannello anticorpale o isotipo e incubare a 4 °C per 15 minuti al buio.
  5. Dopo l'incubazione, diluire in 1 mL di 1x PBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 × g per 5 minuti a 4 °C.
  6. Aspirare il 1x PBS e risospendere il pellet di cella in 200 μL di 1x PBS.

5. Raccolta dati di citometria a flusso

  1. Accedere alla macchina FACS.
    NOTA: Presentiamo il protocollo utilizzando il citometro a flusso di riferimento (vedere la Tabella dei materiali). Per altri citometri a flusso, attenersi alle istruzioni del produttore. L'impostazione della tensione del citometro a flusso è stata preconfigurata per prestazioni ottimali con PBMC umani, eliminando la necessità di regolazioni della tensione prima di ogni esecuzione FACS.
  2. Se la macchina è in modalità di acquisizione , andare al passaggio 5.3. Se la macchina è in modalità di analisi dei dati , passare alla modalità di acquisizione premendo il pulsante di accensione in alto a destra. Quando viene visualizzato un popup, premere il pulsante che legge la modalità di acquisizione.
  3. In basso a sinistra, se la macchina visualizza Calibrazione richiesta, procedere al passaggio 5.3.1. Se la macchina legge Calibrazione ok, passare al passaggio 5.4.
    1. Per calibrare la macchina, estrarre le perle di calibrazione dal frigorifero a 4 °C e vortice.
    2. Inserire 1 goccia di perline di calibrazione in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 ml e posizionare la provetta nel supporto per provette singole.
    3. Premere il pulsante del codice a barre in alto a destra e scansionare il flacone del cordone di calibrazione. Apparirà un pop-up. Se tutto è configurato, fai clic su Sì | OK e lasciare che la calibrazione venga eseguita.
    4. Se la calibrazione ha esito positivo, disconnettersi e accedere nuovamente alla modalità di acquisizione . Procedere al passaggio 5.4.
  4. Fai clic su Apri | Nuova area di lavoro in alto a sinistra.
  5. Selezionare la griglia chill 5; Seleziona tre dei pozzi. Seleziona il primo pozzo e dagli una descrizione (ad esempio, FTX Ab). Seleziona il pozzo successivo e assegnagli una descrizione univoca (ad esempio, FTX Iso). Seleziona l'ultimo pozzetto e dagli la descrizione candeggina.
    NOTA: Includere sempre un campione di candeggina ogni 4-5 campioni sperimentali per garantire una pulizia tempestiva dei campioni cellulari.
  6. Selezionare tutti i pozzetti e impostare le condizioni sperimentali come segue: impostazioni dello strumento: PBMC umane; Portata: alta; Campione di miscelazione: miscelazione delicata; Modalità: standard; Volume totale del campione 200 μL; Assorbimento del campione 150 μL; Annotazione: anticorpi in ingresso e loro marcatura con fluorofori.
  7. Seleziona le opzioni modifica | e assegna un nome al file sotto descrizione| applica | ok.
  8. Estrarre la griglia dal frigo e posizionarla sulla teglia con il codice a barre rivolto verso la macchina. Posizionare le provette del campione nel rack per riflettere l'ordine dei campioni sullo schermo e premere il pulsante di riproduzione per avviare l'esperimento.
  9. Al termine dell'esperimento, collegare l'USB, selezionare File | copia, espandere la cartella privata, selezionare l'esperimento e fare clic su copia ed espelli.
  10. Dopo la raccolta dei dati, utilizzare il software per analizzare la scheda tecnica.
  11. Iniziate con il controllo dell'isotipo. Utilizzare lo strumento poligono per selezionare le celle sul grafico a dispersione diretta (FSC) rispetto a quella a dispersione laterale (SSC).
  12. Elimina le celle morte modificando l'asse Y in e506 e l'asse X in FSC. Utilizzare lo strumento poligono per selezionare la popolazione di cellule vive e506-negative.
  13. Fare doppio clic sulla popolazione selezionata. Cambia l'asse Y in CD45 umano. Utilizzare lo strumento poligono per selezionare la popolazione di celle. Questa è la popolazione di cellule CD45-negative umane.
  14. Fare doppio clic sulla popolazione di cellule CD45-negative. Cambia l'asse Y in istogramma e l'asse X in EpCAM umano. Utilizzare lo strumento di selezione dell'intervallo per fare clic sulla fine dell'istogramma e selezionare lo spazio vuoto fino alla fine del grafico. Questo rappresenta la popolazione positiva per EpCAM. Ripetere per la colorazione CD10 umana.
  15. Trascinare il gating dell'isotipo nell'area di lavoro dell'anticorpo. Le cellule CD45-positive saranno gated out e saranno selezionate le popolazioni EpCAM-positive e CD10-positive.
  16. Per creare istogrammi rappresentativi, selezionare l'editor di layout. Trascina gli istogrammi desiderati nella pagina di layout. Per confrontare la colorazione dell'isotipo e dell'anticorpo, sovrapporre l'istogramma dell'isotipo con l'istogramma dell'anticorpo. Gate delle cellule positive in base al controllo dell'isotipo.

6. Immunocitochimica

  1. Cellule di coltura dopo la fase finale di isolamento nel vetrino della camera desiderata fino a quando non sono confluenti.
  2. Per fissare le cellule, aggiungere 500 μl di paraformaldeide (PFA) fredda al 4% Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
  3. Aspirare il 4% di PFA e lavare 3 volte con 1 PBS.
  4. Per permeabilizzare le cellule, aggiungere almeno 200 μl di Triton-X allo 0,25% in PBS e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
  5. Durante la permeabilizzazione, preparare il tampone bloccante (4% di siero normale di capra [NGS] per anticorpi non prodotti nella capra).
  6. Aspirare il Triton-X allo 0,25% e lavare 3 volte con 1 PBS.
  7. Aggiungere almeno 200 μL di tampone bloccante (4% NGS in PBS). Bloccare per 1 ora a temperatura ambiente.
  8. Preparare le diluizioni degli anticorpi primari in NGS all'1% in PBS 1x secondo le raccomandazioni del produttore.
  9. Dopo il blocco, aggiungere almeno 200 μl della soluzione di anticorpi primari. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
    NOTA: Alcuni anticorpi primari possono preferire un'incubazione notturna a 4 °C; Controllare la scheda tecnica degli anticorpi.
  10. Preparare soluzioni di anticorpi secondari in NGS all'1% in PBS 1x. Avvolgere le provette in carta stagnola e preparare le soluzioni al buio poiché gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce. Conservare al buio fino al momento dell'utilizzo.
  11. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavare 3x con 1x PBS.
  12. Aggiungere almeno 200 μl della soluzione di anticorpi secondari. Incubare al buio a temperatura ambiente per 1 ora.
    NOTA: Durante i passaggi seguenti, cercare di mantenere il diapositiva al buio il più possibile.
  13. Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi, lavare 3 volte con 1 PBS.
  14. Rimuovere le camere, semplicemente rimuovendole a mano o utilizzando l'attrezzo fornito con le slitte. Seguire le istruzioni stampate sulla confezione del vetrino della camera per la rimozione.
  15. Aggiungere una goccia di siero di montaggio 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e posizionare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore. Limita il numero di bolle e assicurati che tutte le celle siano coperte. Passaggio facoltativo: utilizzare lo smalto per unghie intorno ai bordi per sigillare il vetrino coprioggetti.
  16. Appoggiare il vetrino in una scatola per vetrini ad asciugare e posizionarlo a 4 °C fino all'imaging.
  17. Immagine su un microscopio dotato di fluorescenza corretta basata sulla coniugazione di anticorpi secondari per garantire un'immagine pulita.

Risultati

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Abbiamo incluso sette collezioni di tube di Falloppio in cui abbiamo isolato una popolazione di cellule epiteliali arricchita (Figura 2A e Figura S1A supplementare). Per valutare la vitalità e l'arricchimento di cellule epiteliali di questo metodo di sospensione a singola cellula, è stata eseguita la citometria a flusso. Per misurare la vitalità cellulare, le cellule sono state colorate con il marcatore di vitalità, e506. Ciò ha anche permesso di eliminare tutti i detriti e le cellule morte durante l'analisi.

Per determinare la composizione delle cellule isolate con questo metodo, i campioni sono stati colorati con un marcatore di cellule epiteliali (EpCAM), un marcatore di cellule stromali (CD10) e un marcatore di cellule immunitarie (CD45). Come si vede nella Figura 2B, abbiamo isolato una popolazione di cellule epiteliali vitali e arricchite dal tessuto delle tube di Falloppio. La vitalità del campione era in media dell'82%. Per tutti i campioni, dopo aver eliminato le cellule CD45-positive, abbiamo osservato una popolazione di cellule epiteliali arricchita con cellule EpCAM-positive in media dell'80% del campione. C'è stata una certa contaminazione delle cellule stromali, ma in media solo il 7,8%. La Figura 2C mostra le cellule isolate in 2D 4-6 giorni dopo la placcatura. È evidente che le cellule epiteliali sono state isolate quando hanno formato grappoli aderenti coerenti dall'aspetto di ciottoli. Nella Figura S1B supplementare, le cellule sono state piastrate dopo l'isolamento e coltivate per 2-6 giorni. L'immunocitochimica è stata utilizzata per caratterizzare le cellule che crescono in coltura. La maggior parte delle cellule nella coltura è risultata positiva per EpCAM e il marcatore di cellule secretorie, PAX8. Solo poche cellule sono state identificate come vimentina-positive. Le cellule ciliate sono state osservate in coltura come catturato dal video, mostrato nel video supplementare S1.

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Figura 1: Schema sperimentale. (A) Le tube di Falloppio vengono acquisite. (B) Il grasso in eccesso e il tessuto connettivo vengono rimossi. (C) I tubi vengono tagliati in pezzi di ~3-5 mm. (D) I pezzi vengono lavati in PBS, quindi incubati in EDTA 2 volte per 5 minuti e incubati in tripsina all'1% per 40 minuti a 4 °C. (E) Usando due paia di pinze, una per tenere e una per spingere, espellere le cellule epiteliali dai pezzi delle tube di Falloppio. (F) Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL, centrifugare e contare. (G) Risospensione in DMEM, collagenasi e DNasi. Digerire per 30-45 min. (H) Filtrare con un colino da 100 μm. (I) Raccolta per centrifugazione e conteggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Caratterizzazione di cellule epiteliali isolate. (A) Tabella delle informazioni cliniche del paziente e dei risultati della citometria a flusso. (B) La citometria a flusso è stata eseguita dopo l'isolamento per dimostrare che era stata isolata una popolazione arricchita di cellule epiteliali (EpCAM-positive). Il controllo negativo dell'isotipo è indicato in nero e il risultato sperimentale è indicato in rosa. (C) Le celle sono state piastrate dopo l'isolamento. Le foto sono state scattate 4-6 giorni dopo la placcatura. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: AUB = Sanguinamento uterino anomalo; EIN = Neoplasia intraepiteliale endometriale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1 supplementare: Caratterizzazione aggiuntiva di cellule epiteliali isolate in coltura. (A) Tabella delle informazioni cliniche del paziente. (B) Le cellule isolate sono state coltivate e colorate per EpCAM, un marcatore di cellule secretorie (PAX8) e un marcatore di cellule stromali (Vimentina) 2-6 giorni dopo la piastratura per caratterizzare il tipo di cellula in coltura. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: EIN: Neoplasia intraepiteliale endometriale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per scaricare questa figura.

Video supplementare S1: Il video del battimento delle cellule ciliate è stato girato con un ingrandimento di 30x per dimostrare le cellule ciliate in coltura. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

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C'è un notevole interesse nello studio dell'epitelio delle tube di Falloppio poiché le tube di Falloppio svolgono un ruolo significativo nella riproduzione e sono il sito di origine della maggior parte degli HGSOC. A tal fine, molti ricercatori hanno descritto protocolli per isolare le cellule delle tube di Falloppio in modelli umani e murini 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21. Il metodo che descriviamo per estrarre e arricchire le cellule epiteliali delle tube di Falloppio si aggiunge ai protocolli di isolamento delle cellule delle tube di Falloppio esistenti. Sebbene esistano sovrapposizioni all'interno di questi protocolli, ci sono due tipi generali di metodi riportati nei topi e negli esseri umani. Il primo prevede la macinazione e la digestione enzimatica dell'intera tuba di Falloppio che dà una sospensione cellulare totale 10,12,15,16,17. Il secondo comporta la desquamazione con agitazione o raschiatura, che si traduce in fogli di tessuto 11,18,19,20,21. Entrambi i metodi consentono di analizzare le cellule epiteliali tramite esperimenti a valle come la citometria a flusso, il sequenziamento e la coltura in vitro. Uno dei principali vantaggi del nostro metodo è che il protocollo produce una popolazione di cellule delle tube di Falloppio che sono già arricchite per le cellule epiteliali attraverso la digestione enzimatica e le fasi di spinta meccanica. Questa popolazione arricchita per gli epiteli può essere ulteriormente digerita dando vita a una sospensione a singola cellula che può essere utilizzata per molte applicazioni come la citometria a flusso, la coltura 2D, l'immunocitochimica e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

I passaggi chiave che abbiamo riscontrato per influenzare la resa cellulare includono la durata per la quale i frammenti delle tube di Falloppio incubano in tripsina/HBSS all'1% e DMEM/DNasi. La sovraincubazione in entrambe le soluzioni degraderà le cellule e diminuirà significativamente la vitalità delle cellule. Tuttavia, un tempo di incubazione insufficiente inibirà la capacità del ricercatore di espellere molte cellule epiteliali durante la fase 2.6 del protocollo, poiché continueranno ad aderire l'una all'altra. È anche importante utilizzare una soluzione di tripsina all'1%, poiché sia le concentrazioni più basse che quelle più alte di soluzioni di tripsina riducono la resa delle cellule epiteliali vitali delle tube di Falloppio. Combinando l'isolamento chimico e meccanico e una fase di digestione (fase del protocollo 3.1), possiamo accorciare esponenzialmente il periodo necessario per passare dalla sospensione tissutale a quella di una singola cellula. Ciò garantisce una buona redditività e il tempo necessario per eseguire l'analisi a valle lo stesso giorno.

Nella fase 1.4 del protocollo, è fondamentale assicurarsi che i pezzi di tube di Falloppio tagliati abbiano uno spessore di 3-5 mm. Se i pezzi sono troppo grandi, sarà difficile eseguire la fase 2.7 del protocollo e, in ultima analisi, ridurre la resa cellulare poiché sarà necessario un tempo di incubazione più lungo in DMEM/DNasi.

Sebbene la sospensione cellulare sia arricchita per le cellule epiteliali, la contaminazione delle cellule stromali è inevitabile. Se la preparazione deve essere puramente epiteliale, è possibile eseguire lo smistamento utilizzando la citometria a flusso e i marcatori che abbiamo descritto per isolare le cellule epiteliali e esaurire le cellule stromali.

In questo studio sono state utilizzate le tube di Falloppio in postmenopausa. Tuttavia, questo metodo è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio sulle tube di Falloppio in premenopausa. La principale differenza tra le tube di Falloppio pre e postmenopausali è la composizione delle cellule epiteliali ciliate e secretorie1. Questo protocollo funziona per tutte le fasi riproduttive.

Questo efficiente protocollo faciliterà lo studio dei tipi cellulari dell'epitelio delle tube di Falloppio, compresa la delineazione delle linee cellulari, i loro cambiamenti dinamici durante i cicli riproduttivi e dopo la menopausa e il loro ruolo nell'avvio del carcinoma ovarico sieroso di alto grado.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Gli autori Ruegg L, James-Allan LB e DiBernardo G sono parzialmente supportati dai progetti 1I01BX006019-01A2 e I01BX006411-01 della Greater Los Angeles Veterans Association a Memarzadeh S. L'autore Ochoa C è supportato da UCLA Eli e Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Rose Hills Foundation Graduate Scholarship Training Program. Vogliamo ringraziare il Translational Pathology Core Laboratory dell'UCLA e in particolare Ko Kiehle e Chloe Yin per l'assistenza nell'approvvigionamento dei tessuti. Vogliamo anche ringraziare Ken Yamauchi e il BSCRC Microscopy core per la loro assistenza nell'imaging. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com (numero di contratto JL27QWDYNT). Infine, vorremmo ringraziare Felicia Cordea e il nucleo di citometria a flusso BSCRC per l'assistenza nella citometria a flusso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1% tripsina Thermo Scientific J63993.09
100 & micro; m Cell StrainerCorning431752
4% ParaformaldeideMicroscopia ElettronicaSciences 15710-S
5 mL provette a fondo tondoCorning352008
60 mmpiastra per coltura cellulare Corning CLS430589-500EA
Piastra per colture cellulari a 6 pozzettiCorning353046
Anti-CD10BioLegend312212
Anti-CD326 (Ep-CAM)BioLegend324218
Anti-CD45 BioLegend304026
Anti-EpCAMAbcamab223582
Anti-IgG2a PerCP BioLegend400250
Anti-PAX8Sigma-Aldrich363M-15
Anti-VimentinAgilent TechnologiesM072501-2
Sistema di vetrinia camera Thermo Scientific 154917PK
Collagenasi Thermo Scientific 
DMEMThermo Scientific 10569-010
DNase ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
Pinza a punta fine VWR102091-526Qualsiasi pinza finepoint di tua scelta funzionerà
Colorante di vitalità riparabile eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FlowJo versione software 9 BD Biosciences Software dianalisi dati
GlutaMAXGibco35050-061
HBSSThermo Scientific 14175-095
Citometro a flusso MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec
MACSQuant Perle di calibrazioneMiltenyi Biotec130-093-607
Mammocult Stemcell Technologies5620
Siero di capra normaleFisher ScientificPI31873
PBS Thermo Scientific 14190-144
Penicillina-StreptomiocinGibco15140-122
PerCP CD45 coniugatoBioLegend304026
tampone per lisi dei globuli rossi Tonbo BiosciencesTNB-4300-L100 
Triton X-100Thermo Scientific BP151-100
Forbici a molla Vannas-Tubingen Strumenti per la scienza fine15003-08
VECTASHIELD con DAPIFisher Scientific NC9524612
17100017

Riferimenti

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