Method Article

Plug-in Micro-Manager open source per l'imaging live-view di dipoli fluorescenti

DOI:

10.3791/67755

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March 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato un plug-in Micro-Manager open source, che consente l'osservazione in tempo reale di dipoli fluorescenti su un microscopio a illuminazione strutturata. Il plug-in supporta l'osservazione dell'orientamento del dipolo 2D e 3D.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia a polarizzazione a fluorescenza (FPM) è in grado di visualizzare la posizione e l'orientamento del dipolo dei fluorofori. Nonostante i risultati della microscopia a polarizzazione a fluorescenza a super-risoluzione, la loro dipendenza dalla post-acquisizione ostacola l'osservazione in tempo reale. La microscopia a illuminazione strutturata polarizzata (pSIM) offre immagini a super-risoluzione di dipoli fluorescenti con un'elevata velocità di imaging ed è particolarmente adatta per applicazioni su cellule vive. Abbiamo sviluppato un'implementazione open-source per la ricostruzione in tempo reale delle immagini di polarizzazione e la visualizzazione dei dipoli fluorescenti. Inoltre, abbiamo esteso il metodo per ottenere la mappatura dell'orientamento 3D (3DOM), ampliandone l'utilità per studi biologici complessi. Inoltre, abbiamo presentato un'introduzione completa all'estensione di un microscopio SIM esistente sull'imaging a polarizzazione e fornito una guida dettagliata alla configurazione di Micro-Manager 2.0 per controllare il microscopio, consentendo l'anteprima in tempo reale dell'imaging polarizzato. Inoltre, abbiamo fornito il codice MATLAB per la ricostruzione completa che comprende sia pSIM che 3DOM. Questa guida completa ha lo scopo di aiutare i principianti a padroneggiare rapidamente e iniziare facilmente le operazioni.

Introduction

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La microscopia a polarizzazione a fluorescenza (FPM) è emersa come una potente tecnica per l'imaging simultaneo sia della posizione che dell'orientamento del dipolo dei fluorofori, offrendo approfondimenti sull'imaging biologico 1,2. Facilitando l'osservazione della direzione degli orientamenti delle biomolecole, FPM svela l'intricata disposizione di macromolecole come l'actina 3,4,5, il microtubulo5, la septina6, il filamento di DNA

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Protocol

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1. Estensione di un microscopio a illuminazione strutturata esistente per l'imaging a polarizzazione

  1. Prepara un microscopio SIM.
    NOTA: Partiamo dal presupposto che i lettori abbiano una certa base nella configurazione del microscopio e possiedano già un microscopio ottico strutturato. Se non si ha esperienza in materia, fare riferimento a questo documento, che fornisce una descrizione dettagliata di come costruire un microscopio SIM16. L'unità di controllo della polarizzazione di "HWP+WQP+LCVR" può essere sostituita da una piastra a onda vortice per pizza nel nostro pSIM work

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Results

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Il metodo pSIM può essere eseguito su microscopi SIM in base all'interferenza utilizzando raggi laser polarizzati s. L'interferenza di polarizzazione s è il tipo di SIM più utilizzato e genera strisce di illuminazione ad alto contrasto. Il prototipo accademico di una configurazione di microscopio è incluso nel lavoro originale di pSIM5. Brevemente introdotto nella Figura 1, un modulatore di luce spaziale (SLM) genera l'ordine ±1 dei fa.......

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Discussion

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Nel nostro studio, abbiamo sviluppato un plugin che consente l'anteprima in tempo reale di due tecniche di imaging a polarizzazione, pSIM e 3DOM. Entrambe le tecnologie possono essere eseguite in un sistema SIM esistente con lievi modifiche. Abbiamo fornito i passaggi dettagliati per installare il microscopio pSIM e 3DOM e configurare Micro-Manager per controllare il microscopio e dimostrare come ottenere i risultati della polarizzazione live-view. I risultati sperimentali includono il f.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2022YFC3401100).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 nm Perline fluorescentiInvitrogenF8801
4% Soluzione di formaldeideInvitrogenR37814
FotocameraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Materiali di base per protesi dentarie (Tipo I Tipo di tipo termofissante, liquido)New Century DentalN/A
Dulbecco' s Aquila modificata' s MediumGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Microscopio invertitoNikonTE2000 E
Siero fetale bovinoGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksVersione R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinVersione 4.0Software di modulatore
di luce spazialeMicro-Manager 2.0μ Μ AnagerVersione 2.0Scarica Micro-Manager Ultima versione
MS-2000 XYZ Automated StageApplied Scientific InstrumentationMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Download di software e driver - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW LaserCoherent1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
Soluzione salina tamponata con fosfatoCorning21-040-CV
PolimetilmetacrilatoSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Modulatore di luce spazialeKopinSXGA-12
SYTOX colorazionearancione dell'acido nucleicoInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TripsinaGibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

References

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  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....

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Fluorescence Polarization MicroscopyPolarized Structured IlluminationSuper Resolution ImagingFluorescent DipolesLive Cell ImagingMicro Manager PluginReal Time Reconstruction3D Orientation MappingPolarization ImagingMATLAB Reconstruction Code
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