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Articolo metodologico

Un metodo QuEChERS-HPLC modificato per la rilevazione di idrocarburi policiclici aromatici in embrioni di zebrafish esposti a particolato fine

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DOI:

10.3791/67757

⸱

13 giugno 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un metodo QuEChERS-HPLC modificato per valutare i livelli interni di 16 IPA negli embrioni di zebrafish.

Abstract

L'esposizione materna al particolato fine (PM2,5), con un diametro aerodinamico di 2,5 μm o inferiore, è stata collegata all'aborto spontaneo e a varie malattie congenite nell'uomo. Tuttavia, i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Gli embrioni di zebrafish sono ampiamente utilizzati per studiare la tossicità per lo sviluppo del PM2,5 , ma misurare i livelli interni di idrocarburi policiclici aromatici (IPA), i principali costituenti tossici del PM2,5, rappresenta una sfida. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni (QuEChERS-HPLC) rapido, facile, economico, robusto e sicuro per valutare i livelli interni dei 16 IPA elencati nell'elenco degli inquinanti prioritari dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente (EPA) degli Stati Uniti. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con materia organica estraibile (EOM) da PM2,5 per 2-72 ore dopo la fecondazione (hpf). Il metodo QuEChERS è stato impiegato per la preparazione dei campioni e HPLC-FLD/DAD (HPLC con rivelatore a fluorescenza e rivelatore a diodi) è stato impiegato per le analisi qualitative e quantitative degli IPA. Abbiamo rilevato con successo sei IPA (fenantrene, antracene, fluorene, acenaftene, fluorantene e pirene) in embrioni di zebrafish esposti a PM2,5. Questo metodo è fondamentale per studiare i meccanismi della tossicità per lo sviluppo indotta dal PM2,5.

Introduzione

Particolato fine (PM2,5), con diametro aerodinamico uguale o inferiore a 2,5 μm. è uno dei principali fattori di rischio ambientale. Grazie alle sue piccole dimensioni, il PM2,5 è in grado di entrare nel sistema circolatorio e permeare la barriera materno-fetale. Studi epidemiologici hanno collegato l'esposizione materna al PM2,5 con l'aborto spontaneo e varie malattie congenite 1,2,3,4. Tuttavia, i meccanismi alla base della tossicità embrionale del PM2,5 non sono ben compresi. Gli IPA, il principale componente tossico del PM2,5, sono altamente tossici per l'uomo a causa delle loro proprietà mutagene e cancerogene 5,6. Tra le centinaia di IPA, 16 sono stati classificati come inquinanti ad alta priorità dall'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (EPA).

Il pesce zebra, Danio rerio, è un potente organismo modello di vertebrato grazie alla sua somiglianza genetica con l'uomo, al rapido sviluppo, all'alto tasso di riproduzione e alla facilità di manutenzione. La trasparenza degli embrioni di zebrafish consente l'osservazione diretta dell'intero corpo al microscopio, consentendo studi dettagliati. Gli IPA disciolti possono entrare negli embrioni di zebrafish per diffusione7. Molti studi hanno utilizzato embrioni di zebrafish per esplorare gli effetti tossici e i meccanismi della materia organica estraibile (EOM) da PM2,5 8,9,10,11. Tuttavia, la maggior parte di questi studi ha caratterizzato solo i 16 IPA prioritari nell'EOM, senza rilevare i livelli interni di IPA negli embrioni di zebrafish12. Questa sfida può essere dovuta alle piccole dimensioni degli embrioni di zebrafish e alla complessità della matrice embrionale.

Il metodo QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) è un'innovativa tecnica di preparazione dei campioni utilizzata per l'analisi di residui di pesticidi, farmaci veterinari e altri contaminanti in campioni alimentari e ambientali13,14. Se abbinato alla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), questo metodo è stato utilizzato per rilevare i pesticidi nel pesce zebra15. Gli IPA, che contengono due o più anelli benzenici, hanno forti proprietà di fluorescenza, che li rendono particolarmente adatti per il rilevamento con rivelatori a fluorescenza. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo QuEChERS-HPLC modificato per valutare i livelli di 16 IPA negli embrioni di zebrafish esposti a EOM.

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Protocollo

1. Trattamento del campione

  1. Collezione PM2.5
    1. Raccogli il PM2,5 su filtri a membrana al quarzo da 47 mm.
      NOTA: Il PM2,5 è stato raccolto nell'area urbana di Suzhou, in Cina.
  2. Estrazione EOM
    1. Tagliare il filtro a pezzetti e metterlo in un pallone di vetro conico con 150 mL di acetonitrile.
    2. Ultrasuoni nel matraccio a 35 °C per 1 ora e trasferimento dell'estratto in quattro provette da 50 mL.
    3. Centrifugare a 7.000 × g per 20 minuti, quindi trasferire il surnatante in un evaporatore rotante e concentrarlo a circa 5 ml.
    4. Evaporare a secco sotto flusso di azoto in un bagno d'acqua a 35 °C e sciogliere il residuo in dimetilsolfossido (DMSO).
  3. Trattamento degli embrioni di zebrafish
    1. Mantenere il pesce zebra in un sistema di ricircolo dell'acqua con un ciclo di luce di 14 ore e buio di 10 ore a 28 °C16.
    2. Raccogliere gli ovuli fecondati (200 embrioni per gruppo) e trasferirli in piastre di Petri di vetro (vetro soda-calcico, 80 x 15 mm) con 30 ml di acqua proveniente dal sistema di ricircolo dell'acqua.
    3. Aggiungere 30 μL di EOM (10 mg/mL) in una piastra di Petri di vetro contenente 200 embrioni a 2 ore dopo la fecondazione (hpf). I gruppi non trattati fungono da controlli vuoti.
      NOTA: La concentrazione finale di EOM è di 10 mg/L, in base al tasso di malformazione cardiaca (Figura supplementare S1).
    4. Mettere le piastre in un'incubatrice a 28 °C.

2. Preparazione del campione QuEChERS

  1. Rimuovere le piastre con embrioni a 72 hpf dall'incubatrice. Lavare gli embrioni 3 volte con acqua pura.
  2. Trasferire gli embrioni in provette da 1,5 ml (a seconda dei diversi gruppi) e rimuovere l'acqua in eccesso.
  3. Mettere i tubi in un congelatore a -80 °C per 30 minuti per liofilizzare gli embyros17 e liofilizzarli. Quindi, macina gli embrioni usando una bacchetta di vetro.
  4. Aggiungere 25 μL di soluzione standard mista a 16 IPA (2,0 μg/mL) al gruppo di controllo DMSO per testare il recupero dei picchi.
  5. Aggiungere 1 mL di n-esano e agitare per 30 s, quindi ultrasonicare a 35 °C per 30 min.
  6. Centrifugare a 7.000 × g per 5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta nuova.
  7. Ripetere i passaggi 2.5 e 2.6.
  8. Far evaporare i surnatanti raccolti fino a indurirli sotto flusso di azoto in un bagno d'acqua a 35 °C.
  9. Aggiungere 1 mL di acetonitrile e vorticare per 30 s.
  10. Aggiungere 10 mg di ammina secondaria primaria (PSA), 45 mg di solfato di magnesio e 15 mg di impacchettamento C18, quindi vorticare per 30 s.
  11. Centrifugare a 7.000 × g per 5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta nuova.
  12. Ripetere il passaggio 2.9 e centrifugare a 7.000 × g per 5 minuti. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo.
  13. Far evaporare il surnatante a 0,5 ml sotto azoto.
  14. Filtrare attraverso una membrana microporosa da 0,22 μm.

3. Determinazione degli IPA mediante HPLC

  1. Preparare una serie di soluzioni di lavoro (che vanno da 1 a 500 ng/mL) per lo standard miscelato a 16 PAH con acetonitrile e iniettarle in un cromatografo liquido utilizzando acetonitrile/acqua come fase mobile.
    1. Iniettare 20 μl e utilizzare la seguente procedura di eluizione: 0-18,5 min, acetonitrile al 40% in acetonitrile al 100%; 18,5-28 min, 100% acetonitrile; 28-29,5 min, dal 100% al 40% di acetonitrile; tempo di sosta: 32 min; temperatura della colonna: 25 °C; portata: 1,8 mL/min. Tracciare una curva standard con le concentrazioni di massa delle soluzioni di lavoro standard sull'asse x e le corrispondenti aree di picco sull'asse y, coprendo un intervallo da 5 ng/mL a 500 ng/mL.
      NOTA: Le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione degli IPA sono riportate nella Tabella supplementare S1.
  2. Iniettare il campione purificato (dal punto 2.14) nel cromatografo liquido con un rivelatore a fluorescenza (FLD) e un rivelatore a matrice di diodi (DAD).
  3. Identificare la presenza di IPA confrontando i tempi di ritenzione e misurare le aree di picco associate.
    NOTA: Le concentrazioni di massa degli IPA sono state determinate utilizzando la curva standard precedentemente generata dal passaggio 3.1.1.
  4. Calcolare le concentrazioni interne dei 16 IPA in base alle concentrazioni di massa misurate dei campioni.

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Risultati

L'intera procedura per l'esposizione alle EOM, la preparazione del campione e il rilevamento degli IPA è illustrata nella Figura 1. Per HPLC-FLU/DAD, un rapporto segnale/rumore di 3:1, con un intervallo di rilevamento da 0,3 a 5,0 ng/mL, è stato considerato accettabile. I limiti di rilevamento del metodo variavano da 3,0 × 10-4 a 5,0 × 10-3 ng/organismo. Tutte le curve di calibrazione hanno mostrato un'elevata linearità (r2 > 0,999). I valori di precisione...

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Discussione

Gli embrioni di zebrafish sono un potente modello di vertebrato per studi di tossicità sullo sviluppo, ma le loro piccole dimensioni complicano la rilevazione di composti organici semivolatili (SVOC) come gli IPA. Durante la preparazione del campione, è fondamentale prevenire la contaminazione degli embrioni di zebrafish. Una corretta pulizia dei campioni è un passaggio fondamentale per evitare il trasferimento di composti dal mezzo di esposizione all'estratto del campione. Un lavaggio i...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione: 81972999) e dal Suzhou Science and Technology Development Plan (Basic Research on Medical Applications, SKY2023036 and SKY2023115).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
16 IPA soluzioni standard miste o2si Smart Solutions (South Carolina, USA)110124-0616 IPA soluzioni standard miste  include naftalene (Nap), acenaftilene (Acy), ace-naftene (Ace), fluorene (Flo), fenantrene (Phe), antracene (Ant), fluorantene (Influenza), pirene (Pyr), benzo [a] antracene (BaA), crisene (Chr), benzo [b] fluorantene (BbF), benzo [k] fluorantene (BkF), benzo [a] pirene (BaP), indeno [1,2,3-cd] pirene (IcdP), dibenz [a, h]antracene (DahA), benzo [g,h,i] perilene (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Santa Clara, USA)FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
AcetonitrileScharlab (Barcellona, Spagna)AC03661000solvente
CNWBOND HC-C18 SPE L'imballaggio ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CINA)SBEQ-CA0801C18 è un imballaggio a fase inversa con un buon equilibrio tra idrofilo e idrofobo, in grado di adsorbire e separare bene i composti organici polari e non polari.
Terra di diatomeeAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)12214013Per la separazione, la purificazione e la rimozione di impurità organiche‌
SPE dispersivo 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)5982-5056Filtro per la purificazione del campione
ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(Shanghai, CINA)SCAA-104Filtro ad ago in fase organica (nylon),0,22µ m
HexaneScharlab (Barcellona, Spagna)HE02481000
solvente MilliporeMerck (New Jersey, USA)Preparazione di acqua ultrapura
Organomazione - N-EVAP Evaporatori di azotoOrganomazione (Massachusetts,USA)Evaporazione di solventi
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, USA)centrifugazione
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (New York, USA)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)959990-918Questa colonna è comunemente utilizzata nei sistemi HPLC per ottenere un'analisi precisa e affidabile degli IPA.

Riferimenti

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