Articolo metodologico

Valutazione delle proprietà antiossidanti e antielmintiche degli estratti di Tithonia diversifolia contro le uova di nematodi gastrointestinali mediante saggi in vitro

DOI:

10.3791/67760

⸱

1 agosto 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Center for Technological Research, National University of Asunción (CEMIT - UNA), 2Centre of Marine Sciences (CCMAR/CIMAR LA), University of Algarve, 3Department of Food Biochemistry, Biodiversity, Food and Health Group (BIOALSA), Faculty of Chemical Sciences, National University of Asunción (FCQ - UNA), 4Carleton College

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio ha valutato le attività biologiche degli estratti di Tithonia diversifolia utilizzando metodi basati sui radicali e un saggio di schiusa delle uova in vitro (EHA) per valutarne gli effetti sui nematodi gastrointestinali nei piccoli ruminanti. Vengono descritti la metodologia e i risultati chiave, evidenziando il potenziale di questi estratti per il controllo dei parassiti.

Abstract

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Le malattie parassitarie causate dai nematodi gastrointestinali (GIN) sono considerate importanti fattori limitanti per la produzione zootecnica in tutto il mondo, in quanto compromettono in modo significativo il benessere degli animali e aumentano i costi di produzione. Per anni, il controllo dei parassiti si è basato esclusivamente sull'uso di droghe sintetiche. La resistenza del GIN agli antielmintici commerciali è stata sempre più segnalata in tutto il mondo. Pertanto, sono emersi approcci alternativi per il controllo del GIN negli animali da allevamento, compresa l'esplorazione di piante con potenziale bioattivo. La Tithonia diversifolia può essere raccolta tutto l'anno e tutte le parti della pianta sono state utilizzate nella medicina popolare per una vasta gamma di malattie. Questo studio ha valutato le proprietà antiossidanti in vitro dell'acqua e degli estratti acquosi di acetone al 70% di parti aeree di T. diversifolia , tra cui foglie, rami e fiori, utilizzando metodi basati sui radicali, e ha valutato il suo potenziale antielmintico attraverso un modello di parassiti, impiegando il saggio di schiusa delle uova (EHA) con estratti acquosi. Inoltre, è stato determinato il contenuto polifenolico totale degli estratti. Questi risultati evidenziano che T. diversifolia è una promettente fonte naturale di composti antiossidanti e antielmintici.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie parassitarie causate dai nematodi gastrointestinali (GIN) sono considerate importanti fattori limitanti per la produzione zootecnica in tutto il mondo, in quanto compromettono in modo significativo il benessere degli animali e aumentano i costi di produzione1. La relazione tra il parassita e il bestiame è influenzata da diversi fattori legati all'ospite, ovvero le caratteristiche genetiche di resistenza e resilienza degli animali, lo stato nutrizionale degli animali, il livello di parassitismo e la patogenicità delle popolazioni di parassiti coinvolte2.

Per anni, il controllo dei parassiti si è basato esclusivamente su farmaci antiparassitari sintetici. Tuttavia, l'uso prolungato ed esclusivo ha portato alla comparsa di resistenze, riducendone l'efficacia e sollecitando la ricerca di strategie alternative3. La resistenza dei nematodi a vari antielmintici è stata sempre più descritta in tutto il mondo, presentando uno scenario preoccupante, soprattutto nelle regioni tropicali4. Inoltre, i consumatori sono sempre più consapevoli della necessità di ridurre i residui di farmaci antiparassitari nella carne animale e nell'ambiente5. Pertanto, sono emersi approcci alternativi per il controllo dei parassiti nematodi negli animali da allevamento6.

La Tithonia diversifolia è un arbusto tropicale originario dell'America centrale, che possiede caratteristiche uniche che lo rendono prezioso per i sistemi di produzione dei ruminanti. Può essere raccolto tutto l'anno e tutte le parti della pianta sono state tradizionalmente utilizzate nella medicina popolare dalle comunità indigene per trattare una vasta gamma di disturbi. A livello topico, è stato applicato per alleviare il dolore addominale, le ferite, la dermatosi e i disturbi muscolari, mentre la somministrazione orale è stata impiegata per gestire infezioni, malaria, febbre, epatite e diabete. Queste diverse applicazioni terapeutiche evidenziano il suo ampio potenziale medicinale7.

Lo stress ossidativo svolge un ruolo importante nello sviluppo e nella progressione delle infezioni parassitarie, sia nell'organismo ospite che nell'organismo parassita che lotta per sopravvivere8. Per questo motivo, rilevare l'attività antiossidante è fondamentale per valutare l'attività biologica degli estratti di piante medicinali con potenziale antielmintico. A causa dell'infezione parassitaria, la concentrazione di antiossidanti nell'ospite diminuisce, mentre aumenta la concentrazione dei prodotti di ossidazione dei componenti cellulari. Nel caso dei parassiti, il mantenimento dell'equilibrio ossidativo è essenziale per prolungare la loro interazione con l'ospite e per difendersi dallo stress ossidativo generato nell'organismo ospite9.

L'evidenza dello sviluppo e della rapida diffusione della resistenza agli antielmintici solleva preoccupazioni sul fatto che i trattamenti di uso comune possano diventare inefficaci. Pertanto, un test in vitro chiamato saggio di schiusa delle uova (EHA) viene utilizzato per valutare la suscettibilità o la resistenza al benzimidazolo (BZ) nei nematodi gastrointestinali. Questo test è comunemente usato per valutare l'attività antielmintica degli estratti vegetali sulle uova e per confrontare la loro attività in funzione della dose. Uno dei principali limiti di questo test è la variabilità nella schiusa delle uova tra i test. La vitalità degli ovuli è limitata a un massimo di 3 ore, il che richiede un rapido recupero e un rapido inizio. Nonostante ciò, la percentuale di schiusa può variare. Per questo motivo, è stabilito che almeno il 70% delle uova deve schiudersi nel gruppo di controllo affinché il risultato sia considerato valido10,11. È un test economico, rapido, facile e riproducibile 12,13,14.

L'uso di estratti vegetali per esplorare alternative per il controllo del GIN si basa sulla presenza di metaboliti secondari e sul loro potenziale bioattivo. Una delle sfide in quest'area di ricerca è la quantità e la stabilità dei metaboliti secondari, poiché questi variano a seconda di fattori biotici e abiotici, nonché a causa dello stress chimico indotto dal processo di estrazione 15,16,17.

Questo studio ha ipotizzato che potrebbero verificarsi differenze nelle attività biologiche (effetti antiossidanti e antielmintici) a seconda del tipo di solvente utilizzato per l'estrazione, che potrebbero influenzare la composizione dei polifenoli e, di conseguenza, la loro bioattività. L'obiettivo di questo manoscritto è stato quello di delineare le fasi della valutazione degli estratti utilizzando un modello in vitro facilmente replicabile.

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Protocollo

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Il comitato etico animale del CEMIT approva tutti gli esperimenti che coinvolgono la manipolazione degli animali. Gli animali donatori di ovuli appartengono ad allevamenti che collaborano con CEMIT fornendo campioni fecali a scopo diagnostico preventivo. Si tratta di ovini o caprini (nessuna razza specifica), di entrambi i sessi, di età superiore a un anno e non devono essere stati sverminati nei 15 giorni precedenti la raccolta del campione. Tutte le aziende agricole partecipanti sono informate sull'uso dei campioni a fini di ricerca e forniscono il loro consenso a partecipare allo studio. Per la raccolta degli ovociti, gli stabilimenti vicini vengono prima avvisati e, dopo aver ricevuto il permesso, vengono organizzate visite sul campo per raccogliere campioni fecali freschi, garantendo l'elaborazione entro tre ore. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione del materiale vegetale

  1. Seleziona un luogo adatto per la raccolta delle specie vegetali.
  2. Raccogliere almeno due esemplari di Tithonia diversifolia per l'identificazione tassonomica e la preparazione dell'erbario.
  3. Raccogliere un minimo di 1000 g di parti aeree di T. diversifolia .
  4. Essiccare la biomassa raccolta a temperatura ambiente (circa 26 °C; cfr. figura 1).
  5. Macinare la biomassa essiccata utilizzando un macinino elettrico.
  6. Conservare il materiale macinato in frigorifero a 4 °C.

2. Preparazione degli estratti

  1. Preparare l'estratto d'acqua:
    1. Mescolare 10 g di biomassa essiccata con 100 ml di acqua distillata a 100 °C.
    2. Lasciare macerare la miscela per 24 ore agitando continuamente a 120 giri/min.
    3. Filtrare l'estratto con carta da filtro (Whatman n. 5 o equivalente).
    4. Liofilizzare l'estratto filtrato.
  2. Preparare l'estratto di acetone:
    1. Mescolare 10 g di materiale vegetale essiccato con il 70% di acetone acquoso in un rapporto 1:3.
    2. Lasciare macerare la miscela per 24 ore agitando continuamente a 120 giri/min.
    3. Filtrare l'estratto con carta da filtro (Whatman n. 5 o equivalente).
    4. Liofilizzare l'estratto filtrato.
      NOTA: Conservare gli estratti liofilizzati a -20 °C per una migliore conservazione (vedi Figura 2). Assicurarsi di ottenere almeno 5 g di estratti liofilizzati.

3. Preparazione della soluzione madre

  1. Per il dosaggio degli antiossidanti:
    1. Solubilizzare gli estratti secchi nei solventi corrispondenti (acqua distillata o acetone acquoso al 70%) fino a una concentrazione finale di 10 mg/mL.
  2. Per il saggio di schiusa delle uova:
    1. Diluire 12 mg di estratti liofilizzati in 5 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione madre di 2,4 mg/mL.
    2. Preparare cinque concentrazioni: 1,2 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,3 mg/mL e 0,15 mg/mL (vedere Figura 3).
      NOTA: Regolare il volume della soluzione madre in base al numero di pozzetti e piastre utilizzati. Ad esempio, se vengono utilizzati 48 pozzetti invece di 12, ridurre il volume di conseguenza; preparare 6 mg in 2,5 mL invece di 12 mg in 5 mL.

4. Composizione fitochimica

  1. Contenuto fenolico totale degli estratti (TPC)
    1. Miscelare 5 μl dei campioni con 100 μl di reagente Folin-Ciocalteu (F-C) diluito al 10× in acqua distillata in piastre di plastica trasparente a 96 pozzetti.
    2. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
    3. Aggiungere 100 μl di soluzione di carbonato di sodio (75 g/L in acqua).
    4. Incubare a RT per 90 min.
    5. Misurare l'assorbanza a 650 nm.
      NOTA: Esprimere il TPC come equivalenti dell'acido gallico (GAE). Costruisci una curva di calibrazione utilizzando almeno cinque concentrazioni di acido gallico.
  2. Contenuti totali di flavonoidi (TFC)
    1. Mescolare 50 μl di estratti con 50 μl di cloruro di alluminio al 2% in metanolo in piastre di plastica trasparente a 96 pozzetti.
    2. Incubare per 10 minuti a RT.
    3. Misurare l'assorbanza a 405 nm.
      NOTA: Esprimere TFC come equivalenti di quercetina (QE). Costruisci una curva di calibrazione utilizzando almeno cinque concentrazioni di quercetina.
  3. Contenuto totale di tannini (TTC)
    1. Miscelare 10 μl di estratti con 200 μl di DMACA all'1% in metanolo e 100 μl di HCl al 37% in piastre di plastica trasparente a 96 pozzetti.
    2. Incubare per 15 minuti a RT.
    3. Misurare l'assorbanza a 640 nm.
      NOTA: Esprimere il TTC in termini di mg/mL di catechina.

5. Dosaggio antiossidante - ABTS

  1. Aggiungere 0,003514 g di persolfato di potassio e 0,0203 g di ABTS a 5 ml di acqua distillata.
  2. Avvolgere la soluzione in un foglio di alluminio e incubare a 4 °C in frigorifero per 12-16 ore.
  3. Misurare l'assorbanza a 734 nm e regolarla a circa 0,7 aggiungendo etanolo. Come punto di partenza, mescolare 5 μl di soluzione ABTS con 195 μl di etanolo.
  4. In piastre di plastica trasparente a 96 pozzetti, mescolare 10 μl di estratti con 190 μl di soluzione ABTS.
  5. Per il controllo positivo (C+), miscelare 10 μl di Trolox (determinare la concentrazione utilizzando una curva standard basata sull'assorbanza del campione) con 190 μl di soluzione di ABTS.
  6. Per il controllo negativo (C-), miscelare 10 μL del solvente utilizzato per sciogliere gli estratti (acqua o acetone acquoso) con 190 μL di soluzione di ABTS.
  7. Incubare le piastre per 6 minuti a temperatura ambiente (RT).
  8. Misurare l'assorbanza a 734 nm.
    NOTA: La Figura 4 mostra un esempio di saggio ABTS.

6. Procedure parassitologiche

  1. Raccogli campioni fecali direttamente dal retto di capre naturalmente infette.
    NOTA: Raccogliere campioni fecali direttamente dal retto di capre e pecore naturalmente infette per garantire la freschezza ed evitare la contaminazione ambientale. Trattenere delicatamente gli animali utilizzando personale addestrato per ridurre al minimo lo stress. Utilizzando guanti monouso puliti, inserire un dito lubrificato e guantato nel retto e recuperare circa 5-10 g di materiale fecale. Collocare i campioni in contenitori di plastica puliti ed etichettati e conservare a 4-8 °C. Elaborare tutti i campioni entro 3 ore dalla raccolta per preservare la vitalità delle uova di elminti. Segui le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e ottieni il consenso informato dai proprietari degli allevamenti.
  2. Identificare le specie animali associate a ciascun campione.
  3. Mescolare 30 g di ciascun campione fecale con 50 mL di soluzione salina satura (densità = 1,2) per preparare i saggi di coprologia.
  4. Usa un vetrino McMaster per contare le uova.
    1. Omogeneizzare 3 g di campione fecale in 50 mL di soluzione satura di NaCl. Filtrare il composto con una garza, riempire entrambe le camere di un vetrino e lasciarlo riposare per 5 minuti.
    2. Esaminare il vetrino al microscopio con un ingrandimento del 10× e contare le uova di tipo strongile. Calcola le uova per grammo (EPG) utilizzando la formula: EPG = (conta delle uova) × 50. Questo metodo standardizza la quantificazione dei nematodi gastrointestinali nei piccoli ruminanti.
  5. Esprimere il numero di ovuli in uova per grammo (EPG).
  6. Selezionare campioni fecali con un EPG di almeno 800 per la preparazione della coltura fecale.
  7. Ottieni larve L3 da colture fecali e identifica i loro generi o specie.
    NOTA: Le uova di nematodi gastrointestinali vengono depositate nell'erba durante il ciclo di vita (vedi Figura 5). I piccoli ruminanti del bestiame mostrano comunemente poliparassitismo. La Figura 6 illustra i passaggi per eseguire l'anolisi coprologica.

7. Test in vitro - Saggio di schiusa delle uova (EHA)

  1. Raccogli campioni fecali freschi.
  2. Filtrare le feci due volte con una garza sterile.
  3. Filtrare la sospensione risultante e trasferirla in un setaccio.
  4. Lavare il materiale sul setaccio con acqua distillata.
  5. Raccogliere la sospensione lavata in provette da 15 mL.
  6. Centrifugare i campioni a ~4800 × g per 5 minuti a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga da tavolo dotata di rotore a secchiello oscillante. Centrifugare due volte con acqua distillata e una volta con soluzione salina satura per concentrare le uova sul fondo (vedere la Figura 7 per la morfologia delle uova).
  7. Risospendere le uova in PBS.
  8. Regolare la concentrazione di uova a 100 uova/mL per l'impostazione del saggio.
  9. Preparare il controllo positivo sciogliendo il tiabendazolo (TBZ) in PBS a 0,025 mg/mL.
  10. Preparare il controllo negativo utilizzando la sospensione di uova in PBS.
  11. Utilizzare piastre multipozzetto da 48 pozzetti per il saggio.
  12. Preparare un volume finale di 250 μl in ciascun pozzetto utilizzando una miscela 50/50 (v/v) di estratto e sospensione di uova.
  13. Aggiungere circa 100 uova/mL in ogni pozzetto.
  14. Testare ogni concentrazione in quadruplicato (quattro repliche).
  15. Contare le uova al microscopio invertito con un ingrandimento del 40×.
  16. Usa solo piastre con un tasso di tratteggio del ≥70%.
  17. Contare le larve (L1), le uova non schiuse (UnE), le uova contenenti larve (LFE) e le uova morulate (ME) per ogni concentrazione.
    NOTA: Un riepilogo rappresentativo del protocollo di saggio della schiusa delle uova è mostrato nella Figura 8.

8. Anesi statistica

  1. Esegui analisi statistiche descrittive utilizzando Excel.
  2. Utilizzare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e i test t per valutare le differenze tra le concentrazioni a un livello di significatività di 0,05.
  3. Calcolare la concentrazione effettiva del 50% (EC50) utilizzando l'analisi Probit basata sui dati di concentrazione trasformati log10 (vedere il file supplementare 1).

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Risultati

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Contenuto fenolico totale (TPC), contenuto totale di flavonoidi (TFC) e contenuto totale di tannini (TTC)
I risultati di TPC, TTC, TFC e ABTS su Tithonia diversifolia sono mostrati nella Tabella 1. I valori sono espressi come mg di equivalenti di acido gallico per grammo di sostanza secca (mg GAE/g SS) per TPC, mg di equivalenti di quercetina per grammo di sostanza secca (mg QE/g DM) per TFC e mg di catechina equivalenti per grammo di sostanz...

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Discussione

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Questo articolo delinea alcuni passaggi essenziali per far progredire la ricerca sulle piante medicinali. I test in vitro, come il saggio di schiusa delle uova (EHA), sono particolarmente interessanti perché possono essere condotti in condizioni di laboratorio controllate. L'EHA è progettato per valutare l'attività di estratti vegetali a varie concentrazioni sulle uova di nematodi, confrontando i risultati con controlli positivi e negativi. I risultati ottenuti offrono preziose ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tutti i produttori che si affidano a noi per effettuare la campionatura con i loro animali. Luísa Custódio ha ricevuto fondi nazionali portoghesi dalla Fondazione per la scienza e la tecnologia (FCT) attraverso i progetti UIDB/04326/2020 ( D O I: 1 0 . 5 4 4 9 9 / U I D B / 0 4 3 2 6 / 2 0 2 0 ), U I D P / 0 4 3 2 6 / 2 0 2 0 (DOI:10.54499/UIDP/04326/2020), LA/P/0101/2020 (DOI:10.54499/LA/P/0101/2020) e CEECIND/00425/2017. Rocio Avila ha ricevuto il Fondo di tirocinio di Nini per aver reso possibile questo progetto fornendomi un sostegno finanziario e al Carleton Career Center per l'orientamento e il supporto professionale. Griselda Meza ha ricevuto un Beca de Investigacion BINV02 -52 CONACYT - 2nd convocatoria per recarsi in Portogallo e fare saggi fitochimici. Ismael Llano ha ricevuto il modulo Beca Movility PINV01 -306, CONACYT, per eseguire il test di schiusa delle uova in Brasile.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi da 15 mLIn loco
Piastra a 48 foriIn loco
Piastre a 96 pozziVWR 734-0126
ABTSEnzimaticaA1088.0005In loco
Microscopio ottico accademico e microscopio invertitoIn loco
AcetoneEnzimaticaA/0600/17
Cloruro di alluminio  Sigma Aldrich6911
Reagente DMACASigma Aldrich49825
Etanolo 96%EnzimaticaVR11202
Feci di animaliRaccolti nelle fattorie vicino all'università
Folin CiocalteauSigma AldrichF9252
Acido gallicoSigma Aldrich91215
HClSigma Aldrich258148
Fotocamera McMasterIn loco
MetanoloEnzimaticaM/4000/17
PBSIn loco
Estratti vegetaliIn loco
Persolfato di potassio Sigma Aldrich216224
QuercetinaSigma AldrichQ4951
SaleIn loco
Carbonato di sodio Sigma Aldrich1063920500
ThiabendazoleIn loco
TroloxSigma Aldrich648471In loco
AcquaIn loco
Whatmann n. 5VWR WHAT97039654

Riferimenti

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