Metodo ad alto rendimento per l'osservazione dei fenotipi di motilità in Pseudomonas aeruginosa

Summary

Questo protocollo presenta un metodo rapido ed efficiente per identificare i fattori genetici coinvolti in vari tipi di motilità in Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

I comportamenti di motilità spesso giocano un ruolo significativo nella capacità di un batterio di sfruttare le risorse disponibili nel suo ambiente. Ciò è particolarmente vero per il versatile patogeno Pseudomonas aeruginosa, che può esibire diversi tipi di motilità, tra cui sciamatura e spasmi, che sono importanti tratti patogeni che contribuiscono alla colonizzazione superficiale, alla formazione di biofilm e all'evasione delle difese dell'ospite. Questo manoscritto presenta un protocollo di motilità ad alto rendimento per studiare i comportamenti di motilità di P. aeruginosa. Il protocollo consente di testare simultaneamente più ceppi di P. aeruginosa da una libreria di mutanti a livello di genoma, ad esempio, per identificare e analizzare i fattori genetici coinvolti nella sua motilità. L'approccio offre la possibilità di studiare la motilità in modo completo e di comprendere i meccanismi molecolari alla base della motilità di P. aeruginosa . Il protocollo qui descritto può anche essere modificato per adattarsi a diversi tipi di saggi di motilità e ad altre specie batteriche, fornendo così una potente piattaforma per far progredire la comprensione del comportamento batterico in vari contesti.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa è un patogeno opportunista che può colonizzare diversi ambienti grazie alla sua notevole versatilità metabolica ^1,2. Questa versatilità è fondamentale per la transizione da una modalità di crescita planctonica ai biofilm, che contribuisce alla sua capacità di prosperare in un'ampia gamma di nicchie che vanno dall'acqua al corpo umano ^3,4,5. La transizione tra queste modalità di crescita è aiutata da un'ampia capacità di muoversi attraverso questi ambienti utilizzando vari tipi di motilità, tra cui il nuoto, la sciamatura e le contrazioni ^1,6. Ogni tipo di motilità è mediato da meccanismi e strutture cellulari distinti e consente a P. aeruginosa di rispondere a segnali ambientali ^7,8. La motilità del nuoto è guidata da un singolo flagello polare e viene utilizzata per muoversi attraverso i mezzi liquidi verso i nutrienti, ad esempio⁹. La motilità dello sciame è un movimento coordinato facilitato dalla produzione di flagelli e biotensioattivi e consente alle colonie di diffondersi su superfici semisolide^10,11. Infine, la motilità contraente è indipendente dai flagelli. Invece, la contrazione è mediata dal pili di tipo IV (T4P) e utilizzata per muoversi sopra le superfici^12,13. La motilità a contrazione contribuisce anche alle prime fasi della formazione del biofilm di P. aeruginosa, fornendo un attacco iniziale alla superficie. Dopo l'attacco iniziale, le contrazioni consentono ai batteri di muoversi attraverso le superfici e creare microcolonie, che possono poi svilupparsi in biofilm maturi ^1,4,13.

Tradizionalmente, i saggi di motilità batterica vengono eseguiti individualmente, un ceppo alla volta, su una piastra di agar morbida o utilizzando metodi di microscopia ^6,14,15. I terreni semisolidi sono stati utilizzati per molti anni nello studio della motilità batterica. Al giorno d'oggi, queste tecniche sono ancora utilizzate per identificare i fenotipi di motilità nei batteri. Ad esempio, tradizionalmente, la motilità dello sciame si osserva inoculando 2,5 μL di una coltura di P. aeruginosa al centro di una piastra di Petri contenente terreni M9 con una concentrazione di agar 0,5%-0,8%¹⁶. La motilità delle contrazioni viene solitamente misurata osservando la diffusione dei batteri sulla superficie di interfaccia tra l'agar (all'1%) e la base di una piastra di Petri dopo che una pugnalata ha inoculato P. aeruginosa attraverso il terreno di coltura. Un grande alone di espansione della colonia interstiziale si ottiene dopo 48 ore di incubazione, mentre i ceppi che non si contraddistinguono non producono tale zona di espansione della colonia ^1,17,18.

Più recentemente, gli approcci di mutagenesi dei trasposoni hanno scoperto nuovi geni coinvolti nella motilità o nella formazione di biofilm in P. aeruginosa 19,20,21. Ad esempio, nuovi geni coinvolti nella motilità delle contrazioni sono stati trovati utilizzando una libreria di mutanti di trasposoni ad alta densità in P. aeruginosa¹⁹. Un altro strumento utile nella genomica funzionale è l'uso di raccolte di mutanti ordinate^22,23. La collezione^{Keio 24}, contenente delezioni di un singolo gene per tutti i geni non essenziali in Escherichia coli, è probabilmente la più nota collezione di mutanti ed è stata utilizzata per definire geni che influenzano vari fenotipi, dalla crescita in diversi terreni²⁵ alla morfologia cellulare²⁶ e oltre. Tali collezioni sono disponibili anche per Salmonella enterica sierotipo Typhimurium²⁷, Bacillus subtilis²⁸, P. aeruginosa²⁹ e molte altre specie. Queste collezioni sono anche adatte per studiare la motilità in modo genomico, portando allo sviluppo di un metodo ad alto rendimento per studiare la motilità di P. aeruginosa. Qui, il metodo è stato testato valutando il contributo dei mutanti di P. aeruginosa sia alla motilità delle contrazioni che a quella della sciamatura su placche ad alta densità. Questo metodo ad alto rendimento può essere utilizzato per vari fenotipi di motilità ed è adatto anche per studiare la motilità di altri batteri.

Protocol

NOTA: Il flusso di lavoro generale di questa procedura è descritto nella Figura 1.

Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale. (1) Preparare la quantità necessaria di mezzi di motilità in base al tipo di motilità di interesse negli esperimenti. (2) Utilizzando un sistema di replicazione manuale o automatizzato, preparare le piastre di partenza per la libreria di mutanti di inserimento del trasposone di P. aeruginosa della collezione di mutanti alla densità appropriata, con particolare attenzione alla precisione e all'inoculazione uniforme in tutti i pozzetti delle piastre. (3) Trasferire i campioni dalle piastre di origine della collezione di mutanti alle piastre di motilità. (4) Dopo l'incubazione, osservare e analizzare i fenotipi della motilità e identificare i geni coinvolti nella motilità di interesse utilizzando immagini di alta qualità. (5) Eseguire saggi di motilità tradizionali per convalidare i risultati identificati attraverso esperimenti di motilità ad alto rendimento. Creato con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Piastre di sciamatura - Supporti M9	Piastre a contrazione - LB media	Piastre sorgente - LB media
200 mL di una soluzione di 5 sali M9	10 g di NaCl	10 g di NaCl
10 ml di glucosio al 20%	10 g di Triptone	10 g di Triptone
25 mL di casamminoacidi	5 g Estratto di Lievito	5 g Estratto di Lievito
1 mL di 1M MgSO4	10 g di agar	15 g di agar
500 mL di agar all'1%	Aggiungi dH2O a 1L	Aggiungi dH2O a 1L
Aggiungi dH2O a 1L		Gentamicina (concentrazione finale 15 μg/mL)

Tabella 1: Composizione dei terreni per le varie piastre utilizzate nel saggio.

1. Preparazione delle piastre del terreno di coltura

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per preparare le soluzioni madre e le condizioni di conservazione. Le piastre devono essere riempite su una superficie livellata. Durante l'asciugatura, le piastre devono essere piane sulla superficie (cioè non impilate). In questo modo si garantisce che il terreno di coltura nella piastra si asciughi in modo uniforme. Qualsiasi piastra uniwell con un ingombro tipico può funzionare, ma le piastre con dimensioni interne maggiori (senza pareti interne), come le piastre Singer Instruments Plus o le piastre per coltura tissutale a pozzetto singolo non trattate VWR, facilitano il lavoro con una maggiore densità di colonie per piastra.

1. Preparare una quantità adeguata di terreno per gli esperimenti secondo la ricetta nella Tabella 1. Mantenere il terreno a ~45 °C- 50 °C per evitare che l'agar si solidifichi.
   1. Per le piastre di origine, preparare piastre da 59 LB (brodo di lisogenia) contenenti l'1,5% di agar e 15 μg/mL di gentamicina, necessarie per replicare la libreria PA14 completa-59 x 25 mL =~ 1500 mL. Preparare altre 15 piastre di agar LB 1,5% e 15 μg/mL di gentamicina per ingrandire la libreria nel formato a densità 384-15 x 25 mL = ~400 mL.
   2. Piastre a contrazione: se si lavora in formato a densità 96, preparare 59 piastre a contrazione (LB 1% agar). Preparare 15 piastre di contrazione se si lavora nel formato a densità 384.
   3. Piastre di sciamatura: Preparare 15 (formato a densità 384) o 59 (formato a densità 96) piastre a sciamatura (M9-glucosio 0,5% agar)
2. Togliere il coperchio da una piastra e versare 25 ml di terreno per piastra. Distribuire il supporto in modo uniforme sulla lastra sollevando delicatamente ogni angolo della lastra uno alla volta. Ripeti questo movimento di oscillazione 2x-3x. Rimetti il coperchio sul piatto.
3. Lasciare solidificare e asciugare le piastre a temperatura ambiente (RT) per una notte. Se i piatti non vengono utilizzati immediatamente, metterli in sacchetti ermetici e conservarli in un luogo asciutto. Possono essere conservati per 3 settimane.

2. Preparazione delle piastre sorgente della libreria di mutanti dei trasposoni di P. aeruginosa

NOTA: Le piastre sorgente si riferiscono alle piastre LBA-gentamicina contenenti una copia della libreria PA14 che vengono utilizzate successivamente per inoculare le piastre di motilità. La libreria di mutanti trasposoni di P. aeruginosa (libreria PA14) è un set di 59 piastre congelate a 96 pozzetti²⁹. Di seguito vengono descritti i passaggi per preparare le piastre sorgente per ciascun formato. Questo protocollo è adattabile per i laboratori che non hanno accesso al replicatore Rotor+. I ricercatori possono eseguire con successo le stesse procedure sperimentali utilizzando replicatori manuali, come i replicatori a 96 pin caricati a molla utilizzati qui per la replica delle piastre congelate della libreria PA14 durante il Giorno 1 (fare riferimento alla Tabella dei Materiali) o qualsiasi altro replicatore a 96 pin. I replicatori manuali devono essere sterilizzati e lasciati raffreddare tra un utilizzo e l'altro.

1. Giorno 1: Replica della libreria PA14 dalle 59 piastre congelate a 96 pozzetti sulle piastre sorgente
   1. Sterilizzare un replicatore a 96 pin caricato a molla posizionandolo su una piastra calda alla massima temperatura per 8 minuti. Dopo la sterilizzazione, lasciare raffreddare il replicatore a sufficienza (~10 min) per evitare di uccidere i batteri.
   2. Prendi una piastra sorgente. Utilizzando il replicatore sterile a 96 pin, immergere con cura i pin del replicatore in una piastra a 96 pozzetti, quindi trasferire le cellule direttamente sulla superficie della piastra di origine. Ripetere fino a quando tutte le 59 piastre congelate a 96 pozzetti della libreria PA14 sono state replicate sulle piastre sorgente.
   3. Incubare le piastre sorgente a densità 96 a 37 °C per 16-18 ore.
      NOTA: Se si utilizza il metodo con un formato a densità 96, queste piastre sorgente possono essere utilizzate per inoculare le piastre di motilità.
2. Giorno 2: Conversione dal formato a densità 96 al formato a densità 384
   NOTA: Il giorno 2 può essere saltato se si lavora a densità 96.
   1. Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare le piastre (piatte su una superficie, non impilate) a temperatura ambiente (~1 h). Se c'è condensa sui coperchi, rimuoverla utilizzando un panno delicato per evitare che le gocce d'acqua cadano sulle piastre, causando una contaminazione incrociata tra le colonie.
   2. Configurare il replicatore con i seguenti parametri per garantire un trasferimento accurato delle colonie. Accendere il replicatore. Nella sezione Selezione di una modalità operativa, selezionare Seleziona ed esegui programmi memorizzati.
   3. Nella sezione Seleziona piastre sorgente, selezionare PlusPlate 96 Agar. Nella sezione Seleziona piastre target, selezionare PlusPlate 384 Agar. Nella sezione Seleziona pastiglie, selezionare Perno corto 96.
   4. Nella sezione Replica opzioni programma, selezionare Generale e fare clic su Ricicla > Nessuno.
   5. Nella sezione Sorgente, seleziona Offset e fai clic su Casuale > Raggio predefinito. Nella sezione Target, seleziona Blocco e regola la pressione al 20%. Lasciare tutte le altre impostazioni come predefinite.
   6. Inserire i RePads a perno corto 96 nell'apposito scomparto.
   7. Posizionare le piastre di origine e di destinazione sulla piattaforma designata del replicatore. Posizionare le piastre sorgente a densità 96 (piastre 1, 2, 3 e 4) e la nuova piastra sorgente vuota (piastre LBA) sulla piattaforma. Utilizzando i parametri selezionati, il robot di spillatura dell'array microbico trasferirà le colonie dalle piastre a densità 96 alla nuova piastra a densità 384. Premere Esegui.
   8. Cambia tutte le piastre sulla piattaforma (le successive quattro piastre sorgente a densità 96 e una nuova piastra sorgente vuota) e ripeti fino a quando tutte le piastre non sono state ingrandite. Per l'ultima serie di piastre, utilizzare le piastre 57, 58, 59 e 1. Ogni piastra a densità 384 sarà composta da colonie alternate da quattro piastre a densità 96 (vedi Figura 2). Incubare le piastre LBA a densità 384 a 37 °C per 16-18 ore.
      NOTA: Queste piastre sorgente a densità 384 possono quindi essere utilizzate per inoculare la piastra di motilità per eseguire il protocollo a densità 384. In qualsiasi fase dopo l'incubazione, le piastre possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 3 settimane.

Figura 2: Upscaling da piastre a densità 96 a piastre a densità 384. Le colonie provenienti da quattro piastre sorgente a densità 96 vengono trasferite e fuse in un'unica piastra a densità 384. Ogni quadrante della piastra a 384 pozzetti corrisponde a una delle piastre originali a 96 pozzetti (rosso, blu, giallo e verde), preservando la posizione di ciascun mutante. Creato con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Esperimento di motilità ad alto rendimento

NOTA: Il protocollo è stato eseguito qui nel formato a densità 384, ma lo stesso protocollo può essere adattato a un formato a densità 96 modificando i parametri sul replicatore per il trasferimento dalle piastre sorgente alle piastre di motilità utilizzando la selezione 96 invece di 384.

1. Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare le piastre (piatte su una superficie, non impilate) a temperatura ambiente (~1 h). Se si verifica della condensa sui coperchi, rimuoverla con un panno delicato per evitare che le gocce d'acqua cadano sulle piastre, causando una contaminazione incrociata tra le colonie.
2. Prelevare il numero appropriato di piastre (59 per un formato a densità 96 o 15 per un formato a densità 384) per il test desiderato: piastre di agar M9-glucosio 0,5% per sciamatura, piastre di agar LB e piastre di agar all'1% per contrazioni.
3. Configurare il replicatore con i seguenti parametri per garantire un trasferimento accurato delle colonie.
   1. Accendere il replicatore. Nella sezione Selezione di una modalità operativa, selezionare Seleziona ed esegui programmi memorizzati. Nella sezione Seleziona piastre sorgente, selezionare PlusPlate 384 Agar.
   2. Nella sezione Seleziona piastre target, selezionare PlusPlate 384 Agar. Nella sezione Seleziona pastiglie, selezionare Perno corto 384. Nella sezione Replica opzioni programma, selezionare Generale > Ricicla > Nessuno.
   3. In Programmi Singer, selezionare Replica molti.
   4. Nella sezione Origine, selezionare Offset > Casuale > Raggio predefinito. Nella sezione Target, seleziona Blocco e regola la pressione al 2%. Lasciare tutte le altre impostazioni come predefinite.
4. Inserire lo Short Pin RePads 384 nell'apposito scomparto.
5. Posizionare le piastre di origine e di destinazione sulla piattaforma designata del replicatore. Posizionare le piastre sorgente a densità 384 e le piastre di motilità vuote sulla piattaforma. Utilizzando i parametri selezionati, il robot di blocco dell'array microbico trasferirà le colonie dalle piastre sorgente a densità 384 alle piastre di motilità. Ogni lastra a densità 384 sarà composta da una copia di una lastra sorgente a densità 384.
6. Assicurarsi che il trasferimento sia uniforme e che tutte le colonie siano adeguatamente fissate sulla superficie dell'agar delle placche di motilità. Mettere le placche di motilità inoculate in sacchetti di plastica. Posizionare con cura i sacchetti contenenti le piastre in un'incubatrice impostata a 37 °C per 18 ore.
   NOTA: Le piastre sono poste in sacchetti per mantenere l'umidità ed evitare un'asciugatura irregolare. Posizionare le piastre nell'incubatrice con i coperchi rivolti verso l'alto.
7. Dopo l'incubazione, controllare che le placche di motilità siano in grado di verificare che la crescita uniforme delle colonie sia uniforme e l'assenza di contaminazione.
8. Giorno 3: Imaging delle piastre di motilità
   NOTA: Il PhenoBooth di Singer Instruments viene utilizzato per acquisire immagini ad alta risoluzione delle piastre di motilità. Utilizza una fotocamera di livello scientifico e produce immagini da 23 megapixel. Include cinque canali di illuminazione per catturare immagini ad alta risoluzione delle colonie da piastre di Petri e piastre rettangolari. Funzionano anche altri imager di alta qualità.
   1. Dopo il periodo di incubazione, le piastre di motilità sono pronte per il processo di imaging. Accendi Phenobooth e fai clic sull'icona corrispondente al software Phenobooth.
   2. Si apre la pagina Seleziona progetto; clicca su Nuovo progetto > Conteggio delle colonie. Scegli il percorso file desiderato per memorizzare le immagini nel campo Posizione. Nel campo Risoluzione, scegliere 5626 x 4220. Fare clic su OK, il dispositivo è ora pronto per scattare foto.
   3. Inserire la piastra nel lettore con il lato medio rivolto verso l'alto dopo aver rimosso il coperchio. Assicurarsi che la piastra sia posizionata correttamente prima di chiudere il lettore per evitare di inceppare la piastra.
   4. Impostare il parametro su luce bianca nella scheda Illuminazione. Fare clic su Anteprima. Regola le impostazioni di esposizione nella scheda delle impostazioni di PhenoBooth per ottenere i parametri ottimali per osservare i fenotipi di motilità.
   5. Fare clic su Acquisisci; Le immagini acquisite appariranno sul lato sinistro dello schermo. Una volta terminato, chiudi il software (tutte le immagini catturate verranno salvate nel file precedentemente scelto nella scheda Posizione).
      NOTA: Phenobooth salva le immagini in formato JPEG, ma per le fasi di analisi a valle, le immagini possono essere in formato TIFF, JPEG o PNG.

4. Analisi dei fenotipi della motilità

NOTA: L'analisi delle immagini viene eseguita come descritto in dettaglio da French et ^al.30,31. Uno script per eseguire l'analisi dei dati è disponibile da³¹ (ImageJ Macro).

1. In breve, le immagini vengono elaborate in ImageJ³², che genera un valore per ogni colonia sulla piastra di motilità. Innanzitutto, converti le immagini in formato a 8 bit e segmenta le colonie e le aree di motilità associate dallo sfondo utilizzando il comando threshold. Disegna una regione di interesse (ROI) attorno a ogni colonia e misura l'area di motilità. In questo modo viene generata una tabella contenente un valore di densità integrato per ogni pozzetto, organizzato per righe. Questa tabella può essere salvata come file CSV per ulteriori analisi.
   1. Eseguire la macro in ImageJ e aprire la cartella contenente le immagini.
   2. Quando richiesto, regolare la rotazione della piastra modificando l'angolo della piastra utilizzando l'opzione Anteprima in modo che la piastra sia diritta. Quando sei soddisfatto, fai clic sul pulsante OK .
   3. Quindi, sposta il rettangolo attorno alle colonie e usalo per ritagliare la parte della piastra che contiene le colonie. Quando sei pronto, fai clic sul pulsante OK .
   4. Il prompt successivo definirà la griglia utilizzata per disegnare il ROI attorno a ciascuna colonia e misurare l'area di motilità. Selezionare la densità di colonia appropriata. Regola i vari parametri, se necessario, in modo che ogni cerchio sia attorno a una colonia. Quando sei pronto, attiva il comando Ok? e fare clic sul pulsante OK . In questo modo si misura l'area di motilità per ogni colonia e si salva un file CSV nella cartella contenente i dati.
2. Combina questo file CSV con la legenda della piastra, anch'essa organizzata per righe, per identificare ogni area di motilità con il mutante corrispondente. Valori di densità integrata più bassi corrispondono ai mutanti che non erano mobili o mostravano una motilità ridotta.

5. Saggi tradizionali di motilità per la validazione dei risultati

NOTA: Dopo aver osservato mutanti con motilità impattata nel protocollo di motilità ad alto rendimento, è importante convalidare individualmente i risultati ottenuti. Il protocollo di motilità individuale differisce da quello utilizzato per i test ad alto rendimento, ma i terreni utilizzati sono gli stessi.

1. Saggio della motilità a sciame
   NOTA: La motilità dello sciame viene eseguita come descritto in dettaglio da Ha et ^al.16.
   1. In breve, autoclavare in autoclave una soluzione di agar con M9 (0,5% agar), glucosio, casamino acidi e MgSO₄. Versare l'agar raffreddato e miscelato nelle piastre di Petri (25 ml per piastra).
   2. Inoculare con 2,5 μL di coltura batterica durante la notte. Incubare a 37 °C per 18 ore con le palpebre rivolte verso l'alto per osservare i fenotipi di motilità.
2. Dosaggio della motilità delle contrazioni
   NOTA: La motilità delle contrazioni viene eseguita come descritto in dettaglio da Haley et ^al.33,34.
   1. In breve, sterilizzare in autoclave un LB 1% agar (vedi Tabella 1). Versare l'agar LB 1% raffreddato e miscelato nelle piastre di Petri (25 ml per piastra).
   2. Pugnalare i batteri sul fondo delle piastre che si contraggono (1% di agar). Incubare le piastre a 37 °C per 48 ore e poi a RT per altre 48 ore. Rimuovere l'agar dalla piastra e visualizzare la zona di contrazione colorando la piastra di Petri con l'1% di cristallovioletto.
   3. Fotografa le piastre di Petri utilizzando PhenoBooth con gli stessi parametri descritti nel passaggio 3.

Results

Abbiamo utilizzato questo protocollo per caratterizzare l'effetto dell'inattivazione genica sulla motilità di P. aeruginosa ad alto rendimento. Qui, abbiamo dettagliato il suo utilizzo per studiare la motilità dello sciame e delle contrazioni in una raccolta di delezioni di P a livello di genoma. aeruginosa ceppo PA14 (libreria PA14). Il protocollo offre una grande versatilità e facilità d'uso, consentendo modifiche a diverse fasi del protocollo, come l'utiliz...

Discussion

Il protocollo di motilità ad alto rendimento qui descritto ci consente di elaborare e analizzare il fenotipo di motilità di molte colonie con precisione e riproducibilità. Rispetto ai metodi manuali tradizionali, questo approccio semi-automatizzato aumenta la scalabilità e la produttività dei saggi di motilità per consentire la valutazione dell'intero genoma della motilità batterica. Il protocollo è stato ottimizzato per l'uso con la libreria PA14, ma questo test potrebbe essere utilizza...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 piastre di pozzo	Corning	3701
Agar	Fisher Scientific	BP1423-2	Concentrazione finale dello 0,5% per la motilità dello sciami o dell'1% per la motilità del tremolamento rispettivamente.
Casaminoacidi	Fisher Scientific	223050	Prepara una scorta al 20% in acqua. Il filtro sterilizza con 0,22 e mu; m filtrare e conservare a 4 °C. Concentrazione finale 0,5% in mezzo minimo M9.
Viola cristallino	Bio Basic	CB0331	Prepara una soluzione all'1% in acqua.
D-Glucosio	Bio Basic	GB0219	Prepara un stock al 20% (1,1 M) in acqua e sterilizza tramite autoclaving. Concentrazione finale 0,2% in M9 medium minimo.
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Gentamicina solfato	Bio Basic	GB0217	Prepara un brodo da 30 mg/ml in acqua. Il filtro sterilizza con 0,22 e mu; Filtro e conservazione a 4 gradi M; C & ndash; Concentrazione finale nelle tavole 15 & micro; g/mL..
Inoculazione dell'Ancio e dell'Ago	Fisher Scientific	22363597
M9 Sali Minimi, 5X	Fisher Scientific	248510	Prepara un stock da 1 milione in acqua e sterilizzalo con autoclave. Concentrazione finale 1 mM in mezzo minimo M9. & nbsp;
Solfato di magnesio (MgSO4)	Fisher Scientific	M63-500	Prepara un stock di MgSO4 da 1 M in acqua. Il filtro sterilizza con 0,22 e mu; Filtro M e conserva a temperatura ambiente. Concentrazione finale
PA14 Inserimento Trasposone Mutante Libreria		Liberati et al., 2006 (vedi riferimento 29)	59 lastre da 96 pozzi per l'intera collezione. Ogni pozzo contiene un singolo mutante in LB con il 25% di glicerolo.
Placca di Petri 92x16mm	Sarstedt	82.1473.001
PhenoBooth+	Strumenti cantanti & nbsp;	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/	Dissolvere 11,3 g della polvere in 200 mL di acqua purificata. Autoclave a 121 & deg; C per 15 min. & nbsp;
Siringa di plastica 10 mL	Fisher Scientific	14955459
Rotor+	Strumenti cantanti & nbsp;	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/
Short pin RePads 384 densità	Strumenti cantanti & nbsp;	REP-004
Short pin RePads 96 densità	Strumenti cantanti & nbsp;	REP-002
Cloruro di Sodio (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Replicatore a molla a 96 pin	EnzyScreen	CR1000
Lama chirurgica in acciaio inox n. 25	Fisher Scientific	08-918-5F
Triptone & nbsp;	Oxoid	LP0042B
Targhe Uniwell	Strumenti cantanti & nbsp;	Piastre Plus: PLU-003	Dimensione della placca: 54 e più volte; 34 e volte; 38 cm - senza pareti interne, che offrono dimensioni interne maggiori.
Targhe Uniwell	VWR	Piastre di coltura tissutale a pozzo singolo: 75780-348	Stesse dimensioni delle PlusPlate.
Estratto di lievito & nbsp;	Fisher Scientific	248510