Method Article

Ottimizzazione dell'erogazione di vescicole extracellulari utilizzando un'impalcatura biostampata in 3D con guaina centrale per la gestione delle ferite croniche

DOI:

10.3791/67764

⸱

February 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un protocollo per la fabbricazione di scaffold stampati in 3D con guaina centrale per la guarigione cronica delle ferite. Le vescicole extracellulari sono isolate dalle cellule staminali mesenchimali e caricate nel nucleo (alginato) con la guaina in carbossimetilcellulosa e alginato liasi. Questo design consente il degrado controllato dell'impalcatura e il rilascio efficiente delle vescicole extracellulari.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio delinea un protocollo dettagliato per la fabbricazione di scaffold biostampati in 3D con guaina centrale progettati per migliorare la guarigione delle ferite croniche. Il protocollo prevede l'isolamento di vescicole extracellulari (EV) da cellule staminali mesenchimali (MSC), note per le loro proprietà rigenerative e immunomodulatorie. Queste vescicole extracellulari vengono quindi incorporate in un'unica struttura di impalcatura. L'impalcatura è caratterizzata da un nucleo composto da alginato caricato con EV, circondato da una guaina in carbossimetilcellulosa e alginato liasi. Questo design innovativo garantisce una degradazione controllata dell'impalcatura, promuovendo al contempo un rilascio efficiente e controllato delle vescicole extracellulari nel sito della ferita. Il protocollo copre passaggi chiave, tra cui la preparazione e la caratterizzazione delle vescicole extracellulari, la formulazione di bio-inchiostri per il bioprinting 3D e l'ottimizzazione dei parametri di stampa per ottenere l'architettura core-sheath desiderata. Combinando integrità strutturale e bioattività, lo scaffold mira ad affrontare i limiti delle medicazioni convenzionali per ferite, offrendo un approccio mirato per accelerare la rigenerazione dei tessuti e ridurre l'infiammazione nelle ferite croniche. Questo metodo fornisce una strategia riproducibile e scalabile per lo sviluppo di biomateriali avanzati con potenziali applicazioni cliniche nella gestione delle ferite croniche. Il protocollo evidenzia anche considerazioni critiche per ottenere risultati coerenti, garantendo l'adattabilità per future applicazioni terapeutiche.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le ferite croniche, spesso legate a un'infiammazione eccessiva, richiedono una gestione tempestiva per prevenire gravi complicazioni come infezioni e necrosi tissutale, che possono portare ad amputazioni. Nonostante i progressi, i trattamenti attuali rimangono costosi, scomodi, hanno effetti collaterali e hanno un'efficacia limitata, evidenziando la necessità di medicazioni più curative 1,2,3. Lo sviluppo di una nuova generazione di medicazioni specificamente progettate per le ferite croniche è essenziale per affrontare queste sfide. Inoltre, la natura complessa della guarigione delle ferite richiede materiali di medicazione con una gamma di proprietà, tra cui idratazione, flessibilità, adesione, bioattività e biodegradabilità4. Questo studio mira a sviluppare una medicazione per ferite bioingegnerizzata che integri vescicole extracellulari (EV) con un'impalcatura biostampata in 3D con guaina centrale per fornire un ambiente terapeutico controllato e accelerare la guarigione delle ferite croniche.

Le vescicole extracellulari derivate dalle cellule staminali aiutano la guarigione cronica delle ferite promuovendo le risposte antinfiammatorie, la crescita cellulare, la migrazione e la formazione dei vasi sanguigni5. Inoltre, le vescicole extracellulari possono fornire molecole bioattive, tra cui farmaci a piccole molecole, costrutti genici e proteici per la gestione delle ferite croniche6. Inoltre, la loro capacità di proteggere il carico dalla degradazione enzimatica migliora la stabilità e la biodisponibilità degli agenti terapeutici, offrendo vantaggi distinti rispetto ai fattori di crescita convenzionali e ai farmaci a piccole molecole, che spesso si degradano rapidamente in vivo7. Nonostante questi vantaggi, la somministrazione efficiente e prolungata di vescicole extracellulari ai tessuti bersaglio rimane una sfida significativa.

Gli scaffold di bioprinting 3D possono fungere da piattaforma di consegna per le vescicole extracellulari per potenziarne gli effetti terapeutici8. Questi scaffold imitano gli ambienti cellulari naturali e consentono il rilascio controllato di vescicole extracellulari 9,10. Inoltre, proteggono le vescicole extracellulari dalla degradazione, migliorando la stabilità dei loro microRNA e delle loro proteine11. Han et al. hanno dimostrato che le vescicole extracellulari possono essere efficacemente rilasciate da scaffold GelMA biostampati in 3D. Questo rilascio ha portato a un migliore attaccamento cellulare e a un aumento dell'espressione genica correlata alle vie di meccanotrasduzione nelle cellule staminali mesenchimali del cuscinetto adiposo buccale umano (hBFP-MSC) seminate sugli scaffold12. Born et al., ottimizzando la concentrazione del reticolante, hanno ottenuto un rilascio controllato delle vescicole extracellulari. Questo approccio si è dimostrato efficace nel promuovere l'angiogenesi e offre un metodo promettente per la somministrazione regolata di EV13.

La biostampa 3D Core-sheath consente la creazione di strutture complesse e multi-materiale stampando un materiale di base racchiuso in una guaina. Il nucleo può includere cellule, fattori di crescita o farmaci, mentre la guaina offre supporto meccanico e protezione o funge da barriera. Questo metodo ha applicazioni nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa, come lo sviluppo di reti vascolari, l'imitazione delle strutture tissutali naturali e la creazione di sistemi di somministrazione di farmaci. Consente un controllo preciso sulla distribuzione e la composizione dei materiali, migliorando la funzionalità e la rilevanza biologica dei costrutti. Rispetto alle tecniche alternative, il bioprinting 3D core-sheath fornisce un controllo preciso sulla distribuzione e la composizione del materiale, migliorando la funzionalità e la rilevanza biologica dei costrutti14,15.

La degradazione ingegnerizzata nelle medicazioni delle ferite offre vantaggi quali la riduzione del disagio durante i cambi, un ambiente umido per la guarigione e il controllo delle infezioni, una somministrazione terapeutica tempestiva e una rigenerazione tissutale ottimale 16,17,18. Gli idrogel di alginato (Alg) e carbossimetilcellulosa (CMCh) sono biocompatibili ed efficaci per vescicole extracellulari (EV) sulle ferite, migliorando la guarigione attraverso la comunicazione cellulare e la riduzione dell'infiammazione18. In questo studio, le vescicole extracellulari sono state integrate in un nucleo di Alg, mentre una guaina di CMCh e AlgLiasi (AlgLiasi) è stata utilizzata per consentire una rapida degradazione della medicazione e la somministrazione di vescicole extracellulari. Questo design della guaina centrale facilita il rilascio rapido delle vescicole extracellulari in risposta alla degradazione dell'impalcatura, migliorandone l'efficacia terapeutica e affrontando i limiti dei trattamenti esistenti per le ferite croniche. L'obiettivo principale di questo studio è sviluppare una medicazione bioingegnerizzata che migliori la guarigione delle ferite integrando il rilascio controllato di vescicole extracellulari con un'impalcatura degradabile in modo reattivo, migliorando in ultima analisi i risultati del trattamento per le ferite croniche.

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Protocol

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La ricerca sugli animali è stata condotta in piena conformità con gli standard etici stabiliti dal Comitato Nazionale di Bioetica e dal Comitato di Etica Animale dell'Università di Nizwa. L'approvazione etica per questo studio è stata concessa con l'autorizzazione ID: VCGSR, AREC/01/2023. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni di laboratorio standard, garantendo controlli ambientali ottimali, una corretta alimentazione e cure complete per salvaguardare il loro benessere durante lo studio. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali hanno aderito rigorosamente alle politiche istituzionali, agli standard internazionali per la cura degli animali e alle linee guida ARRIVE.

1. Coltura cellulare

  1. Recuperare una fiala di MSC (passaggio #2) dallo stoccaggio di azoto liquido e maneggiarla con tecniche asettiche per prevenire la contaminazione. Scongelare rapidamente le cellule a bagnomaria a 37 °C, assicurandosi di rimuoverle non appena rimane un piccolo frammento di ghiaccio.
  2. Preparare un terreno completo che includa MSC SFM Basal Medium, integrato con l'integratore MSC SFM XenoFree all'1% (v/v), GlutaMAX all'1% (v/v) e gentamicina allo 0,01% (v/v). Aggiungere 1 ml di terreno completo preriscaldato (37 °C) alla velocità di 3-5 gocce ogni 5 s, nella fiala e quindi mescolarlo delicatamente. Trasferire l'intero contenuto del flaconcino di MSC in una provetta conica da 15 mL contenente 4 mL di terreno completo preriscaldato, in condizioni asettiche in una cappa di biosicurezza di Classe II.
  3. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che la centrifuga sia bilanciata correttamente.
  4. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo preriscaldato. Quindi, trasferire le cellule in un pallone T25 contenente 4 mL di terreno completo.
  5. Inclinare delicatamente il pallone per assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente. Incubare il matraccio a 37 °C con CO2 al 5%.
  6. Cambiare il substrato ogni 2 giorni, sostituendolo con un substrato fresco, preriscaldato e completo. Utilizzare un pipettaggio delicato per evitare la rottura delle cellule. Al raggiungimento del 70%-80% di confluenza, aspirare il terreno esaurito dal pallone T25.
  7. Lavare le cellule con 3 ml di PBS fresco per rimuovere i residui. Garantire la copertura completa del pallone durante il lavaggio.
  8. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,25% al pallone T25, incubarlo a 37 °C per 3-7 minuti e monitorare attentamente il distacco al microscopio con un ingrandimento di 4x.
  9. Se necessario, picchiettare delicatamente il pallone per garantire il completo distacco della cella. Aggiungere il terreno completo preriscaldato al pallone e pipettare su e giù sulla superficie per facilitare il distacco delle cellule. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL.
  10. Centrifugare la provetta a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Sospendere il pellet cellulare in un terreno fresco e completo e contare le cellule utilizzando un emocitometro Neubauer. Trasferire le cellule in un matraccio T75. Garantire una densità di semina di 5.000 cellule/cm2 per una crescita ottimale.
  11. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5%. Dopo 72 ore di incubazione cellulare, raccogliere il terreno condizionato dalle cellule per l'isolamento delle vescicole extracellulari. Utilizzare immediatamente dopo la raccolta.

2. Isolamento delle vescicole extracellulari

  1. Centrifugare i 13 mL del terreno condizionato raccolto a 800 x g per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Filtrare delicatamente il surnatante utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm per rimuovere le particelle di grandi dimensioni.
  2. Aggiungere 5 mL di tampone di precipitazione al terreno condizionato filtrato e agitare accuratamente per mescolare. Assicurarsi che la soluzione sia omogenea.
  3. Incubare la miscela per una notte a 4 °C per consentire alle vescicole extracellulari di precipitare. Centrifugare la miscela a 3,220 x g per 30 minuti a 20 °C. Controllare il bilanciamento dei tubi.
  4. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Centrifugare nuovamente il pellet a 3.220 x g per 5 s per rimuovere il liquido residuo.
  5. Pipettare delicatamente il pellet EV in 200 μL di PBS per evitare danni ai EV. Misurare la concentrazione proteica delle EV seguendo le istruzioni del produttore (BCA Protein Assay Kit).
  6. Eseguire il Western blotting per rilevare i marcatori specifici delle vescicole extracellulari (CD63, CD81 e CD9), per verificare il fenotipoEV 18. L'analisi ha confermato la presenza di questi marcatori, convalidando l'identità delle EVs19.
  7. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione da RNasi, si consiglia di utilizzarlo direttamente senza ulteriore stoccaggio. In caso di necessità, conservare le EV a -80 °C per un ulteriore utilizzo. Aliquotare la sospensione dei veicoli elettrici in volumi di 40 μl per evitare ripetuti cicli di gelo-scongelamento.

3. Etichettatura dei veicoli elettrici con PKH-26

  1. Preparazione del tampone
    1. Sciogliere 0,238 g di HEPES in circa 90 ml di acqua ultrapura sterile in un contenitore sterile. Utilizzare una soluzione HEPES preparata al momento. Aggiungere 0,85 g di NaCl alla soluzione HEPES.
    2. Regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 M NaOH o HCl, a seconda delle esigenze, utilizzando un pHmetro calibrato. Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 100 ml. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm per sterilizzarla.
  2. Diluire 4 μL di colorante PKH-26 in 1 mL di tampone preparato. Mescolare accuratamente con la pipetta per garantire l'omogeneità.
  3. Risospendere le EV purificate in 1 mL di PBS a una concentrazione di 700 μg/mL. Aggiungere 1 mL della sospensione EVs a 1 mL della soluzione PKH-26 preparata. Per il gruppo di controllo con solo colorante, aggiungere 1 mL di terreno completo senza EV a 1 mL della soluzione PKH-26. Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti anche per il gruppo di controllo per tenere conto della potenziale aggregazione aspecifica o della formazione di micelle.
  4. Mescolare accuratamente le EV capovolgendo delicatamente il tubo 10x-15x. Incubare la miscela per 3-5 minuti a temperatura ambiente, garantendo un'esposizione uniforme delle vescicole extracellulari al colorante.
  5. Preparare 2 mL di soluzione fresca di BSA all'1% utilizzando acqua ultrapura sterile e aggiungerla ai 2 mL della miscela risultante per estinguere la reazione di marcatura. Mescolare delicatamente per evitare l'aggregazione.
  6. Concentrare le vescicole extracellulari marcate con PKH-26 secondo il protocollo sopra menzionato (passaggi 2.2-2.7). Risospendere le EV marcate in 300 μL di PBS. Pipettare il campione di EVs marcato PKH-26 in una provetta filtrante da 30 kDa.
  7. Centrifugare il campione a 3.220 x g per 30 minuti a 4 °C. Durante questa fase, il colorante libero PKH-26 e le piccole molecole passeranno attraverso la membrana nel filtrato, mentre le EV marcate con PKH-26 saranno trattenute nel retentato.
  8. Dopo la centrifugazione iniziale, scartare il filtrato e aggiungere 300 μl di PBS al retentato. Risospendere delicatamente le EV nel PBS pipettando su e giù.
  9. Centrifugare nuovamente il campione a 3.220 x g per 30 minuti a 4 °C per lavare via eventuali residui di colorante libero o piccole molecole.
  10. Confermare la mancanza di PKH-26 nella soluzione filtrata con un microscopio a fluorescenza. Se viene rilevato del colorante, ripetere i passaggi di lavaggio.
  11. Raccogliere la soluzione di testa con una micropipetta e rimuovere il filtro dalla provetta di raccolta. Capovolgere con cautela il filtro (capovolgerlo).
  12. Centrifugare il filtro invertito a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Ciò contribuirà a raccogliere i PKH-26-EV trattenuti dalla membrana del filtro nel nuovo tubo di raccolta. Usa direttamente il PKH-26-EV per il passaggio successivo.

4. 3D Bio-stampa

  1. Preparazione Bioinks
    1. Preparare una soluzione fresca di Alg sodica al 4,5% (p/v) utilizzando acqua ultrapura sterile. Agitare per una notte a 60 °C per consentire alla soluzione di sciogliersi completamente.
    2. Sciogliere la CMCh in acqua sterile ultrapura per ottenere una soluzione al 3,8% (p/v). Preparare fresco. Mescolare per una notte a 60 °C per sciogliere completamente.
    3. Centrifugare i bioink preparati a 3.220 x g per 10 minuti a 25°C per rimuovere eventuali bolle che potrebbero interferire con il processo di stampa.
    4. Miscelare i 3 mL preparati di soluzione di Alg con le EV marcate o il controllo del solo colorante utilizzando un miscelatore a siringa per ottenere la concentrazione dello 0,01% (p/v) di EV. Garantire una distribuzione uniforme grazie a una miscelazione delicata.
    5. Utilizzando un miscelatore a siringa, combinare 1 mL di CMCh con una soluzione di AlgLyase appena preparata in acqua ultrapura sterile per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mU/mL.
  2. Come illustrato nella Figura 1A, caricare contemporaneamente il bioink Alg/Exo nella parte centrale e il bioink CMCh/AlgLyase nella parte della guaina della configurazione della siringa core/guaina.
  3. Lasciare riposare i bioink per 15 minuti prima di stampare.
  4. Configurazione della stampante 3D-bio
    1. Utilizzando il software 3D-bioprinter, crea la struttura dell'impalcatura selezionando una forma cilindrica con un modello di riempimento diagonale. A tale scopo, impostare il diametro e l'altezza del cilindro rispettivamente su 20 mm e 1,1 mm. Configurare la dimensione dei pori su 1 mm.
    2. Impostare la velocità di pompaggio dell'anima e dell'ugello della guaina a 1 mm/s con uno spessore di 0,25 mm per strato e impostare la velocità di movimento a 6 mm/s. Stampa quattro strati con uno spessore di 0,25 mm per strato a temperatura ambiente.
  5. Inizia a stampare su pellicola di poliestere.
  6. Utilizzare l'umidificatore con aerosol di cloruro di calcio (2,2%) per reticolare lo scaffold durante il processo di estrusione. Posizionare l'ugello dell'umidificatore a circa 20 cm di distanza dalla testa di estrusione per garantire un'efficace reticolazione senza compromettere la struttura dell'impalcatura. Per un'ulteriore reticolazione, immergere lo scaffold in una soluzione di cloruro di calcio (2,2%) per 10 minuti.
  7. Sciacquare l'impalcatura 3 volte con acqua sterile ultrapura per rimuovere l'eccesso di cloruro di calcio e bioink non legato.
  8. Assicurarsi che l'impalcatura sia conservata in un ambiente sterile a 4 °C per mantenere l'integrità e la funzionalità dell'impalcatura per un massimo di tre mesi.

5. Monitoraggio del rilascio dei veicoli elettrici

  1. Creazione di un modello circolare di ferita cutanea
    1. Anestetizzare i topi diabetici eterozigoti maschi Akita (8 settimane) somministrando un'iniezione intraperitoneale di ketamina (70 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confermare la corretta anestesia valutando l'assenza di risposte riflesse (ad esempio, pizzicamento delle dita dei piedi) e monitorare la frequenza respiratoria. Per prevenire la secchezza corneale durante l'anestesia, applicare un unguento oftalmico veterinario sterile sugli occhi.
    2. Preparare la zona della pelle dorsale rasandola prima con un tagliacapelli elettrico. Evitare irritazioni o lesioni alla pelle. Sterilizzare l'area rasata utilizzando una soluzione di iodio povidone.
    3. Utilizzando un sequestro sterile, creare una ferita cutanea circolare a tutto spessore di 6 mm sulla superficie dorsale di ciascun topo.
    4. Posiziona delicatamente l'impalcatura biostampata in 3D contenente EV marcate con PKH direttamente sul letto della ferita. Assicurarsi che l'impalcatura copra completamente la superficie della ferita con sacche d'aria minime premendo leggermente con una pinza sterile. Assicurarsi che l'animale sia attentamente osservato dopo la procedura e rimanga assistito fino a quando non ha ripreso completamente conoscenza e può mantenere la decubito sternale.
  2. Imaging fluorescente
    1. A 2 ore, 4 ore, 8 ore, 24 ore dopo l'impianto, anestetizzare i topi usando isoflurano. Per l'induzione dell'anestesia, posizionare i topi nella camera del sistema di imaging in vivo (IVIS) ed esporli al 2%-3% di isoflurano nell'ossigeno. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza. Una volta anestetizzati, trasferire i topi nel sistema IVIS e mantenerli con l'1%-2% di isoflurano in ossigeno erogato attraverso i canali nasali. Verificare che gli animali siano completamente anestetizzati e stabili prima di procedere con l'imaging.
    2. Utilizza il sistema IVIS per catturare i segnali fluorescenti dalle vescicole extracellulari marcate con PKH rilasciate dall'impalcatura. Nella procedura guidata di imaging, selezionare l'opzione Imaging a fluorescenza e attivare i filtri di eccitazione ed emissione per il colorante PKH. Regola le impostazioni della fotocamera, incluso il campo visivo e l'altezza del soggetto, per ottimizzare il rilevamento del segnale. Garantisci un posizionamento coerente in tutti i punti temporali dell'imaging per consentire confronti accurati. Inizia ad acquisire le immagini e salva i dati risultanti.
    3. Quantificare l'intensità del segnale fluorescente utilizzando il software IVIS. Ciò consentirà di monitorare il rilascio di veicoli elettrici nel tempo.

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Results

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Il rilascio in vivo di EV sia dagli scaffold Alg-EVs/CMCh che da Alg-EVs/CMCh-AlgLyase è illustrato nella Figura 1B, C. Come anticipato, l'impalcatura Alg-EVs/CMCh-AlgLyase ha mostrato un profilo di rilascio più rapido rispetto ad Alg-EVs/CMCh, in particolare nei punti temporali di 2 h e 4 h. Il rilascio di vescicole extracellulari dagli idrogel è governato da una combinazione di meccanismi fisico-chimici, tra cui diffusione, rigonfiamento, erosione e degradazione

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un aspetto fondamentale del protocollo è il design dell'impalcatura core-sheath, che è essenziale per ottenere un'erogazione efficiente dei veicoli elettrici. Il design incorpora l'Alg come materiale di base e una combinazione di CMCh con Algliasi come guaina. Questa configurazione facilita il rilascio controllato e rapido dei veicoli elettrici. Il materiale di base, Alg, incapsula i veicoli elettrici, garantendone la protezione e l'erogazione localizzata. La guaina, composta da CMCh e A...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un ringraziamento speciale a Said Al-Hashmi e Abdulrahman Almharbi di Happy Production per il loro eccellente lavoro nelle riprese. Estendiamo inoltre la nostra gratitudine al Ministero dell'Istruzione Superiore, della Ricerca e dell'Innovazione e all'Università di Nizwa per il loro sostegno finanziario e per aver fornito le risorse necessarie.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
23 G Ugello conico di precisione violaCellinkKT0000002000Per fornire un'estrusione precisa di bioink con un intasamento minimo
Alginato liasi (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGAlgyase è un enzima che degrada l'alginato.
Filtro ultra centrifugo Amic, 30 kDa MWCOMerckUFC9030Utilizzato per lavare PKH-26 marcato-EVs
Kit di analisi BCAThermo Scientific10678484Per determinare la concentrazione di proteine/EVs
Sistema di bioprintingRegematV1Per fabbricare l'impalcatura del nucleo della guaina
Albumina sierica bovina (BSA)sigma-aldrich05470-5GPer fermare la reazione PKH 26 
Cloruro di calcioSigma AldrichC3306-100GPer reticolare e stabilizzare i bioink nell'ingegneria tissutale
CentrifugaSigma2-16PUtilizzata per l'isolamento delle vescicole extracellulari
Centrifuga 5810 REppendorf22625101Utilizzata per la coltura cellulare
Cabina di sicurezza biologica di classe IITelstarBio II AdvanceCell Culture
CryoCube  Serie F570 - Congelatore ULTEppendorfF571240035Per conservare il
microscopio a fluorescenzaEV OLYMPUS IX73P1F Utilizzato per controllare il residuo di PKH-26 nel filtrato
Gentamicina (50 mg/mL)Thermofisher15750Antibiotico per terreni di coltura cellulare
GlutaMAX-I CTS, (100X), liquidoThermofisherA12860Integratore di terreni per colture cellulari
HClSigma Aldrich7647-01-0Preparazione del tampone 
HEPESCarl RothArt. No. 6763.3Preparazione del tampone 
La carbossimetilcellulosa ad alta viscosità (CMCh)BDH27929 4TCMCh è un derivato della cellulosa solubile in acqua.
IncubatriceNuovo Brunswick NB-170Rper colture cellulari
PerkinElmerIVIS Lumina XRMS Serie III Per monitorare il rilascio di veicoli elettrici, in vivo
Agitatore magneticoSalvisLABMC35Per la preparazione di Bioinks
Kit di esosomi miRCURY per l'isolamento degli esosomiQiagen76743Isolamento Evs
NaOhDaejung1310-73-2Preparazione del tampone 
soluzione salina tamponata con fosfato(PBS)Thermo ScientificJ61196. APCell Culture:
PKH 26MCE154214-55-8Colorante fluorescente rosso per la marcatura delle EV
Alginato di sodio (Alg)Sigma AldrichA0682-100GPolisaccaride naturale derivato dall'alga bruna.
Cloruro di sodio (NaCl)Carl RothArt-Nr-P029.1Preparazione tampone 
StemPro BM Cellule staminali mesenchimaliThermofisherA1382901Cellule staminali mesenchimali
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501Terreni di coltura cellulare
Tripsina 0,25%Thermofisher25050014Dissociazione cellulare
Vortex-MixerDaihan ScientificVM-10Utilizzato per miscelare il tampone di precipitazione con il terreno condizionato
Imaging in vivo

References

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