Articolo metodologico

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

DOI:

10.3791/67780

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27 dicembre 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, dimostriamo come le cellule epiteliali coltivate con fibroblasti nel sistema a due strati basato su membrana nanofibrosa possano aderire e crescere stabilmente sulla membrana.

Abstract

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Gli ostacoli tecnici in una coltura di cellule epiteliali includono la dedifferenziazione e la perdita di funzione. I metodi di coltura cellulare tridimensionale biomimetica (3D) possono migliorare l'efficienza delle colture cellulari. Questo studio introduce un avanzato sistema di coltura a due strati destinato a coltivare cellule epiteliali come strati simili a tessuti con la coltura di fibroblasti all'interno di un ambiente 3D. Le membrane nanofibrose (NM) di alcol polivinilico (PVA) e poli(ε-caprolattone) (PCL) sono state fabbricate tramite elettrofilatura e utilizzate come matrice extracellulare fisiologicamente rilevante per la coltura di cellule epiteliali e fibroblasti, rispettivamente. Nei pozzetti dell'inserto superiore, le cellule epiteliali polmonari sono state coltivate sul PVA NM e nelle camere inferiori, i fibroblasti sono stati coltivati sul PCL NM. Questa configurazione elimina il contatto diretto cellula-cellula e facilita l'esame della segnalazione paracrina mediata da fattori solubili. La microscopia confocale è stata impiegata per analizzare la distribuzione, il modello di crescita e l'espressione delle proteine intracellulari, comprese le zone occludenti nelle cellule epiteliali. Le tecniche di Z-stacking hanno permesso ricostruzioni 3D dettagliate, fornendo informazioni precise sull'integrità delle giunzioni strette e sull'organizzazione spaziale all'interno dello strato epiteliale. La microscopia elettronica a scansione (SEM) ha valutato le caratteristiche morfologiche dei tipi di cellule sulle membrane nanofibrose. L'imaging SEM ha rivelato intricate strutture della superficie cellulare e interazioni con le nanofibre, offrendo una prospettiva completa sull'architettura cellulare e sull'interazione cellulare con la struttura nanofibrosa. Il test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) è un metodo semplice per misurare i tassi di crescita delle cellule epiteliali e dei fibroblasti nel tempo. Fornisce i comportamenti proliferativi e i potenziali effetti sinergici della cocoltura di queste cellule. Questi risultati evidenziano l'efficacia di un semplice sistema di co-coltura con inserto per la coltura simultanea di fibroblasti e cellule epiteliali, che è cruciale in vari contesti fisiologici e farmacologici, tra cui la rigenerazione del tessuto epiteliale, il microambiente tumorale con cellule endoteliali, immunitarie e altre cellule stromali, il test di tossicità e il test di attività del farmaco.

Introduzione

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Nel corso dei decenni, la classica coltura monostrato bidimensionale (2D) è stata essenziale per comprendere le infezioni, la farmacologia e la tossicologia 1,2. Tuttavia, è importante considerare la complessità, le interazioni dinamiche tra le multicomposizioni e l'architettura tridimensionale (3D) del microambiente tissutale. Pertanto, la coltura cellulare 2D ha dei limiti nell'imitare le strutture simili ai tessuti 3,4. Ad esempio, c'è una mancanza di segnalazione cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare (ECM), che è essenziale per la differenziazione cellulare, la proliferazione e le funzioni cellulari nel microambiente vivo. Per questi motivi, sono stati sviluppati i sistemi di colture cellulari 3D5. Le cellule in coltura 3D crescono e interagiscono con la matrice extracellulare circostante in tre dimensioni. Inoltre, è stato sviluppato un approccio di cocoltura 3D, composto da più di un tipo di cellula, per colmare il divario tra i modelli semplicistici in vitro di tipo a singola cellula e le interazioni cellulari dinamiche che si verificano in vivo6. I sistemi di cocoltura 3D hanno guadagnato popolarità nello studio della comunicazione cellula-cellula e delle interazioni cellula-matrice extracellulare (ECM) 7,8,9,10. Gli attuali sistemi di cocoltura 3D hanno diverse forme e possono essere separati in cocoltura diretta e indiretta 8,9. Nella cocoltura diretta, varie funzioni cellulari nelle cellule in coltura possono essere influenzate principalmente dal contatto diretto piuttosto che dagli effetti paracrini. In confronto, la cocoltura indiretta ha un vantaggio maggiore nello studio dell'interazione paracrina utilizzando barriere o strati per separare diversi tipi di cellule.

Vari materiali e metodi vengono utilizzati per fabbricare scaffold biomimetici che imitano la ECM utilizzando sostanze biocompatibili e biodegradabili10. La struttura dello scaffold nanofibroso imita la configurazione della ECM nativa nei tessuti biologici, fornendo un'architettura 3D per la coltura cellulare11,12. Le membrane nanofibrose (NM) elettrofilate sono state utilizzate in cocoltura diretta e indiretta di diversi tipi di cellule 13,14,15.

Le cellule epiteliali formano una barriera fisica degli organi principali, mentre i fibroblasti sono cellule stromali predominanti che mediano il rimodellamento della ECM e regolano l'epitelio vicino 6,16,17. Le cellule epiteliali e i fibroblasti interagiscono rispettivamente con la laminina nella membrana basale e con la fibronectina nella matrice interstiziale, attraverso i recettori delle integrine sulla superficie cellulare18. Quando le cellule epiteliali vengono coltivate su NM di poli(alcol vinilico) (PVA) con diametri di 150 - 250 nm e micropori, formano multistrati invece di aggregati cellulari e sferoidi e i loro modelli di crescita sono simili a quelli delle cellule del tessuto epiteliale19. In confronto, i NM poli(caprolattone) (PCL) con diametri di 400-1.500 nm e micropori di 10-50 μm forniscono una dimensionalità spaziale simile alla matrice interstiziale per la crescita di fibroblasti in coltura13,14. Grazie alla loro biocompatibilità, le membrane PVA e PCL sono polimeri comunemente usati nell'ingegneria tissutale20,21.

Questo studio introduce un avanzato sistema di coltura a due strati che utilizza NM elettrofilati porosi per coltivare cellule epiteliali come strati simili a tessuti e fibroblasti all'interno di una struttura 3D. Il protocollo può essere suddiviso in cinque fasi chiave: fabbricazione di nanofibre, post-reticolazione delle fibre e valutazione della qualità, preparazione del pozzetto di coltura attaccato alla membrana, semina cellulare e cocoltura 3D e saggi di cellule coltivate in 3D.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabbricazione di nanofibre PVA stabili all'acqua

  1. Pesare 0,02 g di acido poli(acrilico) (PAA) e 1 g di PVA, quindi aggiungerli in una bottiglia di vetro pulita contenente una barra magnetica. Aggiungere 7,8 ml di acqua distillata alla bottiglia, posizionare la bottiglia su un agitatore a piastre e impostare la temperatura a 84 °C, la velocità a 500 giri/min e il tempo a 12 ore.
  2. Lasciare raffreddare il flacone a temperatura ambiente prima di aggiungere 0,2 ml di glutaraldeide (GA). Posizionare la bottiglia sull'agitatore a piastre e impostare la velocità a 500 giri/min, il tempo a 30 minuti e la temperatura a temperatura ambiente.
  3. Utilizzare una siringa da 5 ml per l'elettrofilatura, separare gli stantuffi dai cilindri e pulire i piccoli detriti di plastica all'interno dei cilindri e la punta degli stantuffi.
  4. Utilizzare gli aghi per bloccare il flusso del liquido, quindi versare la soluzione di PVA in ciascun fusto (volume: 2,5-3 ml ciascuno). Montare gli stantuffi, quindi rimuovere gli aghi.
    NOTA: Potrebbe esserci una bolla nella soluzione, quindi attendi che la bolla scompaia. Questo richiede 10-30 minuti.
  5. Assemblare un nuovo ago di metallo da 27 g, quindi inserirlo nell'elettrofilatore.
  6. Avvolgere bene il raccoglitore con un foglio.
  7. Lasciare che il pannello dell'iniettore torni nella posizione originale. Utilizzare le seguenti impostazioni per la macchina: (ogni pompa) volume di iniezione: 2 mL, velocità di iniezione: 6 μL/min, velocità del rullo: 100 giri/min, distanza tra punta e collettore: 14 cm. Controllare il flusso del liquido per ogni pompa.
  8. Far funzionare la macchina con un potenziale elettrico di circa 12 kV.
  9. Assicurarsi che l'umidità sia del 40 - 50% all'inizio e del 25 - 30% alla fine del processo. Utilizzare un umidificatore quando l'umidità diminuisce e posizionare piatti contenenti acqua distillata all'interno della macchina il giorno prima dell'elettrofilatura per aumentare l'umidità.
    NOTA: Questo è un fattore critico per il successo della fabbricazione di nanofibre PVA.
  10. Controllare regolarmente il flusso. Se l'ago è bloccato, arrestare temporaneamente la macchina. Usa una salvietta da laboratorio per rimuovere la goccia e attendi fino a quando non appare la nuova goccia. In caso contrario, cambiare l'ago, quindi continuare a far funzionare la macchina.
  11. Il processo di fabbricazione delle nanofibre PVA richiede ~6 ore per essere completato. Al termine del processo di elettrofilatura, staccare la pellicola contenente il tappetino in fibra dal collettore e conservare il tappetino in nanofibra in essiccante sotto vuoto.

2. Trattamento di una membrana nanofibrosa PVA con vapore di acido cloridrico (HCl) e valutazione della qualità delle fibre

NOTA: La stabilità all'acqua dei PVA NM è ben preservata dopo la reazione di post-reticolazione da parte del vapore di HCl. Questo processo è ottimizzato per lo spessore, la dimensione dei pori e la rugosità adeguati dei NM. Il PVA è un polimero molto idrofilo e le nanofibre PVA elettrofilate sono instabili a contatto con l'acqua e in condizioni di umidità. I PVA NM devono essere trattati con vapore di HCl subito dopo la fabbricazione del polimero PVA.

  1. Tagliare un tappetino in nanofibra in pezzi della dimensione desiderata per l'inserto trans-well.
  2. Preparare un piattino contenente 1,5 ml di HCl puro. Posizionare il piatto contenente HCl e i pezzi di nanofibra all'interno di una camera a vuoto e chiudere il coperchio.
    NOTA: Il vapore di HCl viene utilizzato come agente di reticolazione per rendere la nanofibra stabile all'acqua.
  3. Aprire la valvola collegata alla pompa del vuoto, attendere 10 s fino a quando i fumi di HCl si alzano, quindi chiudere la valvola. Trattare le membrane con fumi HCl per 2 min.
  4. Dopo il trattamento con vapore di HCl, aggiungere alcune gocce di acqua distillata (DW) alle membrane, metterle su un vetrino e rimuovere la membrana dalla lamina. Dopo l'asciugatura all'aria per 20 minuti, le membrane aderiscono naturalmente al vetrino.
  5. Rivestire le membrane su nastro di carbonio con un sottile strato d'oro utilizzando un rivestimento autosputter. Ottenere immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM).
  6. Dopo aver reticolato i PVA NM con HCl, lavarli 3 volte con 1 PBS e controllare il pH dopo averli immersi nei terreni di coltura per confermare l'assenza di HCl residuo.

3. Fabbricazione di nanofibre PCL e valutazione della qualità delle nanofibre

  1. Pesare 1,5 g di PCL e aggiungerlo a una bottiglia di vetro pulita. Aggiungere 8,5 ml di cloroformio al flacone, posizionare il flacone su un agitatore a piastre e sciogliere il PCL nel cloroformio per 12 ore a temperatura ambiente.
  2. Ripetere i passaggi da 1.3 a 1.9, ad eccezione dei passaggi 1.7 e 1.8, impostare la velocità di iniezione a 8 μL/min e la tensione a 17,5 kV.
    NOTA: La fabbricazione del PCL richiede ~3,5 ore per essere completata.
  3. Tagliare un pezzettino della membrana e rivestire i pezzi con il processo di sputtering automatico per 5 minuti. Ottenere immagini SEM.

4. Assemblaggio di due strati di membrane in un pozzo trans

NOTA: In questo protocollo, utilizziamo una piastra a 24 pozzetti e il rispettivo pozzetto di inserimento. Il PVA NM è attaccato al pozzetto dell'inserto, mentre il PCL NM è attaccato al pozzetto inferiore.

  1. Taglia un tappetino in nanofibra in pezzi rotondi, con un diametro di 10 mm e 13 mm rispettivamente per PVA e PCL NM.
  2. Utilizzare il polidimetilsilossano (PDMS) Sylgard 184 come agente adesivo per fissare le membrane all'inserto e al pozzetto della camera. Prima dell'uso, miscelare Sylgard 184 Base (parte A) e l'agente indurente (parte B) in un bicchiere di plastica in un rapporto di massa 10:1. Utilizzare un vetrino pulito per mescolare energicamente la soluzione PDMS per 2-3 minuti fino a quando l'intera miscela non si riempie di bolle. Lasciare che la bolla si formi e scompaia per 10 minuti prima dell'uso; nel frattempo, lasciare che il vetrino si riscaldi a 100 °C.
  3. Stendere il PDMS su un vetrino e immergere leggermente il bordo inferiore dell'inserto nel PDMS. Tenere l'inserto ben capovolto sullo scaldavetrini per consentire l'indurimento del PDMS (~10-15 min). Controllare attentamente con un puntale da 200 μl per assicurarsi che il PDMS non sia appiccicoso.
  4. Trattare i pezzi PVA NM come descritto nei passaggi da 2.2 a 2.4.
  5. Premere delicatamente l'inserto sul pezzo PVA NM in modo che la parte inferiore dell'inserto sia rivolta verso il lato in nanofibra del pezzo di membrana. Aggiungere una goccia di acqua distillata al centro del pozzo e utilizzare una pinza per rimuovere la pellicola. Mettere bene l'inserto in una nuova piastra a 24 pozzetti e lasciare asciugare la membrana.
  6. Quando si attacca bene il pezzo PCL NM al fondo, assicurarsi di immergere la punta da 200 μl nella miscela PDMS e di picchiettarla con precisione ai quattro angoli e al centro.
  7. Posizionare la piastra sullo scaldavetrini e lasciare indurire il PDMS per 5-7 minuti per garantire la qualità dell'assemblaggio.
  8. Inserire il pezzo PCL NM nel pozzetto contenente PDMS, con il lato in nanofibra della membrana attaccato al PDMS. Utilizzare una piccola spazzola pulita per premere leggermente il lato della lamina del pezzo di membrana per un fissaggio completo. Aggiungere 0,2 ml di etanolo al 70% nel pozzetto per rimuovere facilmente la pellicola.
  9. Sterilizzare l'inserto e il pozzetto inferiore nella configurazione a pozzetto sotto la luce UV durante la notte.
    NOTA: Il PDMS miscelato può essere conservato a -20 °C per un ulteriore utilizzo. ATTENZIONE: La piastra attaccata alla membrana nanofibrosa PCL può essere conservata asciutta, ma deve essere bagnata con etanolo al 70% prima dell'uso.
  10. Il giorno successivo, lavare bene l'inserto e il fondo aggiungendo rispettivamente 200 μl e 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x per 3 x 10 minuti. L'inserto e il pozzetto inferiore sono pronti per l'uso.

5. Semina cellulare e assemblaggio di due strati per il modello di cocoltura

NOTA: Le cellule MLE-12 sono state coltivate in 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotico penicillina/streptomicina. Le cellule NIH3T3 sono state coltivate in 1x DMEM ad alto glucosio con il 10% di FBS e l'1% di antibiotico penicillina/streptomicina.

  1. Mantenere le cellule in una piastra di coltura da 150 mm. Quando sono confluenti al 70-80%, lavare le cellule con 10 mL di 1x PBS e tripnizzarle con 2 mL di soluzione preriscaldata di tripsina/EDTA allo 0,05% per 3 minuti a 37 °C.
  2. Picchiettare delicatamente il piatto per rimuovere le cellule dal fondo, quindi aggiungere 8 ml di terreno di coltura completo a ciascun tipo di cellula per neutralizzare l'enzima tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 50 mL, centrifugare a 400 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Colorare le cellule con Cell-Tracker per osservare la distribuzione delle cellule seminate sulla NM (vedere la sezione 6 per maggiori dettagli).
  3. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno DMEM/F12 completo. Determinare il numero di cellule e regolare su 6 × 106 cellule MLE-12/mL e 8 × 105 cellule NIH3T3/mL.
    NOTA: Il terreno DMEM/F12 completo viene utilizzato per la cocoltura con cellule MLE-12 e NIH3T3.
  4. Riempire il pozzetto inferiore con 500 μl di terreno DMEM/F12 completo (il pozzetto senza PCL). Trasferire l'inserto fissato alla membrana nanofibrosa PVA nel pozzetto trans e aggiungere 50 μl di sospensione cellulare MLE-12. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2.
  5. Contemporaneamente, riempire il pozzetto inferiore attaccato alla membrana nanofibrosa PCL con 500 μl di sospensione cellulare NIH3T3 e incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2.
  6. Dopo 2 ore, assemblare l'inserto contenente la cella MLE-12 e il pozzetto inferiore contenente la cella NIH3T3 nella configurazione del pozzetto trans. Questo è il modello di cocoltura con cellule MLE-12 come strato superiore e cellule NIH3T3 come strato inferiore. Cocoltura delle cellule nelle membrane a due strati per il tempo desiderato.

6. Saggio di distribuzione cellulare

  1. Preparare 5 μM di soluzione rossa e verde di Cell-Tracker in un volume totale di 2 mL di terreno DMEM/F12 completo.
  2. Dopo la tripsinizzazione, miscelare le cellule MLE-12 con la soluzione rossa di Cell-Tracker precedentemente preparata e NIH3T3 con la soluzione verde di Cell-Tracker. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti per garantire una marcatura ottimale delle cellule. Aggiungere 8 mL di terreno DMEM/F12 completo ai campioni e centrifugare a 400 × g per 5 minuti.
    NOTA: Cell Tracker non può influenzare la vitalità e la proliferazione cellulare. Quindi le cellule colorate con Cell-Tracker possono essere coltivate fino alla confluenza. L'intensità della fluorescenza nelle cellule colorate potrebbe ridursi 4-5 giorni dopo la coltura.
  3. Ripetere i passaggi da 5.3 a 5.6.
  4. Durante l'osservazione al microscopio confocale, trasferire il pozzetto dell'inserto dalla piastra a 24 pozzetti a una piastra a 12 pozzetti.
    NOTA: Ciò riduce al minimo la distanza tra la lente dell'obiettivo e le cellule, consentendo l'osservazione della morfologia cellulare.

7. Osservazioni confocali di cellule cocoltivate in 3D

NOTA: L'attacco delle cellule epiteliali a un PVA NM è debole rispetto a quello dei fibroblasti a un PCL NM. Eliminare manualmente i vecchi terreni mediante aspirazione con pipette e aggiungere delicatamente nuovi terreni o soluzioni alla parete dei pozzetti. Durante il processo di colorazione, cerca di non lasciare asciugare le membrane.

NOTA: L'adesione cellulare può essere migliorata rivestendo la laminina o incorporando peptidi di motivi leganti le integrine nelle nanofibre PVA19.

  1. Trasferire l'inserto su una nuova piastra a 24 pozzetti. Scartare il vecchio terreno e aggiungere 150 μl di una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere la soluzione di PFA al 4% e lavare le cellule aderenti con 150 μl di 1x PBS.
  3. Per il blocco e la permeabilizzazione, aggiungere 150 μl di siero di capra normale al 5% e Triton X-100 allo 0,2% diluito in 1x PBS e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  4. Preparare gli occludens anti-zona coniugati Alexa Fluor 594 Ab (1:400) e Phalloidin-iFlour 488 (1:1.000) diluendoli nel reagente diluente anticorpale. Rimuovere la soluzione bloccante, aggiungere 150 μl di soluzione di fluoroforo per pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: Preparare le soluzioni anticorpali con la massima precisione, poiché ciò avrà un impatto diretto sulla qualità dei risultati. Evitare l'esposizione alla luce.
  5. Scartare la soluzione di anticorpi e lavare le cellule con 150 μL di 1x PBS per 10 minuti.
  6. Aggiungere 150 μl di Hoechst 33342 diluito in 1x PBS (1:1.000) e incubare per 10 minuti; Evitare l'esposizione alla luce.
  7. Rimuovere la soluzione Hoechst 33342 e lavare le cellule aderenti con 150 μl di 1x PBS per 10 minuti.
  8. Preparare un vetrino pulito e aggiungere una quantità precisa di gel di montaggio acquoso. Utilizzare una pinza con punte appuntite per staccare delicatamente le membrane dal bordo circostante. Posizionare le membrane sul gel di montaggio, assicurandosi che il lato contenente le cellule sia rivolto verso l'alto. Aggiungere una quantità precisa di gel di montaggio e coprire con un vetrino di copertura. Sigillare i vetrini con lo smalto, garantendo una tenuta precisa e completa.
  9. Osservare le cellule al microscopio confocale utilizzando le seguenti impostazioni di imaging: Controllo della potenza del laser: 405 Intensità 10; Controllo della potenza del laser: 488 Intensità 10; Controllo della potenza del laser: 561 Intensità 10; Sensibilità del rivelatore: 420LP (valore 600); Sensibilità del rivelatore: 525/50 (valore 700); Sensibilità del rivelatore: 561LP (valore 750).

8. Saggio dell'attaccamento cellulare alle nanofibre

  1. Scartare il vecchio terreno e lavare le celle con 150 μl di 1x PBS.
  2. Fissare le celle con 150 μL di GA al 3% diluito in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
  3. Lavare le celle con 150 μL di 1x PBS in 10 minuti.
  4. Fissare le cellule secondariamente aggiungendo 150 μl di tetrossido di osmio all'1% (OsO4) diluito in 1x PBS per 1 ora.
    ATTENZIONE: OsO4 e il suo vapore sono dannosi. Deve essere utilizzato in una cappa aspirante.
  5. Scartare la soluzione e lavare le celle con 300 μL di 1x PBS per 2 x 10 minuti.
  6. Disidratare le cellule con etanolo graduato dal 50%, 70%, 90% e 95% al 100%, per 10 minuti in ogni passaggio. Eseguire l'ultimo passaggio di disidratazione aggiungendo etanolo fresco al 100% per 10 minuti.
  7. Asciugare completamente le cellule e le membrane all'aria. Utilizzare una pinza con le punte appuntite per staccare le membrane e posizionare le membrane sul portacampioni utilizzando un rubinetto su due lati. Eseguire lo ion-sputtering per 5 minuti prima di osservare le celle sotto SEM con un ingrandimento di 2.000x.

9. Saggio di crescita cellulare

NOTA: In questo protocollo, il test CCK-8 viene utilizzato per quantificare il tasso di crescita cellulare seguendo le istruzioni del produttore.

  1. Preparare la miscela CCK-8 mescolando 9 parti di DMEM/F12 preriscaldato (in volume) con 1 parte del reagente CCK-8. Dopo aver rimosso i vecchi terreni di coltura, aggiungere 150 μl della miscela CCK-8 al pozzetto contenente le cellule.
  2. Trasferire l'inserto nella nuova piastra a 24 pozzetti per separarla dal pozzetto inferiore contenente le celle. Incubare le cellule per 45 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
  3. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL. Centrifugare a 1.800 × g per 3 min.
  4. Aggiungere 100 μl di surnatante dalla provetta per microcentrifuga alla piastra a 96 pozzetti. Leggere la densità ottica (OD) a 450 nm.

Risultati

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Questo protocollo delinea i passaggi critici per la cocoltura di cellule epiteliali polmonari MLE-12 e fibroblasti NIH3T3 costruendo un modello a due strati basato su membrana nanofibrosa (Figura 1). Questo modello è adatto all'imaging di cellule vive, all'immunoistochimica e all'analisi quantitativa degli endpoint delle cellule in cocoltura. Altri tipi di cellule possono essere utilizzati ottimizzando la densità cellulare e le condizioni di crescita.

Il SEM mostra la distribuzione uniforme delle nanofibre PVA fabbricate senza alcuna formazione di perline (Figura 2A). Il diametro delle nanofibre PVA variava da 150 nm a 230 nm (180 ± 25 nm, media ± deviazione standard (SD)). Le nanofibre nei PCL NM elettrofilati erano orientate in modo casuale e assomigliavano strutturalmente al collagene (Figura 2B). La maggior parte delle fibre nei PCL NM aveva un diametro compreso tra 300 nm e 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Pertanto, la membrana nanofibrosa PVA aveva pori di dimensioni inferiori rispetto alla membrana nanofibrosa PCL.

Prima della semina, le cellule MLE-12 e NIH3T3 sono state colorate rispettivamente con Cell-Tracker rosso e verde e sono state monitorate durante tutto il processo di cocoltura. Come mostrato nella Figura 3, è stato possibile osservare distintamente la distribuzione spaziale delle cellule MLE-12 nella camera di inserimento e delle cellule NIH3T3 nella camera inferiore. L'analisi del focus-stacking ha rivelato che le cellule NIH3T3 sono state disperse e rilevate a profondità variabili (102 ± 20 μm), mentre le cellule MLE-12 hanno formato strati con uno spessore di 80 ± 10 μm. Il SEM mostra l'attaccamento delle cellule alle membrane. Le cellule NIH3T3 si infiltrano nella membrana nanofibrosa del PCL e si estendono lungo gli assi delle nanofibre, mentre le cellule MLE-12 hanno aderito alla superficie della membrana nanofibrosa PVA e hanno mostrato un'aggregazione (Figura 4). Successivamente, abbiamo esaminato l'organizzazione citoscheletrica delle cellule NIH3T3 e delle cellule MLE-12 mediante colorazione con actina. Le cellule NIH3T3 coltivate su membrana nanofibrosa PCL mostrano una distribuzione a proiettile di filamenti di actina simili alle cellule nei tessuti, e la colorazione con actina nelle cellule MLE-12 coltivate su membrana nanofibrosa PVA mostra aggregati rotondi senza diffusione cellulare (Figura 5).

Sono stati confrontati la distribuzione e il modello di crescita delle cellule MLE-12 in monocoltura e cocoltura. Le cellule colorate in rosso con Cell-Tracker in monocoltura sui PVA NM hanno formato aggregati, ma le cellule in condizione di cocoltura hanno mantenuto una distribuzione uniforme sulla membrana (Figura 6A). In un'analisi 3D di immagini di microscopia confocale, il modello di crescita delle cellule MLE-12 cocoltivate sui PVA NM mostra un'adesione stratificata delle cellule coltivate alla membrana con una densità cellulare più confluente, rispetto alle cellule coltivate in assenza di fibroblasti (Figura 6B). Inoltre, l'adesione cellula-cellula e l'espressione dell'occludina zonale (ZO)-1 sulle superfici cellulari (freccia indicata), ma non degli aggregati cellulari, erano più evidenti nella condizione di cocoltura rispetto alla coltura senza fibroblasti (Figura 6C).

La proliferazione delle cellule sulle membrane è stata misurata utilizzando il test CCK-8. La proliferazione delle cellule NIH3T3 e MLE-12 è aumentata nel tempo (Figura 7). Tuttavia, sono stati osservati tassi di crescita delle cellule inferiori sulle membrane rispetto a una piastra di coltura (dati non mostrati). Le cellule NIH3T3 e MLE-12 cocoltivate su NM mostrano un tasso di crescita stabile rispetto alle cellule monocoltivate in una piastra di coltura.

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Figura 1: Schema per illustrare il metodo di co-coltura di fibroblasti NIH3T3 e cellule epiteliali MLE-12 nel sistema a due strati basato su scaffold. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Struttura delle nanofibre di PVA e PCL. (A) Le membrane nanofibrose di PVA e (B) PCL sono state prodotte mediante elettrofilatura. La struttura e il diametro delle nanofibre sono misurati mediante SEM delle superfici della membrana. Barre di scala = 1 μm (A), 10 μm (B). Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: In un sistema di cocoltura, la distribuzione spaziale delle cellule NIH3T3 sulla membrana nanofibrosa PCL e delle cellule MLE-12 sulla membrana nanofibrosa PVA. Le cellule NIH3T3 (4 × 105) sono state colorate con Cell-Tracker Green e le cellule MLE-12 (3 × 105) sono state colorate con Cell-Tracker Red. Le cellule seminate sono state coltivate per 24 ore e osservate utilizzando un'immagine Z-stacking di un microscopio confocale. I numeri sono indicati in μm; Le frecce mostrano le dimensioni con X (larghezza), Y (lunghezza), Z (profondità). Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Adesione e morfologia delle cellule NIH3T3 su membrana nanofibrosa PCL e delle cellule MLE-12 su membrana nanofibrosa PVA. Le cellule sono state coltivate sulle membrane per 24 ore e osservate utilizzando il SEM con un ingrandimento di 2.000x. Barre di scala = 15 μm. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Fibre di stress di actina in cellule NIH3T3 su membrana nanofibrosa PCL e cellule MLE-12 su membrana nanofibrosa PVA. Le cellule NIH3T3 (4 × 105) e le cellule MLE-12 (3 × 105 cellule) sono state seminate rispettivamente sulle membrane nanofibrose PCL e PVA. Dopo 48 ore di coltura, le cellule sono state colorate con falloidina-iFlour 488 e osservate mediante microscopia confocale. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico; PCL = poli(ε-caprolattone); FITC = isotiocianato di fluoresceina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Modello di crescita di cellule MLE-12 cocoltivate su membrana nanofibrosa PVA. (A) Le cellule MLE-12 colorate in rosso Cell-Tracker (3 × 105 cellule) sono state seminate sulla membrana nanofibrosa PVA e coltivate da sole (cellule -NIH3T3) e con cellule NIH3T3 in un sistema a due strati (+cellule NIH3T3) per 48 ore. (B) Le cellule MLE-12 monocoltivate e cocoltivate per 48 ore sono state colorate con Hoechst 33342 (blu) e Phalloidin-iFlour 488 e osservate utilizzando un microscopio confocale. Le immagini 3D vengono visualizzate utilizzando la funzione di superficie del software Imaris. (C) Le cellule MLE-12 sono state coltivate per 48 ore e marcate in fluorescenza con Phalloidin-iFlour 488 e anticorpo anti-ZO-1 (rosso). Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: PVA = alcool polivinilico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Tasso di crescita delle cellule in un sistema di cocoltura a due strati. Le cellule NIH3T3 (4 × 105) e le cellule MLE-12 (3 × 105) vengono cocoltivate per il tempo indicato. La crescita cellulare nell'inserto e nel pozzetto inferiore viene misurata utilizzando il saggio CCK-8. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Il passaggio dalla coltura 2D ai modelli di coltura 3D rappresenta un progresso significativo nello sviluppo di modelli di cocoltura in vitro . Un modello di coltura 3D deve imitare il microambiente tissutale in cui le cellule possono proliferare, aggregarsi e differenziarsi22. L'uso di modelli di cocoltura 3D basati su scaffold migliora la replicazione dell'architettura tissutale. In questo studio, un sistema trans-well basato su NM fornisce una cocoltura 3D indiretta di due tipi di cellule. Il PCL NM con grandi pori nella camera inferiore consente l'infiltrazione cellulare e imita la matrice interstiziale. Questa impalcatura supporta la crescita e l'organizzazione spaziale dei fibroblasti. L'utilizzo di una membrana nanofibrosa PVA nella camera superiore consente la formazione di cellule epiteliali MLE-12 nello strato. Il diametro e la dimensione dei pori della membrana nanofibrosa PVA la rendono un substrato ideale per sostenere l'adesione e la crescita delle cellule epiteliali, che imita le cellule epiteliali sulla membrana basale nei tessuti epiteliali19.

Le proteine adesive alle cellule, come la fibronectina e la laminina, sono proteine chiave nella MEC, che collegano le cellule con le fibrille di collagene23. Le cellule epiteliali interagiscono con la laminina attraverso i recettori delle integrine sulla loro superficie18. Le cellule MLE-12 seminate sui PVA NM hanno aderito e sono cresciute tridimensionalmente sulla membrana. Tuttavia, il legame delle cellule epiteliali con il PVA NM poroso era basso, con conseguente aggregazione perché mancano di motivi biologici specifici che interagiscono con le cellule in coltura. Nel nostro sistema di cocoltura, il contatto diretto cellula-cellula tra le cellule NIH3T3 e MLE-12 è assente e la comunicazione avviene esclusivamente attraverso la segnalazione paracrina. La presenza di cellule NIH3T3 cocoltivate può stabilizzare l'adesione delle cellule MLE-12 alla membrana durante il periodo di coltura. Questa stabilizzazione può essere attribuita alla secrezione di fattori solubili da parte dei fibroblasti, tra cui collagene, fibronectina, laminina e vari fattori di crescita24. In confronto, in un modello tumorale con cocoltura diretta di fibroblasti e cellule tumorali in uno scaffold nanofibroso PCL, i fibroblasti alterano le proprietà della ECM attraverso il rimodellamento della matrice25.

Le cellule epiteliali poggiano su una membrana basale che funge da supporto alla crescita e strato selettivamente permeabile. Diverse strategie tecnologiche, tra cui la tecnologia degli organoidi, sono attualmente in fase di sviluppo per creare modelli complessi 3D di tessuti epiteliali26. Tuttavia, la struttura degli organoidi ostacola l'uso dei saggi convenzionali27. Inoltre, la microscopia convenzionale per la raccolta di dati sperimentali è complicata dal fatto che gli organoidi vengono coltivati mentre sono incorporati in una matrice di idrogel 3D27. In questo studio, la camera di inserimento è stata separata dalla camera bassa per facilitare l'osservazione precisa delle cellule epiteliali coltivate su PVA NM. Inoltre, gli organoidi 3D sono prodotti dalla differenziazione di cellule staminali. Pertanto, la coltura di cellule staminali richiede molto tempo ed è una procedura complessa rispetto a un sistema di cocoltura, e l'eterogeneità degli organoidi è riportata28.

Rispetto alla monocoltura, la cocoltura di cellule epiteliali e fibroblasti migliora l'adesione allo scaffold e mantiene stabile la crescita e la funzione delle cellule epiteliali in coltura. Inoltre, non sono necessari materiali supplementari, compresi i fattori di crescita e le citochine, nel terreno di coltura a causa dei fattori solubili secreti dai fibroblasti in cocoltura. Nonostante i vantaggi dell'utilizzo di scaffold nanofibrosi nella cocoltura cellulare fornendo supporto strutturale, non possono fornire ECM che circondano le cellule di coltura rispetto agli idrogel biocompatibili29. Pertanto, questa limitazione può essere ottenuta utilizzando cellule su NM con idrogel sovrastratificati.

In conclusione, un semplice sistema di co-coltura con inserto per la coltura simultanea di fibroblasti e cellule epiteliali è fondamentale in vari contesti fisiologici e farmacologici, tra cui la rigenerazione del tessuto epiteliale, il microambiente tumorale, il test di tossicità e il test di attività farmacologica. Un sistema di cocoltura 3D basato su membrana nanofibrosa sarà strumentato e progettato per studi di screening dell'assorbimento e del trasporto di farmaci ad alto rendimento.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (HR16C0001); il progetto di miglioramento delle capacità di ricerca scientifica di base attraverso la sovvenzione del Korea Basic Science Institute (National Research Facilities and Equipment Center) finanziata dal Ministero dell'Istruzione (2019R1A6C1010003); e sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (MSIT) (2022R1A4A5032702).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina/EDTAWelgeneLS015-01
100x Penicilina/StreptomicinaGibco10378016
20x PBSSoluzione LPSCBP007A
4% ParaformaldeideBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 coniugato ZO-1 AnticorpoInvitrogen339194
Diluente per anticorpi OP QuantoEpredia10129-576
Kit di analisi CCK-8DonginbioCCK-3000
Piastra per colture cellulari (150x20)SPL20151
CellTracker Verde CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Rosso CMTPXInvitrogenC34552
CloroformioSamchunC0584
Tubo conicoSPL50050
Coperchio in vetroCorningCLS2980245
DMEM ad alto glucosioWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Basi essiccatore con flangia piana, filettaturaDWK Life Sciences 7.022 260
DURAN Coperchio essiccatore in vetro e RubinettoDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Rubinetto, con mandrino in PTFEDWK Life Sciences 
ElettrofilatoioNanoNCESR200RD
Alcool etilico, PuroSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Modulo scanner confocale laser a fluorescenza K1-fluoNanoscope Systems
Gel/mountBiomeda Corp.M01
Soluzione di glutaraldeideSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Ugello metallico 27GNanoNC
Smalto per unghieNature republic
Siero di capra normaleVector LaboratoriesS-1000
Tetrossido di osmioSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Blocco Syringe_Lure plastica (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poly (acido acrilico)Sigma Aldrich323667
Poly (alcol vinilico)Sigma Aldrich341584
PolycaprolattoneSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Microscopia elettronica a scansioneSECSNE-4500M
Vetrinoscorrevole Marienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
Synergy H1 Lettore multimodaleBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

Riferimenti

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