Un'operazione semplificata per il modello murino di perforazione endovascolare dell'emorragia subaracnoidea

Sommario

Qui presentiamo un'operazione semplificata per il modello murino di perforazione endovascolare di emorragia subaracnoidea combinato con il punteggio neurologico.

Abstract

Il modello di perforazione endovascolare è comunemente utilizzato come metodo per simulare l'emorragia subaracnoidea (SAH) negli studi sperimentali. Completo e affidabile com'è, richiede tecniche complicate. Questo protocollo semplifica il modello in alcuni dettagli, combinato con il punteggio neurologico. Utilizziamo una sutura di nylon per avvolgere e tirare l'arteria carotide comune (CCA) per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno in modo diverso dalla legatura tradizionale, che offre un campo operatorio chiaro. L'utilizzo della penna per elettrocauterizzazione per fondere i vasi sanguigni riduce il rischio di sanguinamento. Inoltre, utilizziamo un filamento con un segno nero per facilitare la determinazione della profondità della puntura.

L'avanzamento senza ostacoli del marcatore nero oltre la biforcazione carotidea, dove l'arteria carotide comune (CCA) diverge nell'arteria carotide interna (ICA), accompagnato da una resistenza minima, indica che il filamento ha attraversato con successo la giunzione intracranica dell'arteria cerebrale anteriore (ACA) e dell'arteria cerebrale media (MCA). Questo fenomeno indica il posizionamento del filamento in un punto critico di convergenza cerebrovascolare. Quindi, l'avanzamento leggero del filamento in avanti per perforare il vaso sanguigno consente un'operazione più semplice per la perforazione endovascolare nei topi, facilitando così l'applicazione del modello di perforazione endovascolare nei topi geneticamente modificati. Questo può essere molto cruciale per la ricerca molecolare e la ricerca e lo sviluppo farmaceutico.

Introduzione

L'emorragia subaracnoidea (SAH), un grave sottotipo di ictus, è collegata ad alti tassi di morbilità e mortalità, che colpisce soprattutto le persone di circa cinquant'anni. L'ASH spontanea è causata principalmente dalla rottura di aneurismi intracranici, che si verifica prevalentemente nel circolo di Willis ^1,2. Clinicamente, i pazienti presentano spesso mal di testa a rombo di tuono, disfunzione neurologica e un rapido declino della coscienza³. Nonostante i progressi nella terapia neurocritica, quasi il 40% dei pazienti muore entro un mese dall'emorragia⁴. Diverse complicanze secondarie possono verificarsi dopo l'ASH aneurismatica, che porta a un progressivo deterioramento neurologico. Tuttavia, la fisiopatologia e le caratteristiche cliniche della SAH sono ancora poco comprese.

Pertanto, per comprendere meglio i meccanismi sottostanti e migliorare le strategie terapeutiche, sono indispensabili modelli completi e affidabili nei piccoli animali. Ad oggi, sono stati proposti numerosi protocolli per stabilire modelli di SAH. Ad esempio, un approccio prevede l'iniezione di sangue autologo nella cisterna magna. Un altro protocollo modificato prevede due iniezioni separate, una nella cisterna magna e l'altra nella cisterna del chiasma ottico. L'iniezione di sangue autologo ha guadagnato un'ampia adozione grazie alla sua semplicità tecnica e al tasso di mortalità favorevole ^5,6. Per ottenere la possibilità di utilizzare un animale da laboratorio più piccolo e meno costoso, Barry et al. hanno descritto il primo modello di SAH sui ratti nel 1979 che prevedeva la perforazione dell'arteria basilare con microelettrodi di tungsteno dopo la rimozione del cranio⁷.

Nel 1995 è stato presentato un altro modello di perforazione endovascolare, una versione modificata del modello di ischemia cerebrale di Zea-Longa, la cui forma attuale si è poi rivelata il modello più comunemente usato per studiare la SAH⁸. Ricerche precedenti hanno dimostrato che i topi e gli esseri umani possiedono una struttura vascolare intracranica simile, denominata circolo di Willis, dove si verifica prevalentemente l'aneurisma intracranico⁹. Questo metodo non craniotomico replica i meccanismi di rottura dell'aneurisma umano attraverso una precisa perforazione della biforcazione ICA¹⁰. Inoltre, il topo geneticamente modificato è spesso utilizzato nello studio dei meccanismi molecolari. Tuttavia, a causa delle sue complicate tecniche nei piccoli animali, il modello di perforazione endovascolare è utilizzato prevalentemente nei ratti o nei conigli, mentre la sua applicazione nei topi è relativamente meno comune. Pertanto, è di grande importanza semplificare il modello murino di perforazione endovascolare e ridurre il suo alto tasso di mortalità.

Qui, presentiamo una modifica semplificata del modello murino di perforazione endovascolare, integrando una versione modificata della scala di valutazione neurologica^{Garcia 11}. La nostra modifica fornisce un modello facile, conveniente e affidabile per futuri studi sperimentali di SAH.

Protocollo

Topi maschi C57BL/6 (6-8 settimane di età), privi di patogeni specifici, sono stati tenuti in una struttura per animali con temperatura e condizioni di acclimatazione regolate, mantenute su un ciclo luce/buio di 12 ore. Ai topi è stato fornito l'accesso illimitato a una dieta standard per roditori e acqua del rubinetto sterilizzata. È stato concesso un periodo di acclimatazione di 2 settimane prima dell'inizio degli esperimenti. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato etico per gli animali dell'ospedale di Longhua e condotte in conformità con le linee guida del Comitato nazionale per la scienza e la tecnologia della Cina per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Preparazione degli animali

1. Posizionare il mouse su un termoforo preriscaldato a 37 °C e continuare a mantenere questa temperatura fino al completamento dell'intervento.
2. Anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano al 2-2,5%. Mantenere con isoflurano all'1-1,5% durante l'operazione a una portata di 0,4-0,6 L/min.
3. Posizionare il mouse sul tavolo operatorio, stabilizzare la testa, mantenerlo in posizione supina e fissare gli arti con del nastro adesivo.

2. Induzione SAH

1. Incidere la pelle con un paio di forbici lungo il centro del collo anteriore (Figura 1A).
2. Sezionare il tessuto connettivo ed esporre l'arteria carotide comune sinistra (CCA) e le sue biforcazioni.
   NOTA: Proteggere con cautela il nervo vago e le ghiandole adiacenti (Figura 1B).
3. Avvolgere il CCA con una sutura di nylon 6-0 e lasciare libere le due estremità senza legatura (Figura 1C).
4. Collegare entrambe le estremità della sutura al nastro e tirare delicatamente la sutura verso il basso e verso destra con un angolo di 45° rispetto al piano orizzontale. Fissare il nastro al tavolo operatorio per bloccare temporaneamente il CCA (Figura 1D).
   NOTA: Quando il flusso sanguigno all'interno del vaso occluso diventa filiforme, indica che l'occlusione è riuscita.
5. Legare l'arteria carotide esterna (ECA) con una sutura di nylon (Figura 1E).
   NOTA: Il sito di cauterizzazione deve essere il più vicino possibile all'estremità superiore, con una lunghezza di circa 2 mm dalla biforcazione carotidea.
6. Fondere l'ECA distale al sito di legatura utilizzando una penna per elettrocauterizzazione (Figura 1F).
7. Tirare lentamente l'ECA verso il basso fino a quando l'arteria carotide interna (ICA) non è esposta. Allineare l'ECA e l'ICA in linea retta, assicurandosi della posizione corretta per la procedura successiva (Figura 1G).
8. Affila la parte superiore del filamento. Un punto di marcatura sul filamento si trova a 8 mm dall'alto.
9. Praticare una piccola incisione con le forbici per l'inserimento del filamento nell'ECA. Inserire il filamento utilizzando un paio di pinze (Figura 1H).
10. Far avanzare il filamento con cautela con una pinza fino a quando il segno nero non passa completamente attraverso la biforcazione di CCA e ICA. Avanzare leggermente di 2 mm per perforare il vaso sanguigno (Figura 1I).
    NOTA: Si avverte una resistenza significativa, che indica che è stata raggiunta la biforcazione dell'arteria cerebrale anteriore (ACA)-arteria cerebrale media (MCA).
11. Ritrarre il filamento immediatamente dopo la perforazione.
12. Fondere l'ECA utilizzando una penna per elettrocauterizzazione (Figura 1J).
13. Rimuovere il nastro e rimuovere la sutura di nylon del CCA per ripristinare il flusso sanguigno. Osservare l'evidente pulsazione del CCA (Figura 1K).
14. Chiudere l'incisione del collo con suture riassorbibili 5-0.

3. Gruppo fittizio

1. Nel gruppo sham, eseguire la stessa operazione chirurgica tranne per il fatto che il filamento viene fatto avanzare parzialmente nell'ICA e ritirato senza perforare¹².

4. Fine dell'esperimento

1. Ventiquattro ore dopo l'intervento, valutare le prestazioni neurologiche secondo la versione modificata del sistema di punteggio riportato da Sugawara et ^al.11 (dall'originale Garcia et ^al.13). Eseguire le seguenti sei valutazioni in cieco: attività spontanea, movimento di tutti gli arti, movimento degli arti anteriori, arrampicata sulla parete della gabbia metallica, risposta al tocco su entrambi i lati del tronco e reazione alla stimolazione delle vibrisse. Valutare la funzione neurologica utilizzando la tabella di punteggio del comportamento (Tabella 1).
2. Anestetizzare il topo con isoflurano inalato. Posizionare il mouse in posizione supina e fissarlo al tavolo operatorio con del nastro adesivo, fissandone gli arti. Quindi, usa le forbici per praticare un'incisione lungo la linea mediana dell'addome, tagliare la parete addominale ed esporre la cavità toracica. Tagliare con cura lo sterno per esporre il cuore.
3. Inserire con cautela un ago per infusione nel ventricolo sinistro, assicurandosi che l'ago sia stabile e non penetri nel cuore.
4. Iniziare la perfusione con 1x PBS (4 °C) preraffreddato a una velocità di flusso appropriata (circa 10 mL/min) fino a quando il liquido in uscita diventa limpido e trasparente, indicando che il sangue è stato completamente sostituito.
5. Una volta completata la perfusione, rimuovere l'ago per infusione e interrompere l'infusione del fluido. Procedere con la raccolta del tessuto cerebrale.

5. Gestione postoperatoria

1. Quando si chiude la pelle, somministrare un'iniezione intramuscolare di lornoxicam per alleviare il dolore dei topi.
2. Durante l'intervento chirurgico, applicare unguento oculare all'eritromicina su entrambi gli occhi per migliorare la secchezza degli occhi.
3. Dopo l'intervento chirurgico, in base alla quantità di sangue perso durante il processo chirurgico, iniettare 0,2-0,4 ml di soluzione fisiologica nel topo per via intraperitoneale per la sostituzione del fluido.
4. Iniettare per via intramuscolare la penicillina alla dose di 40.000 unità al giorno per 3 giorni consecutivi per prevenire l'infezione.
5. Controllare regolarmente la respirazione spontanea degli animali durante le prime ore dopo l'intervento chirurgico e monitorare due volte al giorno gli endpoint umani predefiniti. Sopprimere immediatamente i topi con CO₂ se si riscontra che hanno problemi respiratori causati dall'intervento chirurgico o soddisfano qualsiasi endpoint, tra cui una perdita di peso del >20% rispetto al basale, incapacità prolungata di accedere a cibo/acqua o gravi deficit neurologici.
   NOTA: L'animale non viene lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubita sternale e non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.

Risultati

Punteggi neurologici
Nove topi di ciascun gruppo sono stati valutati 24 ore dopo l'intervento utilizzando una modifica del sistema di punteggio riportato da Sugawara et ^al.11 per valutare la SAH. Il punteggio massimo ottenibile è 18. Tra questi, n = 9 animali nel gruppo fittizio hanno tutti ottenuto un punteggio di 18. Nel gruppo SAH, il punteggio medio è stato di 11 (p < 0,0001) (Figura 2).

Cambiamenti patolo...

Discussione

Per concludere, questo studio presenta un modello murino semplificato e affidabile di emorragia subaracnoidea (SAH) indotta dall'inserimento di filamenti endovascolari, offrendo un approccio conveniente ed efficace. Rispetto al modello di perforazione endovascolare esistente, questo protocollo è lo stesso nella fase di perforazione: il filamento viene introdotto nell'arteria carotide esterna (ECA), fatto avanzare attraverso l'arteria carotide comune (CCA) e successivamente diretto nell'a...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL/6 mouse	Shanghai Jiesjie Laboratory Animal Co., LTD
penna per elettrocauterizzazione	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Adatto per l'uso in piccoli interventi chirurgici superficiali, coagulazione dei tessuti e cauterizzazione della vegetazione.
isofluranza	RWD	R650-IE	è un anestetico generale per via inalatoria. Ha un piccolo coefficiente di ripartizione sangue/gas. Se utilizzato per l'anestesia animale, può indurre l'anestesia in modo fluido, rapido e confortevole, con un rapido recupero, un buon rilassamento muscolare e nessun effetto eccitatorio sul sistema nervoso simpatico. Il tasso metabolico dell'isoflurano nel fegato è basso, quindi ha poca tossicità per il fegato e non ci sono effetti collaterali evidenti anche con l'uso ripetuto. Per evitare gli effetti negativi dei gas di scarico anestetici sull'ambiente e sul personale di laboratorio, si consiglia di utilizzarlo insieme a un sistema di recupero del gas.
Filamento MACO	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	Utilizzato principalmente per topi di peso compreso tra 20 e 25 g, la punta di sutura viene fusa in una forma emisferica, senza rivestimento in polilisina o silicone, contrassegnata a 9-10 mm di distanza dalla punta, disinfettata e può essere utilizzata direttamente. Questo modello ha tre specifiche di imballaggio. Si consiglia di condurre un pre-esperimento prima dell'esperimento formale per determinare il modello appropriato.
microscopio	Olympus	BX61VS	Un microscopio verticale completamente motorizzato dotato del sistema ottico UIS2, progettato per l'imaging ad alta risoluzione e ad alta precisione. Le caratteristiche includono portaoggetti, tavolino e messa a fuoco motorizzati, nonché funzionalità di vetrino virtuale per la creazione di immagini digitali di grandi dimensioni e ad alta risoluzione di campioni. Adatto per applicazioni di ricerca avanzate in patologia, biologia cellulare, neuroscienze e scienza dei materiali.
sutura in nylon	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	Una sutura chirurgica non assorbibile realizzata con materiali biocompatibili ad alta resistenza.

L'isoflurano