Articolo metodologico

Estrazione del modulo di Young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica

DOI:

10.3791/67784

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31 gennaio 2025

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1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo visualizza come preparare criosezioni di tessuto polmonare murino, eseguire esperimenti di mappa della forza di microscopia a forza atomica e analizzare i dati per determinare il modulo di Young della membrana basale polmonare murina nativa.

Abstract

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La microscopia a forza atomica (AFM) consente la caratterizzazione delle proprietà meccaniche di un campione con una risoluzione spaziale di diverse decine di nanometri. Poiché le cellule dei mammiferi percepiscono e reagiscono ai meccanismi del loro microambiente immediato, la caratterizzazione delle proprietà biomeccaniche dei tessuti con un'elevata risoluzione spaziale è fondamentale per comprendere vari processi di sviluppo, omeostatici e patologici. La membrana basale (BM), una sottostruttura di matrice extracellulare (ECM) sottile circa 100-400 nm, svolge un ruolo significativo nella progressione tumorale e nella formazione di metastasi. Sebbene determinare il modulo di Young di una sottostruttura ECM così sottile sia impegnativo, i dati biomeccanici del midollo osseo forniscono nuove informazioni fondamentali su come il midollo corporeo influisce sul comportamento cellulare e, inoltre, offrono un prezioso potenziale diagnostico. Qui, presentiamo un protocollo visualizzato per valutare la meccanica del midollo osseo nel tessuto polmonare murino, che è uno dei principali organi soggetti a metastasi. Descriviamo un flusso di lavoro efficiente per determinare il modulo di Young del midollo osseo, che si trova tra gli strati di cellule endoteliali ed epiteliali nel tessuto polmonare. Le istruzioni dettagliate comprendono il congelamento del tessuto polmonare murino, la criosezione e la registrazione della mappa di forza AFM su sezioni di tessuto. Inoltre, forniamo una procedura di analisi dei dati semi-automatica utilizzando il CANTER Processing Toolbox, un software di analisi dei dati AFM di facile utilizzo sviluppato internamente. Questo strumento consente il caricamento automatico delle mappe di forza registrate, la conversione delle curve di forza rispetto a quelle di piezo-estensione in curve di forza rispetto all'indentazione, il calcolo dei moduli di Young e la generazione di mappe del modulo di Young. Infine, mostra come determinare e isolare i valori del modulo di Young derivati dal midollo osseo polmonare attraverso l'uso di uno strumento di filtraggio spaziale.

Introduzione

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Le mappe di forza AFM sono emerse come una tecnica ampiamente utilizzata per determinare le proprietà nanomeccaniche di una gamma diversificata di campioni biologici con risoluzione spaziale nanometrica e sensibilità alla forza di piconewton 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . La ricerca pionieristica sull'applicazione delle misure AFM a campioni biologici in condizioni fisiologiche è stata condotta da P. Hansma e colleghi 13,14,15,16,17,18,19,20. Successivamente, le misurazioni della forza AFM sono state impiegate per valutare le proprietà meccaniche delle singole molecole21, delle cellule viventi e del loro citoscheletro 9,10,22,23,24,25,26, dei tessuti e delle sezioni di tessuto 6,8,11,27,28, 29,30,31, nonché idrogel biologici 3,4,32. Nella nostra ricerca, abbiamo utilizzato l'AFM per esaminare le proprietà meccaniche dei legami biologici e chimici 18,33,34,35,36,37 e per misurare le caratteristiche nanomeccaniche delle singole cellule 38,39,40. Inoltre, le misurazioni della cartilagine8 della cartilagine di accrescimento hanno dimostrato che l'architettura del collagene e il modulo di Young della matrice extracellulare (ECM) dirigono la divisione dei condrociti e, di conseguenza, la direzione di crescita della cartilagine murina durante lo sviluppo embrionale. Inoltre, abbiamo studiato i cambiamenti associati alla degenerazione della cartilagine e all'osteoartrite nella cartilagine articolare 2,41,42,43,44,45,46,47.

Negli ultimi anni, numerose indagini AFM hanno esaminato le proprietà meccaniche del tessuto polmonare sia sano che patologico 48,49,50,51,52. Tuttavia, queste indagini hanno esaminato principalmente la meccanica tissutale complessiva, non concentrandosi su componenti tissutali specifici come il midollo osseo. Il midollo osseo costituisce uno strato sottile (100 nm - 400 nm nell'uomo) di una struttura specializzata della MEC che riveste la maggior parte degli organi dei mammiferi e delle strutture tissutali come neuroni, muscoli, tessuti adipocitari e vasi sanguigni. Abbiamo scoperto che le proprietà meccaniche del midollo osseo polmonare murino svolgono un ruolo fondamentale durante la formazione delle metastasi, in modo tale che un midollo osseo più morbido sia correlato con una maggiore probabilità di sopravvivenza nei pazienti con carcinoma mammario e renale53. Inoltre, questa indagine ha rivelato che la proteina secreta della matrice extracellulare netrina-4 diminuisce il modulo di Young del midollo osseo attraverso un'interazione stechiometrica 1:1 con la laminina γ1, un componente chiave presente in quasi tutte le reti di laminina all'interno del midollo osseo40.

Qui, presentiamo la visualizzazione del nostro protocollo sviluppato per determinare il modulo di Young (EBM) del midollo osseo polmonare murino sottile di 100 - 200 nm. Il modulo di Young del BM è una misura della sua rigidità ed è definito come il rapporto tra la sollecitazione (forza per unità di area) rispetto alla deformazione assiale risultante (spostamento) durante una deformazione elastica lineare54, in questo caso, una piccola compressione del BM da parte della punta AFM rientrante. In un esperimento AFM, la forza e lo spostamento (profondità di indentazione) possono essere ottenuti dalla deflessione a sbalzo AFM e dalla posizione a sbalzo, e il modulo di Young (la relazione sforzo-deformazione) può essere estratto dalla risultante curva forza contro indentazione utilizzando un modello elastico adatto, che tiene conto della geometria della punta di indentazione (in questo caso un modello di Hertz55 modificato). I passaggi principali sono illustrati nella Figura 1. Inizialmente, questo protocollo delinea la metodologia per la preparazione e l'inclusione di campioni di tessuto polmonare murino nel composto OCT (vedi passaggio 1), facilitando così la successiva procedura di criosezione (passaggio 2) che consente la determinazione della rigidità del midollo osseo utilizzando le mappe di forza AFM. La tecnica di criosezione qui presentata, che utilizza nastro adesivo su un lato e su due lati, consente il sezionamento del tessuto polmonare senza la necessità di fissazione e senza scongelamento della sezione. La procedura dettagliata dell'AFM per la raccolta di dati adeguati per valutare la rigidità del midollo osseo è delineata nella terza sezione del protocollo. Nella sezione successiva del protocollo, spieghiamo come i volumi di forza generati possono essere analizzati automaticamente (passaggio 4.1) utilizzando un software basato su MATLAB sviluppato internamente, il CANTER Processing Toolbox56. In questa fase, il modulo di Young viene estratto da ogni curva forza-indentazione registrata adattando un modello di Hertz modificato, che viene corretto per la geometria del penetratore, in questo caso, una piramide a quattro lati55. Infine, descriviamo nei passaggi 4.2 e 4.3 come applicare lo strumento di filtraggio spaziale e lo strumento di filtraggio R2 del toolbox sviluppato per estrarre i valori del modulo di Young specifici per la membrana basale (BM) dall'insieme completo dei valori del modulo di Young ottenuti nella mappa della forza contenente tutti i compartimenti tissutali della parete alveolare.

Protocollo

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Tutte le procedure per la manipolazione dei campioni animali sono state approvate dal Consiglio per la sperimentazione animale del Ministero dell'ambiente e dell'alimentazione della Danimarca (numero di autorizzazione 2017-15-0201-01265) secondo la legge danese sul benessere degli animali. Per dimostrare questo protocollo, abbiamo utilizzato un topo maschio C57BL/6 a 13 settimane di età.

ATTENZIONE: Nel seguente protocollo, diversi passaggi richiedono la manipolazione di campioni di tessuto. Indossare sempre guanti adeguati e un camice da laboratorio durante la manipolazione di campioni biologici.

1. Preparazione del campione

  1. Metti un polmone di topo appena raccolto in uno stampo di base usa e getta di 15 x 15 x 5 mm. Utilizzando una siringa da 10 ml con un ago da 0,9 mm, iniettare con cautela un rapporto 1:1 (volume-volume) tra il terreno con temperatura di taglio ottimale (OCT) e la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nel campione, ritraendo contemporaneamente l'ago. Condurre l'iniezione a temperatura ambiente tenendo saldamente il campione con una piccola pinzetta chirurgica. L'iniezione è considerata completa quando il campione si gonfia e si osserva una notevole quantità di trasudamento.
  2. Riempire l'OCT puro nello stampo fino a quando il campione non è completamente immerso. Per garantire il congelamento completo dell'intero polmone, conservare il campione a una temperatura di -80 °C per almeno 4 ore.
    NOTA: A questo punto, il campione può essere conservato per almeno 2 anni a -80 °C. In base alle specifiche del produttore per l'OCT, il tempo di conservazione del tessuto incorporato è di oltre 10 anni. In genere si consiglia di avvolgere i campioni che devono essere conservati per periodi superiori a 4 mesi in una pellicola trasparente per evitare che l'umidità venga assorbita nel campione.

2. Criosezione di un campione polmonare incorporato

  1. Regolare la temperatura della camera del criotomo a -17 °C, poiché questa è la temperatura di taglio ottimale per i campioni di tessuto polmonare. Impostare la temperatura dell'unità di taglio stage a -22 °C, se questa funzione è disponibile. Ciò serve a garantire che la temperatura di taglio ottimale venga mantenuta sulla superficie del campione durante l'intero processo di sezionamento.
  2. Preparare 40 vetrini da microscopio utilizzando del nastro biadesivo posizionato con cura al centro del vetrino prima di arrotolare una provetta da centrifuga da 15 ml sul nastro per garantire un'adesione salda e senza bolle. Assicurarsi che la lunghezza del nastro biadesivo sia all'incirca equivalente alla larghezza del blocco OCT contenente il campione. I vetrini da microscopio con bordo smerigliato consentono l'etichettatura con una matita contenente le informazioni sul campione e il numero della sezione.
  3. Inserire i vetrini da microscopio preparati in una scatola per vetrini. Successivamente, posizionare la scatola che contiene i vetrini all'interno della camera criotomica per raffreddarli.
    NOTA: Il raffreddamento dei vetrini impedisce il verificarsi di un ciclo di congelamento-scongelamento durante il prelievo delle sezioni, che comprometterebbe le proprietà meccaniche del campione.
  4. Prepara più nastri adesivi monoadesivi, ciascuno delle dimensioni più o meno uguali del blocco campione congelato.
  5. Riempire i due anelli interni del portacampioni con terreno OCT. Posizionare il campione all'interno del mezzo OCT sul supporto del campione, assicurandosi che sia il più livellato possibile. Successivamente, posizionare il supporto del campione per circa 10 minuti all'interno della camera del criotomo fino a quando il mezzo OCT non si è completamente solidificato e il campione è saldamente fissato al supporto.
  6. Installare il supporto che porta il campione sull'unità di fase di taglio del criotomo. Regolare tutti i componenti essenziali del criotomo, come l'inclinazione della fase di taglio e la posizione della lama, secondo il manuale utente del dispositivo per stabilire un piano di taglio allineato parallelamente alla superficie del blocco OCT.
  7. Effettuare il taglio iniziale del campione regolando lo spessore di sezionamento a 50 μm e iniziare il taglio fino a raggiungere la posizione desiderata all'interno del campione (di solito circa 500 μm all'interno del campione polmonare dalla sua superficie) per la raccolta dei vetrini di tessuto. Regolare lo spessore di sezionamento del criotomo a 15 μm, che corrisponde allo spessore desiderato delle sezioni di tessuto.
    ATTENZIONE: È fondamentale prestare attenzione quando si utilizza uno strumento da taglio, come un criotomo. Per garantire la sicurezza personale, attenersi alle linee guida di sicurezza del produttore e tenere le dita lontane dalla lama.
  8. Attaccare un pezzo di nastro adesivo unilaterale al campione applicando una pressione decisa con il pollice. In precedenza, assicurarsi che il pollice si sia raffreddato tenendolo contro la parete della camera del criotomo per alcuni secondi.
    NOTA: Il nastro deve essere applicato saldamente al campione, poiché qualsiasi mancanza di adesione può provocare il distacco del nastro dal tessuto durante il sezionamento.
  9. Produrre una sezione di tessuto di 15 μm con il criotomo. Utilizzare una spazzola per dirigere la sezione ed evitare che il nastro adesivo si stacchi dal campione durante la procedura di taglio. È essenziale per una superficie liscia della sezione di tessuto che il ritmo di taglio rimanga lento e costante.
  10. La sezione creata nel passaggio precedente si trova ora in piano sul blocco lame con il nastro rivolto verso l'alto. Utilizzare uno dei vetrini da microscopio raffreddati con il nastro biadesivo della scatola dei vetrini e premerlo con decisione sulla sezione per raccoglierlo. Quindi, riposizionare il vetrino del microscopio, che ora contiene la sezione, nella scatola dei vetrini.
    NOTA: Quando si maneggiano il vetrino del microscopio e la sezione, assicurarsi di tenerli sempre all'interno della camera del criotomo per evitare che la sezione si scongeli durante la procedura di taglio.
  11. Ripetere i tre passaggi precedenti fino a quando non è stato raccolto il numero richiesto di sezioni, cioè 40.
  12. Al termine, mettere il coperchio sulla scatola dei vetrini e trasferirla su ghiaccio secco in un congelatore a -20 °C. Infine, ripulisci il criotomo disinfettando tutti gli oggetti usati e accendendo la luce UV nella camera del criotomo.
    NOTA: A questo punto il protocollo può essere messo in pausa. Conservare i campioni a una temperatura di -20 °C fino a quando non vengono eseguite le misurazioni AFM. Il tempo di conservazione raccomandato per le sezioni e il terreno OCT non deve superare le 6 settimane. Oltre questo lasso di tempo, le sezioni e il mezzo OCT possono mostrare alterazioni simili alla bruciatura da congelamento a causa della loro notevole superficie e della propensione ad assorbire l'umidità.

3. Mappe di forza AFM di una sezione polmonare

NOTA: Per questo protocollo, il JPK NanoWizard 4XP (AFM) e lo stadio motorizzato di Bruker combinati con il DMi8 (microscopio ottico invertito) di Leica sono stati utilizzati per registrare le curve di forza-spostamento delle sezioni polmonari.

  1. Impostazione dell'AFM
    1. Accendere tutti i dispositivi necessari per la configurazione AFM (ad es. computer, controller AFM, tabella di isolamento dalle vibrazioni, microscopio ottico, ecc.).
    2. Avvia il software di controllo AFM. Nella panoramica Scegli esperimento , selezionare la modalità di imaging avanzata QI . Inoltre, specificare la posizione in cui devono essere archiviati i dati dell'esperimento e i file di calibrazione.
      NOTA: Se non si dispone dell'estensione QI Advanced Imaging , utilizzare la modalità di mappatura della forza della modalità di contatto come opzione alternativa.
    3. Selezionare un cantilever con una costante elastica adatta al tipo specifico di campione da osservare. Per i campioni di tessuto polmonare molle, si consiglia l'MLCT Cantilever F di Bruker con punta piramidale e costante elastica nominale di 0,6 N/m. Se un chip contiene più cantilever (come l'MLCT), rimuovere i cantilever più lunghi dal chip utilizzando un paio di pinzette sotto uno stereomicroscopio per assicurarsi che solo il cantilever utilizzato per la misurazione entri in contatto con il campione.
      NOTA: Altri cantilever a contatto con il campione diversi da quello utilizzato per la misurazione possono portare a un movimento indesiderato del campione durante l'esperimento o addirittura a un distacco del campione dal nastro sottostante.
      ATTENZIONE: Evitare di entrare in contatto con il cantilever utilizzato per la misurazione con le pinzette nella fase corrente o successiva.
    4. Eseguire l'installazione del chip sul supporto a sbalzo. Inserire il supporto nella testa AFM. Posizionare la testa AFM sul tavolino del campione, che si trova sul microscopio ottico invertito. Allineare il percorso della leva ottica come indicato nel manuale dell'utente. Il corretto allineamento del percorso della leva ottica si ottiene quando il raggio laser viene inizialmente posizionato all'estremità anteriore del cantilever di misurazione e, successivamente, il raggio laser riflesso colpisce il centro del fotodiodo segmentato.
  2. Calibrazione a sbalzo con il metodo del rumore termico57
    NOTA: La calibrazione del cantilever include la determinazione della sensibilità della leva ottica invertita (InvOLS) e della costante della molla. La calibrazione individuale di ogni cantilever usato è necessaria perché la costante nominale della molla tipicamente fornita per i cantilever è solitamente solo un'approssimazione approssimativa. Negli esperimenti in cui le proprietà meccaniche di un campione sono determinate da curve di forza registrate, come quella descritta in questo protocollo, è essenziale determinare direttamente l'InvOLS attraverso un metodo basato sul contatto su un substrato rigido. Metodi alternativi che determinano l'InvOLS, come derivarlo dalla geometria del cantilever, possono fornire solo un'approssimazione approssimativa e non sono adatti per il tipo di applicazione qui descritta. In alternativa, se si utilizzano cantilever in cui il fornitore fornisce l'esatta costante della molla, l'InvOLS può essere determinato con una procedura descritta da Schiller et al.58.
    1. Posizionare un vetrino da microscopio sul tavolino campione dell'AFM. Il vetrino del microscopio funge da substrato rigido per la determinazione basata sul contatto dell'InvOLS.
    2. Dopo aver posizionato la testa AFM sul tavolino del campione, abbassare la testa utilizzando i motori passo-passo fino a quando lo spazio rimanente tra il supporto a sbalzo e il vetrino del microscopio è di soli circa 1 - 2 mm. Applicare PBS sul lato del supporto a sbalzo, lasciandolo scorrere verso il basso e formare un menisco fluido nello spazio tra il supporto e il vetrino del microscopio utilizzando una siringa da 1 ml con un ago lungo (0,9 mm x 70 mm).
      NOTA: Assicurarsi che lo stesso liquido, come tampone o fluido, utilizzato per le misurazioni del volume di forza del campione venga utilizzato anche per il processo di calibrazione.
    3. Per eseguire una calibrazione basata su contatto nel software, accedere alla pagina Acquisisci dati e selezionare l'opzione Vista avanzata . Accedi al Calibration Manager utilizzando il pulsante del menu dell'hamburger situato nell'angolo in alto a destra. All'interno di questa interfaccia, selezionare Basato su contatto come metodo e scegliere il cantilever MLCT F dal menu a discesa come nome del cantilever. Inoltre, impostare il Setpoint su 1 V e il Numero di scansioni su 10 nei campi di input corrispondenti.
    4. Nella pagina Acquisisci dati , nel pannello di controllo sinistro, inserire un setpoint di 1 V per la procedura di avvicinamento automatico. Fare clic sul pulsante blu Freccia rivolta verso il basso situato nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia utente per avviare l'avvicinamento automatico. Quando l'avvicinamento è terminato e il cantilever è a contatto con il vetrino del microscopio, fare clic sul pulsante Calibra nella finestra Gestione calibrazione .
      NOTA: L'InvOLS e la costante della molla a sbalzo vengono quindi determinate automaticamente registrando 10 curve di forza e la densità spettrale di potenza termica (PSD), che viene utilizzata per determinare la costante della molla con il metodo del rumore termico57. Al termine della procedura di calibrazione automatica, controllare visivamente che la curva montata descriva correttamente la modalità normale (primo picco) della PSD registrata del cantilever e che la costante della molla determinata abbia lo stesso ordine di grandezza della costante nominale della molla fornita dal produttore del cantilever. In caso contrario, l'intervallo di adattamento deve essere regolato manualmente per garantire che l'accoppiamento converga e rappresenti il primo picco dello spettro di potenza termica.
    5. Al termine della calibrazione, chiudere la finestra Gestione calibrazione . Dopo la chiusura del Calibration Manager, viene generato un file di calibrazione (file *.tnd ascii) nella directory preselezionata (vedere il passaggio 3.1.2) contenente i risultati di calibrazione determinati, che sono successivamente necessari per l'analisi dei dati. Documentare i valori di calibrazione per riferimento futuro durante il processo di analisi dei dati, ad esempio nel quaderno di laboratorio.
      ATTENZIONE: Da questo passaggio in poi, astenersi dal modificare la posizione del laser sul cantilever, regolare lo specchio nella testa AFM o riposizionare il supporto del cantilever. La modifica di questi elementi influirà sull'InvOLS e renderà i valori di calibrazione non validi. Per compensare la deriva termica, regolare la posizione del fotodiodo segmentato della testa AFM.
  3. Analisi di una parete alveolare su una sezione polmonare
    1. Recuperare il vetrino per valutarlo dal congelatore. Lasciare scongelare il campione a temperatura ambiente per circa 1 minuto fino a quando l'intero mezzo OCT non è diventato limpido. Successivamente, aggiungere alcune goccioline di PBS alla sezione di tessuto polmonare per reidratarla.
    2. Posizionare il vetrino del microscopio che trasporta la sezione di tessuto polmonare sul tavolino del campione. Reinstallare la testa AFM sul tavolino del campione e abbassare la testa fino a quando il cantilever non è posizionato a circa 1 mm sopra il campione. Aggiungere un po' di PBS aggiuntivo sul lato del supporto a sbalzo utilizzando una siringa da 1 ml combinata con un ago da 0,9 mm x 70 mm fino a formare un menisco liquido tra la sezione di tessuto e il supporto a sbalzo.
    3. Accedere a Gestione impostazioni facendo clic sul pulsante con l'icona della chiave inglese nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia utente. In Gestione impostazioni, regolare le seguenti impostazioni generali. Nella sezione Impostazioni di avvicinamento , impostare l'altezza target su 4 μm. Quindi, nella sezione Impostazioni modalità corrente , procedi alle Impostazioni di feedback avanzate e imposta il moltiplicatore su 1. Infine, all'interno della sottosezione Impostazioni forza , che si trova anche nella sezione Impostazioni modalità corrente , seleziona l'opzione Piezo retratto dal menu a discesa Modalità alla fine .
    4. Utilizzare il microscopio ottico invertito per identificare e navigare verso una parete alveolare intatta. Una parete intatta è caratterizzata nell'immagine in campo chiaro da bordi scuri e lisci. (vedi Figura 2A-B).
      NOTA: L'importazione dell'immagine in campo chiaro nel software di controllo AFM, quando disponibile, può aiutare a navigare il cantilever verso una particolare parete alveolare e catturare con precisione una forza o una mappa QI sopra di essa. Nel software JPK SPM, questa funzione è indicata come Direct Overlay.
    5. Impostare i parametri per le curve forza-indentazione nel pannello di controllo di sinistra in base al AFM utilizzato, al cantilever impiegato e al campione osservato. Per il NanoWizard 4XP e l'MLCT Cantilever F di Bruker, si consigliano i seguenti parametri: Setpoint = 5 nN; lunghezza z = 8 μm; Velocità z = 300 μm/s.
      NOTA: La lunghezza z consigliata di 8 μm è piuttosto grande. Ciò è attribuito alle caratteristiche del tessuto polmonare. Dato che il tessuto polmonare è in genere piuttosto morbido, la profondità di indentazione può raggiungere fino a 4 μm in determinati punti, anche con un setpoint relativamente modesto di 5 nN. Al fine di garantire che la linea di base, in cui la punta non è a contatto con il campione, rappresenti almeno circa la metà della curva forza-indentazione, si raccomanda che la lunghezza totale della curva sia impostata a 8 μm. Ciò semplificherà notevolmente l'analisi della curva in un secondo momento. Per altri bio-AFM, questi parametri dovrebbero essere applicabili, sebbene la nomenclatura per alcuni parametri, come il setpoint, che determina la forza di indentazione massima, possa variare tra i diversi produttori. Se il sistema AFM non è in grado di raggiungere l'elevata velocità verticale qui indicata, è necessario diminuire la velocità z secondo le raccomandazioni del produttore dell'AFM.
      ATTENZIONE: Al fine di garantire la comparabilità dei risultati, è essenziale utilizzare velocità di approccio z identiche in tutti gli esperimenti.
    6. Imposta la posizione e le dimensioni della mappa di forza panoramica iniziale, assicurandoti che includa l'intera parete alveolare, estendendosi da un lato dell'aria all'altro. Per i campioni di tessuto polmonare murino, di solito è sufficiente una dimensione compresa tra 20 μm x 20 μm e 30 μm x 30 μm. Indipendentemente dalle dimensioni specifiche della mappa, impostare il numero di pixel (che corrisponde al numero di curve di forza registrate) su 50 x 50. Ciò porta alla generazione di 2.500 curve di forza-indentazione per ogni mappa, che fornisce la risoluzione necessaria per identificare il BM nel canale di pendenza della mappa di forza. (vedi Figura 2C-D).
    7. Dopo aver registrato la mappa panoramica, esaminare l'altezza e il canale di pendenza della mappa delle forze. Se il canale di altezza indica che la parete alveolare è intatta (vedi Figura 2D) e se è possibile distinguere il midollo medio nel canale di pendenza come una linea chiara chiaramente definita (vedi Figura 2C, E) situata tra due strati dell'epitelio e dell'endotelio, cattura una mappa di forza più focalizzata con una dimensione di 3 μm x 3 μm o 4 μm x 4 μm sul midollo osseo. Mantieni i pixel a 50 x 50 curve.
      NOTA: Questa procedura porta ad una maggiore risoluzione della mappa e consente di registrare un maggior numero di valori del modulo di Young, in particolare per il BM (vedi Figura 2E-F). Inoltre, ciò consente una differenziazione più accurata tra il midollo osseo e i tessuti circostanti, migliorando la precisione del successivo processo di filtraggio spaziale. Se i canali della mappa panoramica mostrano una parete collassata o rotta, artefatti dovuti al fatto che il cantilever tocca il campione non solo con la punta, o nessun BM identificabile nel canale di pendenza, si spostano su un'altra parete sulla sezione di tessuto fino a quando non è possibile identificare una parete con una valutazione del BM priva di artefatti.
      Ripetere i passaggi precedenti (3.3.6 e 3.3.7) su ulteriori sezioni dello stesso campione polmonare fino a quando non è stato valutato il numero desiderato di pareti alveolari. Si raccomandano almeno quattro pareti per ogni campione polmonare per ottenere risultati robusti59.
    8. Una volta completata la misurazione, pulire tutte le apparecchiature e i materiali che sono entrati in contatto con il campione e il PBS. Se il campione non è più necessario, smaltirlo in un contenitore di vetro autoclavabile. Salva tutti i dati registrati e spegni il software di controllo AFM e il computer. Infine, spegnere tutti i dispositivi elettrici utilizzati.
      NOTA: A questo punto, il protocollo può essere messo in pausa. I dati sperimentali vengono salvati e possono essere analizzati in un secondo momento.

4. Analisi dei dati

  1. Analisi delle curve forza-indentazione
    NOTA: Un manuale dettagliato dell'applicazione Force Curve Analysis è disponibile qui: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis.
    1. Avvia CANTER Processing Toolbox56 in MATLAB e apri l'applicazione Force Curve Analysis .
      NOTA: Il Toolbox può essere scaricato dal repository GitHub seguendo questo link: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. Il file README.md, che comprende una guida completa su come installare il software e avviarlo utilizzando MATLAB, è disponibile nel repository GitHub. Ulteriori informazioni su ciascuna applicazione inclusa nel Toolbox sono disponibili nel wiki corrispondente all'indirizzo https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki.
    2. Caricare la mappa di forza ad alta risoluzione (3 μm x 3 μm o 4 μm x 4 μm) facendo clic sul pulsante Seleziona file , passando alla posizione in cui è stata salvata la mappa di forza, facendo doppio clic su di essa e quindi facendo clic sul pulsante Carica dati nell'interfaccia utente dell'applicazione.
    3. Viene visualizzata una finestra pop-up che richiede i valori di calibrazione (InvOLS e costante della molla) determinati (vedere il passaggio 3.2) per il cantilever utilizzato per registrare la mappa di forza selezionata nel precedente passaggio del protocollo. Inserire i valori di calibrazione nei rispettivi campi di modifica. Se non sono stati documentati durante il passaggio 3.2.4, fare riferimento al file di calibrazione generato automaticamente, che contiene anche i valori di calibrazione. Mantenere l'opzione predefinita yes per la domanda se la separazione punta-campione deve essere calcolata. Successivamente, fai clic sul pulsante Invia per procedere.
    4. Viene visualizzata una seconda finestra pop-up, che consente di selezionare la geometria del penetratore e il rapporto di Poisson per il campione rientrato. Per i cantilever MLCT utilizzati, selezionare Piramide a quattro lati come geometria della punta e immettere 17,5° per il semiangolo rispetto allo spigolo (entrambi sono i valori predefiniti). Utilizzare il rapporto di Poisson predefinito di 0,5, che rappresenta un materiale incomprimibile. Per proseguire con la procedura di caricamento della mappa QI, cliccare sul pulsante Invia .
      NOTA: Durante la procedura di caricamento, le curve di deflessione-spostamento registrate (dati grezzi dell'AFM) vengono convertite in curve di forza-indentazione in base ai valori di calibrazione forniti. Per una comprensione completa delle singole fasi di trasformazione e delle equazioni associate, fare riferimento alle informazioni supplementari di Hartmann et al.59.
    5. Al termine del processo di caricamento, sullo schermo verrà visualizzata la curva di forza iniziale della mappa di forza. Assicurarsi che sia selezionata la modalità di correzione della linea di base Offset + Tilt . Questa modalità rileva automaticamente la linea di base della curva forza-induzione e corregge l'inclinazione e l'offset verticale in modo che siano pari a zero. Inoltre, selezionare tramite il modello Hertz come algoritmo per il Contact Point Finder e utilizzare un valore del 20% nel campo di modifica designato per questa opzione. Questo algoritmo è particolarmente adatto per rilevare il punto di contatto nelle curve di forza-indentazione che sono state registrate su campioni di tessuto molle. Infine, impostare la profondità di adattamento nel campo di modifica corrispondente su 1,5 μm.
      NOTA: Per garantire che la rigidità del vetrino del microscopio non influisca sul modulo di Young risultante, si consiglia di impostare la profondità massima di adattamento su un valore non superiore al 10% dello spessore della sezione di tessuto60. Per maggiori dettagli sugli algoritmi di correzione, vedere le informazioni supplementari di Hartmann et al.59.
      ATTENZIONE: Utilizzare la stessa profondità di adattamento in tutti gli esperimenti per garantire che i risultati siano comparabili.
    6. Per applicare l'adattamento del modello di Hertz modificato a tutte le curve di forza-indentazione della mappa QI, fare clic sul pulsante Mantieni e Applica a tutti . Viene visualizzata una finestra di dialogo in cui viene chiesto se ogni curva di forza deve essere visualizzata o meno durante l'analisi. Non visualizzando le curve, la velocità di elaborazione viene leggermente accelerata.
    7. Dopo il completamento dell'ultima analisi della curva di forza, viene visualizzata una finestra che chiede se i risultati dell'accoppiamento devono essere salvati. Per salvare i risultati in entrambi. tsv (valori separati da tabulazioni) e .xlsx (Excel), fare clic su Sì e inserire un nome per i file dei risultati. Inoltre, viene salvato un file di testo con estensione *.meta_data, che contiene tutti i dettagli relativi all'analisi delle curve, come i valori di calibrazione utilizzati, il modello di adattamento scelto, l'algoritmo di rilevamento del punto di contatto selezionato, l'intervallo di adattamento e altre informazioni rilevanti.
    8. Chiudere l'applicazione Analisi della curva di forza facendo clic sull'icona a forma di croce nell'angolo in alto a destra della finestra principale.
  2. Filtraggio spaziale dei risultati della mappa QI
    NOTA: La fase di filtraggio spaziale garantisce che solo i valori del modulo di Young delle mappe QI originate dal BM siano presi in considerazione per qualsiasi ulteriore analisi. Un manuale dettagliato per lo strumento di filtraggio dei risultati è disponibile qui: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool.
    1. Selezionare lo strumento di filtraggio dei risultati dall'elenco delle applicazioni nella finestra di selezione dell'applicazione di CANTER Processing Toolbox e avviare l'applicazione facendo clic sul pulsante Avvia applicazione .
    2. Per caricare i risultati dell'adattamento, fare clic su Apri nella barra dei menu in alto dell'interfaccia utente dello strumento di filtraggio dei risultati . Nella finestra pop-up successiva, individuare il primo pulsante Imposta situato all'interno della scheda Mappe JPK e scegliere il file .tsv che contiene i risultati dell'analisi della curva di forza (fare riferimento al passaggio 4.1.6). Fare clic sul secondo pulsante Set e individuare il file della mappa QI che corrisponde al file .tsv già selezionato. Successivamente, fare clic su Invia per caricare i dati della mappa e i risultati dell'analisi della curva di forza.
    3. Seleziona l'opzione Emodul dal menu a discesa in alto Canale visualizzato per visualizzare i risultati del modulo di Young ottenuti come immagine della mappa. Inoltre, scegliere l'opzione Emodul (se non è già selezionata) dal menu a tendina Canale dati situato sotto il grafico dell'istogramma per visualizzare la distribuzione dei valori del modulo di Young caricati della mappa QI.
    4. Fare clic sul pulsante freccia Flusso di manipolazione , che si trova al centro dell'interfaccia utente, e assicurarsi che sia rivolto verso il lato destro. Impostate l'interruttore del filtro immagine sulla posizione On nel pannello del filtro situato sopra gli assi dell'istogramma. Selezionare l'opzione Mano libera dal menu a discesa Filtra geometria , quindi fare clic sul pulsante Aggiungi .
    5. Nell'immagine del canale superiore, disegna la maschera del filtro girando intorno al BM mentre tieni premuto il tasto sinistro del mouse. Il midollo osseo è identificabile nella mappa del modulo di Young come una struttura brillante (valori elevati del modulo di Young) rispetto al tessuto molle vicino (vedi Figura 3A). Al termine del disegno della maschera, rilasciare il tasto sinistro del mouse e fare doppio clic sulla maschera da applicare alla mappa. Il grafico dell'istogramma a destra ora mostra solo i valori del modulo di Young per le regioni della mappa evidenziate in verde (il colore predefinito; vedere la Figura 3C-D).
    6. Per creare un nuovo file di risultati .tsv contenente solo i valori del modulo di Young mascherato, fare clic sulla barra dei menu in alto dell'interfaccia utente su Salva > Salva istogramma > Salva dati. In alternativa, fare clic con il pulsante destro del mouse su un'area vuota degli assi di tracciatura dell'istogramma e selezionare Salva dati dal menu contestuale.
    7. Fare clic su Seleziona tutto nella finestra pop-up che chiede quali risultati scrivere nel file .tsv. Quindi, confermare la selezione facendo clic sul pulsante OK . Successivamente, inserisci un nome per il file .tsv nella finestra di dialogo di salvataggio, scegli la posizione di salvataggio desiderata e infine fai clic su OK per salvare i risultati filtrati.
    8. Chiudi lo strumento di filtraggio dei risultati facendo clic sull'icona a forma di croce nell'angolo in alto a destra dell'applicazione.
  3. R2 filtraggio dei risultati
    NOTA: Questa fase del protocollo garantisce che vengano considerati solo i risultati del modulo di Young quando il modello di Hertz modificato ha mostrato un buon accordo con la curva forza-indentazione su cui è stato montato. Un manuale dettagliato per lo strumento di filtraggio R² è disponibile qui: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool.
    1. Avviare lo strumento di filtraggio R² selezionandolo nell'elenco delle applicazioni della finestra di selezione dell'applicazione di CANTER Processing Toolbox e facendo clic su Avvia applicazione.
    2. Passare alla barra dei menu in alto dell'interfaccia utente e fare clic su Apri file .tsv. Nella successiva finestra di dialogo di caricamento del file, individuare il file .tsv contenente i risultati del modulo di Young del BM salvato durante il passaggio precedente 4.2.5 e selezionarlo facendo doppio clic.
    3. Viene visualizzata una finestra di dialogo che presenta un elenco delle colonne di dati contenute nel file con estensione tsv. Selezionare Emodul come colonna contenente i dati del modulo di Young. Successivamente, in una finestra di dialogo separata della casella di riepilogo che richiede i dati R², scegliere rsquare_fit. Una volta completata la procedura di caricamento, i dati del modulo di Young caricati vengono visualizzati sotto forma di istogramma nella parte superiore sinistra dello schermo, mentre la distribuzione dei dati R² è rappresentata nel grafico nella parte superiore destra.
    4. Immettere 0,96 nel campo di modifica situato al centro dell'interfaccia utente grafica. Fare clic sul pulsante Filtra dati per applicare il filtro R² utilizzando il valore inserito. Questa azione manterrà solo i risultati che hanno un valore R² di 0,96 o superiore. Le distribuzioni filtrate dei risultati del modulo di Young e i corrispondenti valori di R² vengono visualizzati nella metà inferiore dell'interfaccia utente.
    5. Selezionare Salva dati filtrati dalla barra dei menu superiore per creare un nuovo file con estensione tsv che includa solo i risultati che soddisfano il criterio di filtro R² definito di > 0,96. I dati salvati possono ora essere visualizzati come istogramma, ad esempio, utilizzando lo strumento di tracciatura dell'istogramma, che visualizza la distribuzione del modulo di Young per il midollo osseo polmonare sondato (vedere la Figura 4A).

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopo l'identificazione e la misurazione di una parete alveolare intatta, l'esito primario di questo protocollo è il filtraggio dei valori del modulo di Young del midollo osseo. È importante notare che non è possibile trovare una parete alveolare adatta per la misurazione dell'AFM in ogni sezione di tessuto. Nelle nostre osservazioni sperimentali, circa il 75% delle criosezioni derivate da campioni polmonari murini mostrava una parete alveolare quantificabile. Per determinare con precisione la distribuzione spaziale del modulo di Young in un midollo osseo polmonare, si consiglia di utilizzare mappe di forza che si estendono su 3 μm x 3 μm o 4 μm x 4 μm. Questo approccio garantisce una risoluzione sufficiente per l'esame dei BM polmonari di topo, che in genere misurano 100 nm - 200 nm di spessore. Pertanto, l'approccio sperimentale prevede l'acquisizione di curve di forza 50 x 50 per ciascuna mappa di forza, producendo un totale di 2.500 curve di forza. All'interno della mappa delle forze, le curve delle forze sono equidistanti. Ciò implica che, oltre al modulo di Young del midollo osseo, le strutture tissutali che circondano il midollo osseo vengono sondate anche nelle mappe di forza piccole. Pertanto, per determinare in modo accurato e selettivo il modulo di Young esclusivamente del midollo osseo polmonare, abbiamo implementato un processo di filtraggio in due fasi in questo protocollo.

La fase iniziale del filtraggio spaziale dipendente dall'operatore seleziona i risultati dell'adattamento della curva di forza originati dal midollo muscolare polmonare murino, comprendendo circa il 10-25% dei valori totali dei risultati contenuti nella mappa di forza analizzata. Dopo questo filtraggio spaziale iniziale, vengono conservati circa 250 - 625 risultati di adattamento per ulteriori analisi. La successiva fase di filtraggio garantisce che siano inclusi solo i risultati relativi al midollo osseo originati dalle curve di forza adeguatamente descritte dal modello di Hertz modificato. Pertanto, il coefficiente di determinazione (R2) dell'adattamento del modello di Hertz modificato viene utilizzato come criterio di filtro. La nostra esperienza empirica suggerisce che mantenere i risultati con valori di R2 superiori a 0,96 è adatto per i risultati di adattamento ottenuti aderendo a questo protocollo. È importante notare che il valore R2 è influenzato in modo significativo dalla qualità (levigatezza) e dalla lunghezza della linea di base della curva di forza, dalla determinazione del punto di contatto e dalla convergenza del modello adattato. Dopo l'applicazione di entrambe le procedure di filtraggio, rimangono tipicamente da 100 a 500 valori del modulo di Young per il BM di una singola parete alveolare.

La distribuzione di questi valori rimanenti del modulo di Young dal midollo osseo può essere visualizzata utilizzando un istogramma (Figura 4A). È importante notare che i valori del modulo di Young risultanti del midollo mitralico polmonare seguono una distribuzione log-normale, che è comunemente osservata per variabili casuali che possono raggiungere solo valori positivi61. Questo è visualizzato dal grafico QQ nella Figura 4B. Di conseguenza, una distribuzione normale (gaussiana) può essere adattata alla distribuzione dei valori del modulo di Young (E) logaritmicamente trasformati. Qui, il logaritmo naturale (ln) è stato utilizzato per trasformare i valori E . La posizione di picco della distribuzione (μ) e la deviazione standard (σ) sono state estratte da questo adattamento e successivamente ritrasformate per ottenere il modulo di Young rappresentativo, indicato come EBM, utilizzando la seguente equazione:

figure-results-1

Si noti che dopo la ritrasformazione, l'intervallo di deviazione standard non è più simmetrico attorno al valore di picco. Gli archi negativi (σ-) e positivi (σ+) dell'intervallo di deviazione standard possono essere calcolati utilizzando le seguenti espressioni:

figure-results-2

figure-results-3

Queste equazioni sono una conseguenza del fatto che la funzione esponenziale è la funzione inversa del logaritmo naturale62.

Dopo aver ritrasformato il valore di picco μ = 9,31 e la deviazione standard σ = 0,18 determinata dall'istogramma nella Figura 4A, il valore rappresentativo del modulo di Young è EBM = 11,05 kPa con un intervallo di deviazione standard di [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. In alternativa, una distribuzione log-normale può essere adattata all'istogramma dei valori del modulo di Young (E) non trasformati per determinare i parametri caratteristici della distribuzione.

Si raccomanda che almeno quattro pareti per topo siano analizzate per ottenere un risultato rappresentativo robusto, come abbiamo mostrato in dettaglio in Hartmann et al.59. Per determinare il modulo di Young rappresentativo EBM per un topo, i valori trasformati logaritmicamente di tutte e quattro le pareti sono stati tracciati in un istogramma combinato e μ e σ sono stati determinati adattando una distribuzione normale. Successivamente, μ e σ vengono ritrasformati come descritto in precedenza per recuperare EBM e l'intervallo di deviazione standard per il topo in questione.

figure-results-4
Figura 1: Panoramica delle principali fasi del protocollo per determinare il modulo di Young di una membrana basale polmonare murina. La fase iniziale prevede l'ottenimento e la preparazione dei polmoni murini, seguiti dall'incorporamento. Pertanto, il polmone viene iniettato con una combinazione di terreno OCT e PBS e quindi completamente immerso nel composto OCT. Successivamente, vengono ottenute sezioni di tessuto polmonare spesse 15 μm mediante criosezione con un criotomo. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio il processo di utilizzo di nastri adesivi unilaterali e biadesivi per fissare i campioni in posizione durante il processo di taglio. Successivamente, i valori del modulo di Young del BM vengono determinati attraverso misure della mappa di forza AFM sulle sezioni di tessuto. Dopo il completamento del processo di analisi della curva di forza, viene applicato il filtraggio spaziale e R² per isolare i risultati del modulo di Young della struttura di interesse, in particolare il BM (mostrato in verde nella mappa di forza e quantificato nella distribuzione del modulo di Young log-trasformato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 2: Un esperimento esemplare di AFM con mappa di forza condotto su una sezione di tessuto polmonare murino. (A) Immagine panoramica al microscopio a campo chiaro di una sezione di tessuto polmonare murino, che consente l'identificazione di pareti alveolari intatte situate tra due alveoli. Sul lato destro dell'immagine, è visibile il cantilever F MLCT di forma triangolare dell'AFM. (B) Vista ingrandita di una parete selezionata all'interno della sezione di tessuto. (C) Canale di pendenza e (D) altezza di una mappa panoramica 15 x 15 μm contenente curve di forza 50 x 50 della parete alveolare. Nel canale di pendenza, il BM può essere identificato come una linea luminosa (freccia bianca), che indica una struttura di maggiore rigidità all'interno della parete. Il canale di altezza conferma l'integrità della parete, non mostrando segni di rottura. Dopo l'identificazione del BM nella mappa panoramica 15 x 15 μm, viene registrata una mappa più piccola di 4 x 4 μm (E: canale di pendenza, F: canale di altezza) con curve di forza 50 x 50. Barre di scala: (A) 200 μm e (B-D) 25 μm. Le gamme delle scale di colori delle immagini AFM mostrate sono (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (immagine panoramica) e 2,42 - 8,37 nN/μm (immagine più piccola), (F) 0 - 3,38 μm (immagine panoramica) e 0 - 1,99 μm (immagine più piccola), da scuro a luminoso. Le scale di colori lineari sono state utilizzate per tutte le immagini AFM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 3: Visualizzazione della procedura di filtraggio spaziale. (A) La mappa del modulo di Young risultante dall'analisi della curva di forza, come mostrato nello strumento di filtraggio dei risultati per abilitare il filtraggio spaziale dei risultati. Il midollo osseo è identificabile come una striscia luminosa (valori elevati del modulo di Young) circondata da compartimenti tissutali più morbidi. (B) Istogramma dei valori del modulo di Young corrispondenti alla mappa non filtrata (A). Dopo l'applicazione (C) della maschera di filtro spaziale (area verde), (D) l'istogramma comprende esclusivamente i valori del modulo di Young dalla regione evidenziata in verde, che è stata identificata come BM. Si noti che i valori morbidi residui osservabili sul lato sinistro dell'istogramma possono essere attribuiti a fit scarsamente convergenti, che verranno eliminati nella successiva fase di filtraggio R². Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-7
Figura 4: Distribuzione del modulo di Young di un midollo muscolare polmonare murino ricevuto seguendo questo protocollo. (A) Istogramma logaritmizzato dei valori del modulo di Young del midollo osseo risultante (N = 325). Adattando una distribuzione normale (linea continua nera), viene determinato il valore medio μ = 9,31 con una deviazione standard di σ = 0,18. Dopo la ritrasformazione, questo corrisponde a un modulo di Young del BM di EBM = 11,05 kPa con un intervallo di deviazione standard asimmetrico di [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ Grafico dei quantili dei valori del modulo di BM Young logaritmizzati rispetto ai quantili di una distribuzione normale standard. Questo grafico dimostra che, con l'eccezione di alcuni valori nelle code sinistra e destra della distribuzione, i valori del modulo di Young risultanti sono principalmente distribuiti log-normale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le caratteristiche meccaniche dei BM hanno ricevuto un notevole interesse a causa della loro influenza su varie funzioni cellulari, come la gemmazione tumorale, la differenziazione cellulare, il movimento cellulare e l'accessibilità della cromatina 53,63,64,65,66,67,68. Di conseguenza, esiste una lacuna non colmata nella capacità di valutare la meccanica del midollo osseo in modo coerente e misurabile. Questo protocollo ha lo scopo di consentire agli utilizzatori di AFM di determinare il modulo di Young dei BM polmonari da campioni di polmone murino sani o patologici ottenuti da topi wildtype o geneticamente modificati. L'applicazione MATLAB CANTER Processing Toolbox56, basata su interfaccia utente grafica, facilita l'analisi a valle dei dati AFM. Si prevede che questo protocollo sarà utile per altri ricercatori che conducono studi che potrebbero portare a progressi nella diagnosi clinica, nella gestione o in nuove strategie di trattamento per i disturbi polmonari.

Le fasi critiche del protocollo includono la garanzia che durante la criosezione del campione polmonare, le sezioni di tessuto non si scongelino in nessun momento per evitare alterazioni delle proprietà meccaniche dovute ai cicli di congelamento-scongelamento. Pertanto, è essenziale utilizzare solo vetrini da microscopio pre-raffreddati per raccogliere le sezioni e maneggiarle solo all'interno della camera del criotomo. Il passaggio più cruciale durante la registrazione delle mappe di forza su una parete alveolare è l'utilizzo dell'immagine di pendenza generata, che fornisce una panoramica qualitativa della distribuzione della rigidezza dell'area sondata, per identificare una posizione di misurazione appropriata del BM. Il filtraggio spaziale dei valori del modulo di Young ottenuti costituisce un passaggio critico nel protocollo ed è una caratteristica chiave del CANTER Processing Toolbox. Questa fase di filtraggio consente al ricercatore di identificare il midollo osseo, che si trova tra due strati cellulari più morbidi, attraverso la sua impronta distintiva più rigida ed estrarre i corrispondenti valori del modulo di Young del midollo osseo per ulteriori analisi.

Questo flusso di lavoro di analisi avanzato ha rivelato che i topi knockout per la netrina-4 mostravano un modulo di Young sostanzialmente (circa il doppio) più alto nella membrana basale polmonare rispetto ai topi wildtype53. Pertanto, il presente protocollo facilita l'analisi comparativa di diverse condizioni o gruppi.

Oltre all'AFM, esistono numerose metodologie per esaminare le proprietà meccaniche dei biomateriali, che comprendono pinzette ottiche o magnetiche 69,70,71 a livello molecolare, tecniche di microindentazione 72,73 su scala intermedia e test di compressione confinati o non confinati74,75 a livello macroscopico. In particolare, la miografia a pressione, la prova di trazione76,77 e la reologia78 sono state impiegate per valutare la rigidità del midollo osseo di campioni vascolari e matrici di midollo osseo ricostituite. Tuttavia, tecniche come la miografia a pressione e le prove di trazione possono valutare solo le caratteristiche meccaniche di tessuti completi o strutture di tessuti interi, come interi vasi sanguigni, che includono vari strati cellulari ed elementi strutturali. Di conseguenza, quando si utilizzano questi metodi per valutare la biomeccanica del midollo osseo, le proprietà meccaniche dei non-BM, come i componenti cellulari, sono sempre sovrapposte ai risultati del midollo osseo, rendendo difficile isolare le proprietà specifiche del midollo osseo stesso.

In questo protocollo, la caratteristica di interesse (BM) viene estratta attraverso il filtraggio spaziale dei risultati della mappa di forza. Una limitazione di questo approccio è il requisito che la caratteristica di interesse sia distinguibile e identificabile come un modello distinto nelle mappe del modulo di Young ottenute o in qualsiasi altro canale di mappe disponibile. Ad esempio, il midollo osseo nel tessuto alveolare è identificabile esclusivamente a causa della sua struttura interconnessa, che mostra un modulo di Young significativamente più alto rispetto alle cellule circostanti. Di conseguenza, il midollo osseo si manifesta come una striscia luminosa continua nelle mappe del modulo di Young ottenute. Tuttavia, altre strutture biologiche mostrano proprietà meccaniche che non sono sufficientemente distinte da quelle del tessuto circostante per consentire il filtraggio spaziale nei risultati della mappa. Sebbene il protocollo possa essere combinato con altri metodi per identificare le strutture nelle mappe di forza registrate, come la colorazione in immunofluorescenza, questo approccio può produrre risultati difficili da interpretare. Questa complicanza può verificarsi perché le procedure di colorazione possono alterare le proprietà meccaniche dei tessuti. Di conseguenza, qualsiasi elaborazione o colorazione del tessuto prima delle misurazioni AFM deve essere condotta solo quando non è disponibile alcun metodo alternativo per identificare la caratteristica di interesse. Inoltre, è importante eseguire opportuni esperimenti di controllo confrontando le proprietà biomeccaniche dei campioni colorati e non colorati.

Il protocollo introduce un metodo per identificare le strutture bersaglio basato sul contrasto del modulo di Young. Di conseguenza, può essere applicato a tessuti con un midollo osseo anatomico simile a quello del polmone, tra cui la ghiandola tiroidea, il colon e la prostata. (vedi Extended Data Figure in Hartmann et al.59). Sebbene inizialmente sviluppato per l'analisi della meccanica BM, questo protocollo e il CANTER Processing Toolbox56 sono abbastanza versatili da esaminare qualsiasi regione meccanicamente distinta e connessa all'interno delle mappe di forza AFM (fare riferimento alle istruzioni in www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki). Questa ampia applicabilità rende questo strumento prezioso in tutto il campo AFM e supporta la crescente attenzione alla meccanobiologia nella più ampia comunità scientifica.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H., e H.C.-S. riconoscere il finanziamento da parte del Ministero della Scienza e delle Arti dello Stato bavarese attraverso il Bavarian Research Focus Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben (CANTER) e il Bavarian Academic Forum (BayWISS)-Doctoral Consortium Health Research. Lo sviluppo del software di analisi dei dati CANTER Processing Toolbox è stato finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca nell'ambito del sottoprogetto 1 (CL 409/4-1/2) del consorzio di ricerca Exploring articular carilage and subchondral bone degeneration and regeneration in osteoarthritis - ExCarBon (FOR2407-1/2). B.H. e H.C.-S. riconoscere il finanziamento da parte della Fondazione tedesca per la ricerca attraverso l'importante campagna di strumentazione GGA-HAW (INST 99/38-1). Questo lavoro è stato ulteriormente sostenuto dalla Danish Cancer Society (R204-A12454 (R.R.)) e dalla Fondazione tedesca per la ricerca (539446614 a R.R.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mLB Braun9166017VSiringa Injekt-F
da 10 mLB Braun4606108VInjekt Luer Solo
15 mL Provetta FalconSarstedt62.554.002provetta con tappo a vite
Cantilever - MLCTBruker AFM Probes3444AFM cantilever con forma di punta piramidale
Lame per criotomoLeica Biosystems14035843496Lame monouso a basso profilo DB80LX
Portacampioni per criotomoLeica Biosystems14047740044Disco per campioni 30
CyotomeLeica BiosystemsCM1950Leica Cryostat
Direct Overlay Extension BrukerSoftware Estensione per il software JPK SPM che consente di importare l'immagine ottica del microscopio invertito nel visualizzatore di dati del software SPM.
Stampo di base monousoServizi scientificiSA62534-15Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm
Nastro biadesivotesa Film56661-00002Nastro per pellicola fotografica
Supporto a sbalzo a molla fissa Bruker
Microscopio invertito - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK Motorized StageBruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM SoftwareBruker
K5 CMOS Microscopio KameraLeica Microsystems
MATLABMathworksVersione R2024a o superiore
MATLAB - Curve Fitting Toolbox Mathworks
MATLAB - Toolbox per l'elaborazione delle immaginiMathworks
MATLAB - Toolbox per l'elaborazione dei segnali Mathworks
MATLAB - Cassetta degli attrezzi per la statistica e l'apprendimento automaticoMathworks
Vetrini per microscopioCarl RothH869.1Vetrini per microscopio semplici per calibrazione a sbalzo
Vetrini per microscopio - bordo smerigliatoCarl RothH870.1Vetrini per microscopio con bordo smerigliato per criosezione
Ago ø 0,9 mm & volte; 25 mmB Braun4657500OCT iniezione  nel campione polmonare
Ago ø 0,9 mm & volte; 70 mmB Braun4665791Ago lungo per applicare PBS sotto il
composto AFM OCTSakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. Composto
fosfato tamponato soluzione salinaBio& VendiPBS BS.L1825senza Ca2+, Mg2+, 500 mL
QI Advanced Imaging Extension BrukerSoftware Estensione per il software JPK SPM che fornisce per ogni pixel dell'immagine registrata l'intera curva di forza sottostante.
ScalpelB Braun5518083Forbici da bisturi monouso chirurgiche
Kaut-BullingerM681700Forbici precise 13 cm 
Nastro monoadesivotesa Film57330-00000nastro trasparente, 33 m x 19 mm
Scatola per vetriniGWL Sistemi di conservazioneK50WScatola per diapositive per 50 vetrini
Stereomicroscopio - Stemi DR1663Pinzette Zeiss
- Vomm SS-SA-ESDEleshopELE002121
la soluzione

Riferimenti

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