Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Summary

Questo studio presenta una metodologia economica ed efficiente per generare strutture cellulari 3D utilizzando un sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Il sistema promuove la formazione di sferoidi/organoidi uniformi, migliorando così le interazioni cellulari. Questo approccio riduce la variabilità sperimentale e supporta le applicazioni nei test sui farmaci e nell'ingegneria tissutale.

Abstract

Le colture cellulari tridimensionali (3D) forniscono una rappresentazione più accurata del microambiente in vivo rispetto alle colture bidimensionali convenzionali (2D), poiché promuovono interazioni migliorate tra le cellule e la matrice extracellulare. Questo studio mirava a sviluppare una metodologia efficiente, economica e riproducibile per generare strutture cellulari 3D (sferoidi/organoidi) utilizzando un innovativo sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Un nuovo timbro è stato utilizzato per produrre 663 micropozzetti per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, fornendo un ambiente ideale per l'aggregazione cellulare. Le cellule primarie delle isole pancreatiche suine sono state seminate in questi micropozzetti, dove si sono aggregate per formare sferoidi/organoidi. Le colture sono state incubate a 37 °C sotto il 5% di CO₂ e il terreno è stato sostituito ogni 3 giorni. La formazione di sferoidi è stata periodicamente monitorata e sono stati raccolti campioni per la caratterizzazione. Il metodo ha generato con successo sferoidi uniformi e di alta qualità, riducendo la variabilità sperimentale, minimizzando la manipolazione e migliorando le interazioni cellulari. L'uso di stampi per micropattern a base di agarosio ha fornito un ambiente semplificato e controllato per le colture 3D, offrendo una soluzione standardizzata ed economica. Questa metodologia supporta le applicazioni per i test farmacologici e l'ingegneria tissutale, offrendo una piattaforma pratica e scalabile per modelli di colture cellulari 3D che possono essere facilmente implementati in vari contesti di laboratorio.

Introduction

Negli ultimi 50 anni, numerose indagini di biologia cellulare hanno dimostrato che le colture bidimensionali (2D) non riescono a replicare accuratamente le condizioni in vivo osservate nei modelli animali¹. Strutturalmente, le colture cellulari 2D non consentono alle cellule di organizzarsi tridimensionalmente e replicare la situazione osservata nei sistemi in vivo . Inoltre, le vie di segnalazione cellulare sono alterate nelle colture 2D rispetto alle colture tridimensionali (3D), il che potrebbe probabilmente spiegare perché alcuni tipi di screening farmacologico utilizzando colture 2D sono così discrepanti². Con l'introduzione dei sistemi di coltura 3D è emerso un progresso significativo nelle tecniche di coltura cellulare. I sistemi 3D variano considerevolmente in complessità a seconda della composizione cellulare e della citoarchitettura. Generalmente, vengono generati due tipi di strutture, ovvero: sferoidi e organoidi. Gli sferoidi sono descritti come semplici gruppi di cellule ottenute da tessuti normali o tumorali, corpi embrioidi e linee cellulari. La formazione di strutture 3D è influenzata da vari fattori, tra cui le interazioni cellula-cellula e le vie di segnalazione mediate dai componenti della matrice extracellulare (ECM), che forniscono supporto strutturale e segnali biochimici. Questi elementi regolano le interazioni che contribuiscono all'organizzazione e alla funzione dei tessuti³. Il sistema di coltura sferoidale è stato descritto per la prima volta nei primi anni '70, utilizzando linee cellulari di polmone di criceto cinese V79 come modello di carcinomi nodulari, che crescono in condizioni non aderenti e formano sfere perfette⁴. Gli organoidi sono descritti come gruppi di tipi di cellule organo-specifiche derivate da cellule staminali o progenitrici, che si auto-organizzano attraverso processi, come lo smistamento cellulare e la specificazione del lignaggio, in modo spazialmente confinato, rispecchiando lo sviluppo in vivo ⁵.

Diversi metodi e materiali disponibili sono disponibili per la coltura di cellule in condizioni 3D. I principali metodi attualmente impiegati per generare colture 3D sono: 1) gocce sospese; 2) colture cellulari rotanti e plastiche a basso attaccamento; 3) piastre piramidali contenenti pozzetti conici; 4) scaffold macroporosi; 5) perline magnetiche; e 6) idrogel senza scaffold.

Le gocce sospese sono il metodo utilizzato per ottenere colture 3D prive di impalcature. Questo metodo presenta alcune limitazioni, tra cui la necessità di una manipolazione estesa, una bassa efficienza produttiva, una geometria sferica e l'esposizione a elevate forze di taglio. Inoltre, procedure specifiche, come la sostituzione del mezzo o l'aggiunta di composti, possono essere impegnative e possono causare perdite di materiale. Inoltre, i rapporti della letteratura indicano che alcune linee cellulari non riescono a produrre sferoidi strettamente impacchettati quando impiegano questo approccio⁶.

La coltura cellulare rotante e le plastiche a basso attaccamento vengono utilizzate per evitare che le cellule si attacchino al substrato, provocandone l'aggregazione e la formazione di sferoidi. Questo processo richiede matracci specifici e/o agitazione/rotazione. Sebbene questo sia uno degli approcci più semplici per la produzione di sferoidi o organoidi su larga scala, non è privo di inconvenienti, come la necessità di attrezzature specifiche, la bassa longevità della coltura, la variazione delle dimensioni degli sferoidi, i danni meccanici alle cellule e la bassa efficienza⁶.

Le piastre piramidali contenenti pozzetti conici sono piastre disponibili in commercio che incidono sui costi, oltre al fatto che alcune manipolazioni possono ostacolare la formazione di sferoidi/organoidi⁷.

Gli scaffold macroporosi sono impiegati anche per la coltura 3D; Tuttavia, un grosso ostacolo risiede nel raggiungimento di un'efficace semina cellulare e di una distribuzione uniforme. Questo problema si verifica perché le dimensioni dei pori possono essere troppo piccole per la penetrazione cellulare o troppo grandi per trattenere saldamente le cellule. Per affrontare questo problema, sono state esplorate diverse strategie⁸, che hanno un impatto diretto sulla complessità e sul costo di questa tecnica.

La metodologia delle biglie magnetiche genera un piccolo numero di sferoidi/organoidi, ha un costo elevato e può lasciare residui di nanoparticelle all'interno delle cellule⁹.

Tra i sistemi per la coltivazione di sferoidi, sono disponibili idrogel di agarosio non adesivi, che rappresentano un idrogel privo di scaffold. Questo approccio offre notevoli vantaggi, come il controllo preciso sulle dimensioni delle strutture 3D e la capacità di generare un numero considerevole di queste strutture per piastra. In questo metodo, le cellule vengono introdotte in un idrogel con pozzetti preformati, in cui affondano e si autoassemblano in sferoidi 3D¹⁰.

In questo studio, presentiamo un dispositivo e una metodologia per generare micropozzetti di agarosio utilizzando uno stampo per micropattern in modo semplice, efficiente, riproducibile e a basso costo.

L'uso di questo timbro come stampo per generare micropozzetti in agarosio, aiutato dalla gravità, mira a migliorare l'interazione cellulare all'interno del micropozzetto e l'organizzazione cellulare, generando strutture 3D (sferoidi/organoidi) in vitro in modo semplice, efficiente, riproducibile e a basso costo, risparmiando così tempo di ricerca e risorse di laboratorio.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida del Comitato Etico per la Ricerca Umana della nostra Istituzione CEUA-FMUSP: 1699/2021, approvate l'8 settembre 2021 -"Isolamento e incapsulamento delle isole pancreatiche suine" e fa parte del Progetto Tematico del nostro Gruppo NUCEL (www.usp.br/nucel), FAPESP Grant n. 2016/05311-2, dal titolo: "Medicina rigenerativa finalizzata alla terapia delle malattie cronico-degenerative (cancro e diabete)".

1. Fabbricazione del dispositivo di timbro

NOTA: Questo francobollo è realizzato su misura dal gruppo NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Il dispositivo per timbri è stato sviluppato utilizzando il software di riferimento, ampiamente riconosciuto per la sua precisione e le avanzate capacità di modellazione tridimensionale.

1. Assicurarsi che i prototipi progettati siano dotati di 663 micropin disposti per consentire la generazione di un numero equivalente di colture tridimensionali, come sferoidi o organoidi. Per garantire la stabilità del timbro sulle superfici del vassoio T6, posizionare cinque punti di supporto strategicamente lungo la circonferenza del dispositivo.
2. Assicurarsi che i micropin abbiano un design conico con dimensioni regolabili, che vanno da 1 a 3 mm di lunghezza. Il diametro della base del cono varia tra 0,7 e 1,5 mm, mentre l'angolo di conicità varia da 5° a 10°.
3. Assicurarsi che la struttura "stop" del dispositivo, che definisce la profondità dei micropin, abbia una lunghezza regolabile da 10 a 19 mm e un diametro da 20 a 40 mm, con micropin distribuiti uniformemente sulla sua superficie.
4. Inoltre, progetta il dispositivo in modo che abbia un'impugnatura ergonomica, adatta per l'utilizzo con una sola mano, per migliorare la praticità e la precisione durante l'uso.
   NOTA: Per facilitare la produzione su larga scala del dispositivo, viene fornito il file digitale in formato .stl, essenziale per il processo di stampa 3D.
5. Basta affettarlo utilizzando un software appropriato e stamparlo con una stampante 3D compatibile. Utilizzare le seguenti dimensioni di stampa: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, garantendo un equilibrio ideale tra funzionalità e qualità strutturale.
6. Per la fabbricazione del dispositivo, utilizzare una stampante 3D fotopolimerizzabile, compatibile con la resina polimerica polimerizzabile UV che deve avere un'alta risoluzione e una finitura superficiale uniforme, caratteristiche essenziali per le prestazioni ottimali del dispositivo.
7. Taglia il modello digitale per la stampa utilizzando un software compatibile con la stampante 3D selezionata.

2. Preparazione di micropozzetti di agarosio

1. Preparare la soluzione di agarosio.
   1. Pesare la polvere di agarosio puro e scioglierla in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere una concentrazione finale dell'1-2% (p/v).
   2. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde o a bagnomaria fino a completa dissoluzione, assicurandosi che sia omogenea e trasparente.
      NOTA: Evitare il surriscaldamento o il riscaldamento eccessivo, in quanto ciò può degradare l'agarosio. Non preparare grandi volumi di soluzione madre.
   3. Lasciare raffreddare la soluzione a ~40 °C, la temperatura ideale per il pipettaggio.
2. Prepara il timbro su misura.
   1. Lavare il timbro con una spugna a setole morbide e acqua distillata per rimuovere i residui.
   2. Esporre il timbro pulito alla luce UV per 5-10 minuti per garantire la sterilità.
3. Formare i micropozzetti.
   1. Versare/pipettare ~3 mL della soluzione di agarosio a 40 °C in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, garantendo una profondità uniforme di 2-3 mm.
   2. Posizionare il timbro su misura al centro del pozzetto mentre l'agarosio è ancora caldo.
      NOTA: Il timbro è dotato di supporti laterali che garantiscono l'allineamento e la stabilità, eliminando la necessità di un supporto manuale. Ogni timbro crea ~663 micropozzetti (~2 mm di altezza) per pozzetto. Assicurarsi che non ci siano bolle sui micropin; Se si formano delle bolle, muovere delicatamente il timbro per eliminarle.
   3. Lasciare solidificare l'agarosio per 5-10 minuti a temperatura ambiente senza muovere la piastra.
      NOTA: Non disturbare l'agarosio durante la solidificazione per evitare variazioni nella struttura del micropozzetto.
   4. Rimuovere il timbro con delicati movimenti avanti e indietro per rilasciare il vuoto senza danneggiare i micropozzetti.
      NOTA: Questo movimento facilita l'ingresso dell'aria, consentendo una rimozione fluida del timbro senza deformare il gel. I micropozzetti devono rimanere intatti.
   5. Lavare i micropozzetti 3 volte con una soluzione PBS per rimuovere i residui.
   6. Esporre la piastra alla luce UV per 10 minuti per eliminare la contaminazione microbica.
   7. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura e incubare la piastra in un incubatore di CO₂ a 37 °C per una notte.
      NOTA: Questa incubazione verifica l'assenza di contaminazione prima della semina cellulare.

3. Semina cellulare in micropozzetti

1. Preparare la sospensione cellulare.
   1. Raccogliere le cellule tramite tripsinizzazione o un altro metodo di dissociazione per ottenere una sospensione omogenea.
   2. Contare le cellule e regolare la concentrazione in base al numero desiderato per micropozzetto.
      NOTA: Per seminare 5.000 cellule per micropozzetto in 663 micropozzetti, preparare una sospensione contenente almeno 3,315 × 10⁶ celle totali. Ottimizzare la concentrazione cellulare per prevenire la necrosi centrale e garantire un'adeguata diffusione di nutrienti e ossigeno.
2. Semina le cellule.
   1. Pipettare ~3 mL della sospensione cellulare preparata sui micropozzetti, garantendo una distribuzione uniforme facendo roteare delicatamente la piastra.
   2. Lasciare che le cellule si depositino per gravità (~10-15 min) o eseguire una centrifugazione delicata a 100 × g per 5 min.
      NOTA: La centrifugazione può essere utilizzata per garantire che le cellule si concentrino nei micropozzetti.
   3. Trasferire la piastra in un incubatore a CO₂ a 37 °C in atmosfera umidificata.

4. Manutenzione di colture cellulari 3D

1. Sostituire il terreno di coltura.
   1. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni, rimuovendo il 50% del vecchio terreno e aggiungendo un terreno fresco.
      NOTA: Assicurarsi che i micropozzetti rimangano immersi per tutto il periodo di coltura per evitare la disidratazione.
2. Monitora la formazione di colture 3D.
   1. Continuare la coltura fino a quando le strutture 3D non sono completamente formate e compatte (ad esempio, 2-3 giorni per le colture primarie di isole pancreatiche).
      NOTA: Per le colture che richiedono un tempo di formazione più lungo, eseguire cambi parziali del terreno ogni 2-3 giorni.

5. Raccolta e caratterizzazione di strutture 3D

1. Raccogli gli sferoidi/organoidi.
   1. Rimuovete il vecchio terreno e raccogliete le strutture 3D mediante un pipettaggio vigoroso utilizzando un puntale per pipette di ampio diametro o tagliato per evitare la compressione o la disgregazione.
      NOTA: Il pipettaggio vigoroso deve essere controllato per rimuovere gli aggregati senza deformarli.
2. Preparati per l'analisi.
   1. Utilizzare immediatamente gli sferoidi/organoidi raccolti o correggerli per analisi future.
      NOTA: L'associazione e la stabilità degli sferoidi dipendono dal tipo di cellula, dal tempo di formazione e dalle condizioni di coltura. Fare attenzione è essenziale per evitare la dissociazione.

Results

La coltura cellulare utilizzata in questo studio è stata derivata da isole pancreatiche suine. La preparazione delle isole utilizzate in questo studio aveva una purezza dell'80 ± del 5% basata sulla colorazione con ditizone e dell'>80% sulla vitalità delle cellule insulari basata sulla rilevazione del diacetato di fluoresceina nelle cellule vive o dello ioduro di propidio nelle cellule morte (il metodo fluorescente vivo/morto). Assicurarsi che il preparato delle isole pancreatiche suine sia puro almeno all'80% (ad es....

Discussion

Sebbene esistano vari protocolli di coltura 3D in letteratura, uno studio condotto da Wassmer et ^al.13 ha testato diverse metodologie per generare strutture 3D utilizzando isole pancreatiche. Gli autori hanno osservato che gli isolotti nativi e gli sferoidi autoaggregati mostravano una notevole eterogeneità rispetto alle dimensioni e alla forma ed erano più grandi di quelli ottenuti con altri metodi. Sulla base delle loro scoperte, hanno concluso che gli sferoidi ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
31L Microonde	Electrolux	78965840 6699 9	Apparecchiatura utilizzata per riscaldare la soluzione di agarosio, facilitandone la dissoluzione e garantendo una maggiore omogeneità. Permette alla soluzione di raggiungere lo stato liquido ideale per la formazione dei pozzi.
3DFila Stampante			polimerica polimerica UV
grigia - Creality Halot Una	Creality	N/A	utilizzata per la stampa del dispositivo di timbro
Agarosio	UNISCIENCE	UNI-R10111	Per formare il gel, sciogliere dall'1 al 2% in tampone fosfato salino (PBS) o in un mezzo appropriato.
Autodesk Fusion 360			Modellazione 3D
BB15 CO2 Incubatore	Thermo Fisher	51023121	Apparecchiatura utilizzata per incubare cellule coltivate in un ambiente idoneo e controllato.
Chitubox	Chitubox	N/A	Software utilizzato per l'affettatura della parte per la stampa
Cabina di sicurezza biologica di Classe II	Grupo VECO	N/A	Garantisce un ambiente sterile per l'esecuzione della coltura cellulare entro parametri e protocolli stabiliti.
Terreno di coltura	USBiological/Life Sciences	C5900-03A	Contiene additivi per una corretta coltivazione cellulare.
Piastre di coltura (P6)	SARSTEDT	1023221	Utilizzato per modellare l'agarosio e coltivare le cellule.
Erlenmeyer Flask (25 mL)	Laborglas	91 216 14	Un contenitore utilizzato per sciogliere 1– 2% di agarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o in un altro mezzo adatto, tipicamente riscaldato in un forno a microonde.
Falcon 15 mL Polistirene Centrifuga Tubo	Corning	352099	Utilizzato per mantenere le cellule in sospensione ed eseguire eventuali diluizioni.
Siero fetale bovino (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Additivo per terreno di coltura.
Soluzione PBS (Saline Phosphate Buffer)	Lab made	N/A	diluita 1x con acqua ultrapura MiliQ. Utilizzato per sciogliere l'agarosio dall'1 al 2% e per lavare pozzetti già prodotti.
Flacone reagente con tappo blu - Schott	Laborglas	21801545	Utilizzato per la preparazione e la conservazione del terreno di coltura.
Dispositivo di timbro	NUCEL Group	N/A	Link- Questo collegamento fornisce l'accesso al file .stl del dispositivo di timbro. Basta affettarlo utilizzando un software appropriato e stamparlo con una stampante 3D compatibile. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=condivisione
Pallone di coltura trattato con filtro 25 cm²	Corning	430639	Utilizzato per la coltivazione e il mantenimento delle cellule aderenti.
Tripsina	Merck	07-07-9002	Per la dissociazione delle cellule prima della semina.
Luce ultravioletta (UV)	N/A	N/A Utilizzato	per sterilizzare il timbro e le lastre.